缺血性卒中兔模型中血压的实时监测与调控

摘要

连续动脉血压记录可用于研究各种血流动力学参数的影响。本报告展示了在缺血性卒中的大型动物模型中应用连续动脉血压监测，以确定卒中的病理生理机制、不同血流动力学因素的影响，以及评估新的治疗策略。

摘要

血压的控制，包括其绝对值和变异性，会影响缺血性卒中患者的预后。然而，由于人类数据本身存在难以克服的局限性，识别导致不良预后的机制或评估减轻这些影响的干预措施仍然具有挑战性。在这些情况下，可利用动物模型对疾病进行严谨且可重复的评估。本文报告了一种既往描述的兔缺血性卒中模型的优化方法，该模型结合了连续血压记录，以评估血压调节的影响。在全身麻醉下，通过外科切开暴露双侧股动脉，并置入动脉鞘。在透视成像和路径图引导下，将微导管送入脑后循环动脉。通过注射对侧椎动脉进行血管造影，以确认目标动脉的闭塞。在闭塞导管保持固定位置期间，持续记录血压，从而精确调控血压干预措施，无论是通过机械还是药物手段。在完成预定的闭塞时间后，撤出微导管，并在全身麻醉下维持动物进行规定时长的再灌注。对于急性研究，随后对动物实施安乐死并断头。取出脑组织，通过光学显微镜测量梗死体积，并进一步采用多种组织病理学染色或空间转录组学分析进行评估。该方案提供了一种可重复的模型，可用于更深入地开展关于缺血性卒中期间血压参数影响的临床前研究，同时也促进了对可能改善缺血性卒中患者治疗的新型神经保护干预措施的有效临床前评价。

引言

缺血性卒中（IS）是全球范围内导致死亡和长期残疾的主要原因，随着社会老龄化，其发病率预计将进一步上升¹。尽管在急性干预和二级预防策略方面已取得显著进展，但辅助性神经保护治疗的发展却相对滞后^2,3,4,5,6,7。由于目前对治疗手段有效或无效的潜在机制了解甚少，因此仍需进一步深入研究卒中的病理生物学机制。这在很大程度上归因于卒中患者群体的高度异质性，其中许多患者伴有多种共病，从而干扰了研究分析¹。研究受限的一个关键因素是缺乏组织层面的数据——即生物医学研究的金标准，而这主要是因为从人类中枢神经系统采样组织具有极高的致病风险。具体而言，在活体人类中采集血管组织本身就会引发卒中，因此血管组织通常仅能在尸检时获取，而这类样本无法充分代表总体人群，且倾向于偏向于高龄、病情更晚期并伴有多种并发诊断的患者。

在无法充分利用人类数据的情况下，动物模型可弥补数据空白。中风的大型动物模型较为有限，因为研究中常用的大多数大型动物均为有蹄类，其具有rete mirabile（奇网），会阻碍对脑动脉的直接血管内通路^{8,9,10,11,12,13,14,15,16,17}。兔在心血管疾病（包括颅内病变）的研究中具有长期应用历史^{8,9,10,11,12,13,14,15,16,17}。兔是脑血管疾病的理想模型，因其体型足够大，可进行血管内导管插入，且缺乏其他大型哺乳动物中存在的rete mirabile，从而允许颅内血管通路^9,15,16,17。此前已有研究通过微导管精确且可控地闭塞颅内动脉，专门利用兔模型开展缺血性卒中（IS）的研究¹⁸。

血压（BP）控制，无论是通过调节绝对血压还是血压变异性（BPV）——即动脉血压围绕平均血压波动的程度——在近期报道显示血压或血压变异性控制不佳的缺血性卒中（IS）患者预后更差之后，已成为一个新兴的潜在治疗靶点^19,20,21,22。然而，目前尚缺乏对血压变化如何导致IS患者不良预后的机制性研究。部分原因在于难以在人体中获取组织层面的数据并进行严格控制的分析。为了测试调节血压或血压变异性（BPV）的干预措施，必须借助动物模型以克服这些限制。本报告描述了一种成功结合先前已验证的兔缺血性卒中模型的方法，该模型通过可控地闭塞大脑后动脉，并结合连续的动脉内血压监测¹⁸。本文所述方法通过将一个经过验证且可重复的卒中模型应用于能够实现血压精确测量与控制的系统中，从而改进了以往对卒中病理生理学的研究手段。在此优化的模型中，可通过术后对获取脑组织进行组织病理学染色来评估梗死负荷，该组织样本还可适用于多种染色方法以及更先进的分析技术，如空间转录组学。此外，在实施存活手术后，还可选择对闭塞的大脑后循环动脉进行评估，以开展发病率相关分析。

