一个 体外 藏药红景天颗粒多指标成分溶出度测定

摘要

在此，我们测试红景天颗粒（RG）的溶出度 体外，绘制红景天苷、没食子酸和没食子酸乙酯在超纯水中的溶出曲线，并将曲线拟合至不同的数学模型。本方案为 体内 生物等效性与 体内-体外 RG相关性研究

摘要

藏药红景天颗粒（RG）成分复杂，其整体质量难以评估。因此，建立一种多组分测定方法以评价RG的整体质量具有重要意义 体外 RG的溶出对质量控制具有重要意义。本研究采用《中华人民共和国药典》（2020年版）通则0931的第二法桨法，符合美国药典（USP）装置2的规定。溶出装置转速设定为100 rpm，溶出介质为超纯水。每个时间点取样1 mL。进一步采用高效液相色谱法（HPLC）测定RG中没食子酸、红景天苷和没食子酸乙酯在不同时间点的累积溶出量。最后绘制溶出曲线，并将曲线拟合至GompertzMod、Gompertz、Logistic和Weibull方程。结果表明，RG中没食子酸的累积溶出量在1分钟时已超过80%，红景天苷和没食子酸乙酯在5分钟时累积溶出量均超过65%，各指标成分在30分钟后累积溶出量下降。曲线拟合结果显示，GompertzMod方程对RG各指标成分的拟合效果最优。综上所述，本方案所述溶出度测定方法简便、准确、可靠，可有效表征RG中指标成分的溶出行为 体外，为瑞香素的质量控制及其他民族药用化合物的质量评价提供了方法学参考。

引言

在中国，心血管疾病的患病率持续上升，心血管疾病的发病率和死亡率在中国居民中位居首位¹。冠心病心绞痛是由于冠状动脉粥样硬化导致管腔狭窄，从而引起冠状动脉血供相对不足，造成心肌缺血缺氧²。近年来，中医药治疗冠心病的疗效已得到众多医生的认可³。

传统中医药在缓解临床症状和改善患者生活质量方面发挥着重要作用⁴红景天颗粒（RG）是从青藏高原药用植物中提取并精制而成 Rhodiola rosea L. RG 的主要成分是红景天苷、红景天素和黄酮类化合物^5,6. 人参具有补气的作用⁷ 并具有活血化瘀、行气止痛的功效。临床用于治疗气虚血瘀所致的胸痹，冠心病、心绞痛⁸仅通过含量测定无法全面反映药物的内在质量，因为崩解和溶出行为同样重要。 体外 可能影响药物的生物利用度和疗效^9,10中药溶出度的检查方法包括转篮法、桨法和小杯法。转篮法的缺点是在旋转过程中只有转篮的外侧与溶出介质接触，不能真实反映药物的实际溶出行为。桨法能够克服上述不足，因此对于某些中药固体制剂而言，比转篮法更为适用。¹¹目前尚未有关于 体外 RG的溶出度分析。为了更全面地控制RG的质量，本研究考察了RG中三种指标成分（没食子酸、红景天苷和没食子酸乙酯）的溶出行为。该研究为RG的质量控制提供了数据支持，并为其他民族复方制剂的质量评价提供了方法学参考。

方案

1. 溶液配制

1. 制备对照品储备液：分别用电子分析天平称取红景天苷 10.6 mg、没食子酸 5.24 mg 和没食子酸乙酯 5.21 mg，各自转移至 5 mL 容量瓶中。然后加入高效液相色谱级甲醇溶解，并定容至 5 mL。最后充分振摇，得到质量浓度分别为 2.120 mg/mL、1.048 mg/mL 和 1.042 mg/mL 的对照品储备液。
   注：该对照品储备液含有 2.120 mg/mL 红景天苷、1.048 mg/mL 没食子酸和 1.042 mg/mL 没食子酸乙酯，作为后续标准曲线中各溶液的储备液。
2. 制备供试品溶液。取 2.8 g 红景天（材料表），加入 10 mL 高效液相色谱级甲醇，使用超声清洗仪（功率：200 W，频率：40 kHz）超声提取 30 分钟，然后用 0.22 µm 滤膜过滤，用于系统适用性试验。
3. 制备混合对照品溶液，其中含红景天苷 0.590 mg/mL、没食子酸 2.030 mg/mL 和没食子酸乙酯 1.930 mg/mL。
   注：分别称取红景天苷 2.950 mg、没食子酸 10.150 mg 和没食子酸乙酯 9.650 mg，用高效液相色谱级甲醇作为溶剂，在 5 mL 容量瓶中溶解并定容。
4. 测定红景天经超纯水提取后各特征成分的理论含量。
   1. 取 2.8 g 红景天置于 500 mL 锥形瓶中，加入 200 mL 超纯水，超声提取（功率：200 W，频率：40 kHz）60 分钟，然后用 0.22 µm 滤膜过滤。
   2. 根据后续实验所得线性方程测定供试品溶液中各成分的含量。

