藏药红景天颗粒中多指标组分的 体外 溶出度测定

摘要

在这里，我们在 体外测试了红景天颗粒（RG）的溶解度，绘制了红景天苷，没食子酸和没食子酸乙酯在超纯水中的溶解曲线，并将曲线拟合到不同的数学模型中。该协议为RG的 体内 生物等效性和体内外体 外 相关性研究提供了信息和指导。

摘要

藏药红景天颗粒（RG）成分复杂，RG的整体质量难以确定。因此，建立一种测定RG多组分 体外 溶出度的方法对质量控制具有重要意义。本研究采用中国药典（2020年版）第四通则0931的第二桨法，符合美国药典（USP）的器具2。将溶解装置设置为100 rpm的转速，以超纯水为溶解介质。在每个时间点收集1 mL的样品体积。采用高效液相色谱法测定没食子酸、红景天苷和没食子酸乙酯在不同时间点的累积溶出量。最后，绘制了溶解曲线，并将曲线拟合到GompertzMod，Gompertz，Logistic和Weibull方程。结果表明:没食子酸在RG中的累积溶出度在1 min时大于80%，红景天苷和没食子酸乙基在5 min时的累积溶出度超过65%，30 min后各指标组分的累积溶出度下降。曲线拟合表明，GompertzMod方程是RG每个指数分量的最佳拟合模型。总之，本协议中描述的溶出度测试方法简单，准确且可靠。它可以表征RG中指标组分的体 外溶出行为，为RG的质量控制和其他民族化合物的质量评价提供方法学参考。

引言

在中国，心血管疾病患病率持续上升，心血管疾病发病率和死亡率居^{中国居民首位}1。冠心病的心绞痛是由冠状动脉粥样硬化引起的管腔狭窄引起的，导致冠状动脉血液供应相对不足和心肌缺血缺氧^2。近年来，中医药治疗冠心病的疗效得到了^{众多医生的}认可3。

中医药在缓解临床症状和提高患者生活质量方面发挥着重要作用⁴.红景天颗粒（RG）是从青藏高原药用植物红 景天L 中提取和精制的。RG的主要成分是红景天苷、红景天和类黄酮^5，6。RG具有补气⁷ ，活化和促进血液循环缓解疼痛的作用。临床上用于治疗气虚血瘀引起的胸梗阻、冠心病、心绞痛⁸.仅含量测定并不能完全反映药物的内在质量，因为 体外崩 解和溶出都会影响药物的生物利用度和功效^9，10。中药溶出的检验方法有旋转篮法、桨法、小杯法等。旋转篮法的缺点是旋转过程中只有旋转篮的外部与溶解介质接触，这并不能反映现实世界的溶解行为。桨法可以克服上述缺点，使其比篮子法更适合一些固体中药制剂¹¹。目前尚无RG体 外 溶出分析的报道。为了更全面地控制RG的质量，研究了RG中3种指标成分（没食子酸、红景天苷和没食子酸乙酯）的溶出行为。本研究为RG的质量控制提供了数据，为其他民族化合物制剂的质量评价提供了方法学参考。

方案

1. 溶液制备

1. 制备对照物质储备溶液:在电子分析天平上分别称取10.6 mg红景天苷、5.24 mg没食子酸和5.21 mg没食子酸乙酯，并将它们单独加入5 mL容量瓶中。然后，加入HPLC级甲醇溶解并稀释至5 mL。最后摇匀，得到质量浓度分别为2.120 mg/mL、1.048 mg/mL和1.042 mg/mL的对照品储备溶液。
   注意:对照物质储备溶液含有2.120 mg / mL红景天苷，1.048 mg / mL没食子酸和1.042mg / mL没食子酸乙酯作为随后标准曲线中每种溶液的储备溶液。
2. 准备测试样品溶液。使用超声波清洁机（功率:200 W，频率:40 kHz）提取 2.8 g RG（材料表）和 10 mL HPLC 级甲醇 30 分钟，然后用 0.22 μm 过滤器过滤以进行系统适应性测试。
3. 制备含有0.590 mg/mL红景天苷、2.030 mg/mL没食子酸和1.930 mg/mL没食子酸乙酯的混合参比溶液。
   注意:将每种标准品（2.950 mg红景天苷，10.150 mg没食子酸和9.650 mg乙基没食子酸）溶解在HPLC级甲醇中的5 mL容量瓶中作为溶解介质。
4. 获得RG各特征组分的理论含量，用于超纯水提取。
   1. 将 2.8 g RG 放入 500 mL 锥形烧瓶中，加入 200 mL 超纯水，超声提取（功率:200 W，频率:40 kHz）60 分钟。然后，用0.22μm过滤器过滤。
   2. 根据以下实验中获得的线性方程确定供试品溶液的含量。