方案

本方案已获得机构动物照护与使用委员会批准（犹他大学IACUC方案编号21-09021）。成熟的新西兰白兔从商业供应商处获得。

1. 动物获取

1. 动物到达后，根据机构规程在动物房中进行规定时间的适应性饲养，期间以标准饲料进行群养。本机构的适应期为2周。

2. 麻醉与监测

1. 通过肌肉注射布托啡诺（0.03 mg/kg）诱导全身气管麻醉，约30分钟后追加氯胺酮（25–35 mg/kg）和赛拉嗪（3 mg/kg） 肌内 注射。通过氧气混合1%-5%异氟烷维持麻醉 通过 气管插管。在诱导期间，使用100%的吸入氧浓度（FiO₂）₂，然后逐渐下调至最低的 FiO₂₂ 保持100% SpO₂₂.
   注意：必须保持持续的麻醉状态，以防止动物移动，确保脑卒中是脑卒中诱导过程中唯一的干扰因素。这也能避免因麻醉不足导致动物躁动而引起的血压升高。稳定的氧合同样重要，以确保所诱导的脑卒中具有可比性。上述措施均已在下文所述的代表性结果中予以考虑。
2. 通过向脚趾施加有害刺激，确认麻醉深度是否充分。在眼睛上涂抹兽用眼膏以防止干燥。
3. 使用耳部脉搏血氧仪监测血氧饱和度。通过耳静脉置入套管针建立静脉通路，并确保以缝线或透明粘性敷料固定。 为减轻血管痉挛，麻醉诱导后将0.25英寸的透皮硝酸甘油贴剂置于耳内侧。
4. 以每公斤体重每小时1毫升的速度输注生理盐水作为维持液体。放置食管温度探头以监测体温。根据需要使用动物身下的加热毯维持正常体温（33–37 °C）。

3. 手术准备

1. 将兔子仰卧位放置在与透视兼容的手术台上。伸展头部，以优化后续血管造影体位的摆放。兔子的动脉极为敏感，导管操作后易发生血管痉挛。 
2. 使用电动剪刀去除双侧腹股沟区域的毛发。随后触诊双侧股动脉搏动，确认已充分暴露，必要时可双侧进一步修剪。用氯己定和酒精进行皮肤消毒，然后按照常规无菌操作铺巾。
3. 在双侧腹股沟区域皮下注射2 mL 1%利多卡因，实施局部麻醉。在利多卡因注射部位使用10号刀片做一条5 cm的手术切口。采用钝性分离暴露神经血管束（图1A）。如有需要，可延长切口，以充分暴露足够长度的动脉用于穿刺。
4. 分离出神经血管束后，在动脉表面滴加数滴1%利多卡因，以预防血管痉挛。使用镊子轻柔地将动脉与静脉及邻近神经分离。通过观察血管壁的特征性外观来鉴别动脉：动脉壁较厚且呈肌性，而静脉壁较薄。动脉内血液颜色较鲜红，静脉内血液则较暗。