2. 色谱条件

1. 按照表1所示条件设置高效液相色谱的色谱参数。有关所用仪器的详细信息，请参见材料表。

3. 系统适应性测试

1. 考察线性关系。
   1. 将没食子酸和乙基没食子酸的标准储备溶液分别稀释5、10、25、50和125倍，将红景天苷的标准储备溶液分别稀释2、4、8、16和32倍，以获得用于绘制标准曲线的梯度浓度溶液。
      注意：根据样品处理的预实验结果调整标准曲线的稀释比例。在预实验中，三种标准品的储备液最初均被稀释5、10、25、50和125倍，并据此绘制第一条标准曲线。然而，在检测待测样品浓度时发现，红景天苷的浓度未落在该标准曲线的线性范围内，因此调整了其稀释浓度以纳入曲线范围。综上，上述预实验用于确定后续实验中三种待测样品的最终稀释浓度。
2. 精密度测试：每日将10 µL混合对照品溶液注入高效液相色谱（HPLC）系统共六次，并按照步骤2.1所述相同的HPLC条件运行样品，记录各特征组分的峰面积。
3. 稳定性测试实验：分别在0 h、6 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h和24 h时，取10 µL已制备的样品溶液，按照色谱条件进样，测定HPLC峰面积。
   注意：峰面积由HPLC系统自动记录。
4. 重现性测试：取同一批次的红景天（RG）样品六份，按照步骤1.2的方法制备供试品溶液。每份取10 µL注入HPLC系统，按步骤2.1所述条件运行样品，测定重现性。
   注意：通过比较六份样品之间各组分浓度的差异来评价重复性。
5. 回收率实验
   1. 取同一批次的红景天（RG）样品六份制备供试品溶液。然后，在每份供试品溶液中加入各指标成分约50%量的对照品，用于计算回收率。将这些样品按照步骤2.1所述相同条件在HPLC系统中进行分析。
   2. 计算回收率。
      ​注意：回收率 = (C - A) / B × 100%，其中A为供试品溶液中待测组分的含量，B为加入的对照品量，C为加入对照品后样品溶液的测定总量。上述操作（即步骤3.1–3.5）的色谱条件参见步骤2.1。

4. 体外 溶出度试验

1. 按照《中华人民共和国药典》（2020年版）通则0931第二法的桨法进行溶出度试验¹²。
   注：取样技术与设备：药物溶出仪（材料表）包含溶出杯、桨叶、温度控制系统和转速调节系统。在开始溶出实验前，先将水预热至设定温度，然后设定相应的转速。加入RG后立即开始计时。
2. 向药物溶出仪的溶出杯中加入100 mL超纯水，并将温度维持在37 °C ± 0.5 °C，设定转速为100 rpm。
   注：溶出仪配有可在系统内设定温度的加热装置。红景天苷在水、人工胃液（取稀盐酸16.4 mL [由浓盐酸234 mL加水稀释至1000 mL]，加水约800 mL，加入胃蛋白酶10 g，充分振摇，再加水稀释至1000 mL）和人工肠液（含胰酶的磷酸盐缓冲液[pH 6.8]）中的溶出速率无显著差异¹³。因此选择最易获得的水（超纯水）作为溶出介质。
3. 将2.8 g RG加入溶出杯中，并立即开始记录溶出持续时间。在1 min、5 min、10 min、20 min、30 min和60 min时，使用注射器（见材料表）分别采集1 mL样品，并立即用同温的溶出介质补足溶出杯中的体积。
   注：溶出杯中的取样管无法采集小体积样品，因此使用注射器进行取样。必须快速完成取样，以避免错过规定的取样时间点。
4. 将采集的样品立即通过0.22 µm微孔滤膜过滤，取后续滤液。采用HPLC法（按步骤2.1）测定各时间点各组分的含量，并计算累积溶出度。
   1. 为计算累积溶出度，先计算每个时间点的溶出量（X_n）：
      X_n = A / B × 100，其中A为各时间点测得的组分含量，B为各组分的理论含量。
   2. 然后计算累积溶出度（Y）：
      Y = X_n + (X₁ + ... + X_n-1) × V₂ / V₁，其中V₁为溶出介质的总体积，V₂为每次取样后补加的溶出介质体积。
      ​注：由于色谱图中红景天苷和没食子酸的响应值较低，因此在溶出曲线中未绘制1 min时间点红景天苷和没食子酸乙酯的累积溶出度。