2. 色谱条件

1. 如 表1 所示设置色谱条件，以进行高效液相色谱。有关所用仪器的详细信息，请参阅 材料表。

3. 系统适应性测试

1. 研究线性关系。
   1. 将没食子酸和没食子酸乙酯对照储备溶液稀释5倍、10倍、25倍、50倍、125倍，将红景天苷对照储备溶液稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍，即得绘制标准曲线的梯度浓缩溶液。
      注意:根据样品处理的初步实验调整标准曲线的稀释比例。在初步实验中，先稀释3种标准品的储备溶液5倍、10倍、25倍、50倍和125倍，然后绘制第一条标准曲线。然而，当检测到测试样品的浓度时，发现红景天苷的浓度不在该标准曲线的线性范围内，因此，调整浓度以将它们包含在曲线中。综上所述，利用上述初步实验确定三种测试样品的最终稀释浓度，用于后续实验研究。
2. 精密检测:将 10 μL 混合参比溶液注入 HPLC 系统，每日 6 次，并以步骤 2.1 中所述的相同 HPLC 条件运行样品。记录每个特征分量的峰面积。
3. 稳定性测试实验:分别在0 h、6 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h和24 h后，注入10 μL制备的样品溶液，并根据色谱条件测定HPLC的峰面积。
   注意:峰面积由HPLC系统自动记录。
4. 重现性测试:取同批RG的6个样品，按步骤1.2中的方法制备供试样品溶液。将每个样品 10 μL 注入 HPLC 系统。按照步骤2.1中所述运行样品并确定重现性。
   注意:通过比较六个样品之间的浓度差异来评估重复性。
5. 恢复实验
   1. 为测试溶液准备同一批次RG的六份。然后，在供试品溶液中加入各指标组分的对照品约50%，以计算回收率。在HPLC系统中以步骤2.1中所述的相同条件运行这些样品。
   2. 计算恢复率。
      注:回收率=（C-A）/B x 100，其中A为供试品溶液中待测组分的量，B为对照品的添加量，C为含有对照品和RG样品的溶液的测定值。有关执行上述步骤的色谱条件，请参阅步骤2.1（即步骤3.1-3.5）。

4. 体外 溶出度试验

1. 使用中国药典（2020年版）通则0931第二种方法的桨法进行溶出度试验¹²。
   注:取样技术和设备:药物溶出装置（材料表）具有溶出度杯，桨，温度控制系统和速度调节系统。在开始溶解实验之前，将水预热到设定的温度，然后设定相应的速度。添加RG后立即开始记录时间。
2. 向药物溶出装置的溶出杯中加入100mL超纯水，并保持温度在37°C±0.5°C。 将转速设置为 100 rpm。
   注意:溶解装置有一个加热装置，允许在系统内设置温度。红景天苷在水中的溶解速率无显著差异，人工胃液（16.4 mL稀盐酸[234 mL浓盐酸用水稀释至1000 mL]与约800 mL水和10 g胃蛋白酶，摇匀，用水稀释至1，000 mL）和人工肠液（含胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液[pH 6.8]）¹³。选择最容易获得的水（超纯水）作为溶解介质。
3. 将2.8gRG加入溶出杯中，并立即开始记录溶出持续时间。用进样器（参见 材料表）在 1 分钟、5 分钟、10 分钟、20 分钟、30 分钟和 60 分钟收集总共 1 mL 的样品，并立即在相同温度下用溶解介质补足溶出杯中的体积。
   注意:溶出杯中的采样管无法收集小体积的样品，因此使用进样器收集样品。必须快速采集样本，以免错过指定的采集时间点。
4. 立即通过0.22μm微孔膜过滤收集的样品，并取后续滤液。通过HPLC确定每个时间点每种组分的含量（按步骤2.1）并计算累积溶解度。
   1. 要计算累积溶出度，请计算每个时间点的溶出度（X_n）:
      X_n = A / B x 100，其中A是每个时间点测量的成分数量，B是每个组件的理论含量。
   2. 然后，计算累积溶解度（Y）:
      Y = X n + （X 1 + ... + X _n-1） x V 2 / V 1，其中V₁是溶出介质的总体积，V ₂是每次采样后加入的溶质体积。
      注意:由于色谱图中红景天苷和没食子酸的响应值较低，因此在溶出曲线中未绘制1分钟时间点红景天苷和没食子酸乙酯的累积溶出度。