4. 动脉通路

1. 动脉分离后，将直角止血钳置于血管下方。用该器械夹住两根血管牵引线，并轻轻将其从动脉下方穿过。将牵引线分别置于暴露血管的近端和远端。
2. 通过牵拉血管牵引线对动脉施加轻柔张力。此时检查血管周围是否有残留组织，并以轻柔解剖方式予以清除（图1B）。此举可提高成功穿刺的几率。
3. 使用22 G套管针进行穿刺。将套管略向前推进，使其超过内部针芯，因为针芯完全就位后常会卡住，可能导致穿刺过程中装置移位。
4. 在完成血管解剖并准备好套管针后，再次向血管滴加利多卡因。动脉会明显扩张，从而提高采用Seldinger技术成功穿刺并置入导管鞘的可能性。
5. 对远端血管牵引线施加轻柔张力，以减少血流流出，使动脉充盈。这也有助于在穿刺过程中稳定血管。缓慢将套管针的针头推进至暴露动脉段的中央位置（图1C）。当在套管针及其针座腔内观察到血液闪现时，立即将套管沿针芯推入动脉腔内。
6. 若穿刺尝试未成功，可通过牵拉近端血管牵引线实现止血。用生理盐水冲洗套管针，并将其重新安装至导入针上，以便再次尝试。
7. 当套管针成功置入血管并达其针座时，经套管腔内送入Cope微导丝，并将其推进至主动脉（图1D）。沿导丝撤出套管针，替换为5 French细型亲水导管鞘（图1E）。
8. 打开三通阀，观察侧管导管中是否有动脉血回流，以确认位置正确。用0.9%生理盐水冲洗导管鞘，并在冲洗过程中关闭三通阀以锁定系统。
9. 用额外的3-0丝线将导管鞘座固定于邻近皮肤。对对侧股动脉重复上述操作。为提高操作效率，两名操作者可同时进行操作，各自专注于一侧动脉。

5. 颈脑血管造影与颅内介入通路

1. 在透视引导下，将一根4 French的导丝导管沿通过左侧股动脉鞘插入的0.035英寸导丝推进，将导丝导管尖端置于左侧椎动脉近端。撤出导丝，并用肝素化0.9%生理盐水冲洗导管。
2. 在低倍放大条件下，通过手动向左侧椎动脉注入碘对比剂进行血管造影，以显示整个头颈部（图2A）。通过从低压注射开始并逐渐增强压力的方式调节对比剂注射，以完整显示全部血管结构。
   注意：需充分注射以显示对比剂反流至右侧椎动脉，因为该血管造影图像将用作路径图引导，以便高效选择右侧椎动脉。注射应轻柔，以尽量减少血管痉挛或更严重的损伤。此外，即使动物处于深度麻醉状态，过大的力量或注射量也可能引起短暂的动物移动。
3. 对于左侧椎动脉注射，使用3 mL注射器以轻柔渐增的方式注入50%对比剂与生理盐水的稀释液。通常注入1–2 mL稀释对比剂即已足够。通过观察对比剂是否反流至右侧椎动脉及右侧锁骨下动脉来判断注射量是否充分。在注射过程中，同时注意观察大脑后动脉和小脑上动脉，其中一条将作为微导管闭塞的目标血管。
4. 准备一根2.4 French的血流导向微导管及0.010英寸微导丝，在微导丝尖端形成C形弯曲。在路径图引导下，将微导管连同微导丝经右侧股动脉鞘，通过4 French导丝导管送入右侧椎动脉。由于导管操作易诱发血管痉挛，应尽量减少器械操作时间和导管尝试次数。
5. 将微导管沿右侧椎动脉颈段推进。为顺利通过V2至V3段的锐角转弯，应在微导丝回撤至微导管近端尖端后，单独推进微导管。在此阶段若以微导丝引导前进，常会导致进入椎动脉的小分支，并可能引发显著的血管痉挛。
6. 通过V2至V3段的锐角转弯后，微导管通常可顺利进入基底动脉近端。此时可推进微导丝，并选择目标大脑后动脉或小脑上动脉。鉴于颅内动脉结构脆弱，不建议进行微导管造影注射。
7. 沿微导丝将微导管送入目标动脉。选择较近端的位置通常更为安全，因其起始部角度较利于沟通。在小脑上动脉中，可选择更深的位置（图2B）。
8. 通过高倍放大对头颅区域注射左侧椎动脉导管重复血管造影，以确认目标动脉的闭塞情况（图2B-C）。为获得最佳成像效果，使用3 mL注射器注入全浓度对比剂。通常，不超过1 mL即可充分显影所有颅内动脉。
9. 在透视引导下轻柔撤出微导管内的微导丝，以确认微导管位置稳定。在微导管接头处连接三通阀并关闭，防止因逆向血流导致血液丢失。撤出左侧椎动脉导管，以便腾出左侧股动脉鞘通路。
10. 在随后的闭塞期间，间歇性获取透视图像，以确认闭塞用微导管位置稳定。既往已有发表研究报道大脑后动脉闭塞时间范围为60–240分钟的结果¹⁸。