5. 拟合溶出模型

1. 将各时间点的累积溶出数据导入数据分析软件。
2. 使用数据分析软件中的药物溶出分析插件，拟合GompertzMod方程、Gompertz方程、Logistic方程和Weibull方程¹⁴。R²值越大，表示曲线拟合效果越好。
   1. 启动软件，选择Book1 窗口进入Origin数据编辑界面。
   2. 在第一列A(X)-Long Name中输入时间，将时间定义为时间变量，并输入每次溶出测定的时间点；在第二列B(Y)-Long Name中输入数据，将数据定义为累积溶出量，输入各时间点对应的累积溶出百分比。
   3. 完成数据输入后，选中A(X)和B(Y)两列，点击软件菜单栏中的药物溶出分析插件，选择拟合溶出数据 > 串联拟合 > 确定，软件将生成各模型的拟合结果。

结果

本研究中，红景天苷（RG）的精密度、稳定性、重复性及样品回收率均在《中华人民共和国药典》（2020年版，第四部）¹²规定的方法学范围内，表明该方法可行。经过多次调试，确定本研究所采用的洗脱梯度对RG中的三种指标成分具有良好的分离度（图1）。RG中的三种指标成分在特定浓度范围内均呈现良好的线性关系（表2）。精密度试验结果（表3）显示，红景天苷、没食子酸和没食子酸乙酯峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为1.95%、2.83%和1.42%，表明仪器精密度良好。稳定性试验结果（表4）显示，红景天苷、没食子酸和没食子酸乙酯峰面积的RSD分别为2.37%、2.47%和2.82%，说明样品溶液在24小时内稳定。重复性试验结果（表5）显示，红景天苷、没食子酸和没食子酸乙酯峰面积的RSD分别为2.79%、2.67%和1.55%，表明该方法重复性良好。加样回收率实验结果表明，红景天苷、没食子酸和没食子酸乙酯的平均回收...

讨论

溶出度试验是一种理想的方法 体外 模拟口服固体制剂在胃肠道中崩解和溶出的方法¹⁵它是评价和控制口服固体制剂质量的重要指标。因此，溶出度试验在口服固体制剂的研发过程中起着至关重要的作用。¹⁶特别是随着中药质量控制技术的发展，溶出度测定已逐渐应用于中药及民族药复方制剂的筛选研究中^17,18.

目前，中药及民族药溶出度的测定 体外 主要基于检测单一指标成分。然而，中药及民族药的固体制剂成分复杂，其溶出过程受多种因素（如温度、溶出介质等）及复杂的化学成分影响^19,20因此，多指标成分的检测能更好地反映不同成分之间的相互影响及溶出差异。本文中 体外 测定了RG中三种指标成分（没食子酸、红景天苷和没食子酸乙酯）的溶...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
色谱柱	ZORBAX Eclipse	XDB-C18	4.6 mm × 250 mm，5 µm
药物溶出度测试仪	上海黄海制药检测仪器有限公司	RCZ-6B3
电子分析天平	上海良平仪器有限公司	FA1004
没食子酸乙酯（HPLC， ≥98%)	成都德斯特生物科技有限公司	DSTDM006301
函数绘图软件	OriginLab Corporation，马萨诸塞州北安普顿，美国	2022
没食子酸（HPLC， ≥98%)	成都德斯特生物科技有限公司	DSTDM000802
高效液相色谱	安捷伦科技新加坡（国际）有限公司	安捷伦 1260 Infinity <图像 替代文本="公式 1" src="/files/ftp_upload/64670/64670eq01.jpg" 样式="margin: auto;"/>
色谱纯甲醇	赛默飞世尔科技（中国）有限公司	216565
注射器	成都新津施丰医疗器械 &安普&仪器有限公司	0.7（22 G）
密理博滤膜	天津金腾实验设备有限公司	φ13 0.22 尼龙66
红景天颗粒	西藏诺迪康药业有限公司	210501
红景天苷（HPLC， ≥98%)	成都德斯生物技术有限公司	DST200425-037
超纯水系统	默克密理博有限公司	Milli-Q
超声波清洗机	宁波新艺超声波设备有限公司	SB-8200 DTS