5. 拟合溶出度模型

1. 将每个时间点的累积溶出度数据导入数据分析软件。
2. 使用数据分析软件中的药物溶出度分析插件拟合龚珀茨模组、龚珀茨方程、逻辑方程和威布尔方程¹⁴。 R² 的值越大，曲线拟合效果越好。
   1. 启动软件，选择 Book1 窗口进入 原始数据编辑 窗口。
   2. 在第一列 A（X）-Long Name 中输入时间，将时间定义为时间，并输入每个溶出度测定时间。在第二列B（Y）-Long Name中输入数据，将数据定义为累积溶出度，输入每个溶出度测定时间的累计溶出度百分比。
   3. 数据输入后，选择A（ X ）和 B（Y）列，然后在软件菜单栏中选择 药物溶出分析 插件，然后单击 拟合溶出度数据>连接拟合>确定"。该软件生成每个模型的拟合结果。

结果

本研究显示，RG的精密度、稳定性、重复性和样品回收率均在中国药典（2020年第4卷）¹²规定的方法学范围内，表明该方法是可行的。经过反复调试，确定本研究中使用的洗脱梯度对RG中的三种指标组分具有良好的分辨率（图1）。RG中的3种指标组分在特定浓度范围内具有良好的线性关系（表2）。精密度测试结果（表3）显示，红景天苷、没食子酸和没食子酸乙酯峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为1.95%、2.83%和1.42%，表明仪器精密度良好。稳定性测试结果（表4）显示，红景天苷、没食子酸和没食子酸乙酯峰面积的RSD分别为2.37%、2.47%和2.82%，表明样品溶液在24 h内稳定。重复性测试结果（表5）显示，红景天苷、没食子酸和没食子酸乙酯峰面积的RSD分别为2.79%、2.67%和1.55%，表明该方法的重复性良好。回收率实验结果表明，红景天苷、没食子酸和没食子酸乙酯的平均回收率分别为99.91%、100...

讨论

溶出度试验是模拟固体口服制剂在胃肠道¹⁵中崩解和溶出的理想体外方法。是评价和控制固体口服制剂质量的重要指标。因此，溶出度试验在固体药物口服制剂的开发中起着至关重要的作用¹⁶。特别是随着中药（TCM）质量控制技术的发展，溶出度测定已逐步应用于中药和民族药复方制剂的筛选研究^17，18。

目前，中医药和民族医药体 外 溶出度的测定主要基于单一指标成分的检测。然而，中药和民族药的固体制剂是复杂的，它们的溶解受许多因素（如温度、溶出介质等）的影响，其复杂的化学成分^19，20。因此，多指标组分的检测可以更好地反映不同组分的相互影响和溶出差异。本文对RG中3种指标组分（没食子酸、红花苷和没食子酸乙酯）进行了 体外 溶...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
	色谱柱 ZORBAX Eclipse	XDB-C18	4.6 毫米 x 250 毫米，5 和微型;m
药物溶出度测试仪	上海黄海医药检验仪器有限公司	RCZ-6B3
电子分析天平	上海良平仪器有限公司	FA1004
没食子酸乙酯 （HPLC， ≥98%）	成都德斯特生物科技有限公司
功能绘图软件	OriginLab Corporation， Northampton， MA， USA	2022
没食子酸 （HPLC， ≥98%）	成都德斯特生物科技有限公司
高效液相色谱	Agilent Technologies Singapore （International） Pte. Ltd.	Agilent 1260 Infinity