6. 血压测量与调节

1. 当一侧股动脉通路用于阻塞性颅内微导管时，使用对侧鞘管进行血压（BP）测量。
2. 通过股动脉鞘插入一根3 French规格的压阻式传感器，并将其推进至传感器尖端位于胸主动脉下段，以连续记录动脉血压。将该传感器连接至数据采集硬件，并通过配套软件实时显示测得的压力。在压力可视化窗口中观察血压变化。血压记录数据可导出至电子表格，以便在统计学软件中进行可视化分析。
3. alternatively，若需使用球囊导管对血压进行机械调控，可通过可用的股动脉鞘插入一根4 French规格、5 mm的Fogarty球囊导管。将球囊置于肾下主动脉位置。利用其0.025英寸的内腔进行压力描记，以连续监测球囊上游的血压；同时利用球囊4 French直径的通道连接鞘管，建立第二条血压描记通路，用于连续监测球囊下游的血压。

7. 安乐死与组织采集

1. 3小时后移除闭塞微导管，然后根据需要继续进行动脉血压测量和调节。标准恢复期为3小时，以便在后续组织学检查中观察到完整的梗死灶。
2. 在完成规定的阻塞和恢复时间后，确保动物处于手术麻醉状态，并实施安乐死（磷酸盐缓冲液灌注固定， 在确认无心脏活动后进行断头处死）或者，通过股动脉鞘注入灌注液进行灌注固定，随后横断颈静脉、下腔静脉或右心房。
   注意：对于某些死后分析，灌注可能更为可取，因为基因表达或生物标志物水平可能受灌注液的影响。本课题组已成功应用这两种技术。
3. 在急性实验中需立即取脑时，确认动物安乐死后将其头部离断。使用咬骨钳从枕嵴开始，逐块去除颅骨，向前推进直至完整取出脑组织。根据所需的组织分析类型，将脑组织置于福尔马林或最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并进行速冻。

结果

在使用该模型的初期实验中，本团队成功在14只动物中的12只（85.7%）实现了预期的后脑动脉或小脑上动脉闭塞效果。实验共研究了7只雄性和7只雌性动物。动物平均体重为3.6千克。± 0.46 千克）。在两只未成功完成手术的动物中，导管诱发的严重血管痉挛阻碍了安全进入颅内循环。其中一只兔子因闭塞性血管痉挛而无法建立颅内通路；另一只动物则在尝试插管过程中发生颅内动脉穿孔，这很可能是由于试图将微导管置于大脑后动脉过于远端的位置所致。

在所有动物中，大脑均被成功采集，并采用苏木精-伊红（H&E）染色法进行了组织病理学分析。&E) 染色或 2% 氯化三苯基四氮唑 (TTC)。与先前发表的血管闭塞模型结果一致，闭塞持续时间越长，梗死体积越大，该模型已成功实现 60 至 240 分钟的闭塞时长。¹⁸。&E 染色图像（闭塞 90 分钟后，再灌注 120 分钟）如下所示。 图 3.

所有动物在麻醉诱导后、未使用血管...

讨论

在缺血性卒中（IS）的管理方面已取得显著进展，尤其是在急性干预和二级预防策略方面。然而，在改善IS患者治疗方面仍有进一步提升的空间。在IS治疗的其他方面，特别是神经保护领域，进展有限，这可能源于对组织和分子水平上机制过程的病理生理学理解尚不充分。获取人类具有重大影响的数据既不现实，也几乎不可能。在这种情况下，来自动物模型的组织水平数据可以弥补知识空白，并推动产生实质性改变。

如上所述，兔子在体型、生理和解剖结构方面为脑血管病理学研究提供了理想的组合¹⁸。由于缺乏rete mirabile，其颅内动脉不存在结构上的阻碍。此外，颅内血管足够粗大，可容纳血管内介入装置，这一点在啮齿类动物模型中难以实现。对颅内组织的分析可通过多种方式进行，无论是通过成熟的组织病理学和免疫组织化学染色，还是通过前沿技术方法，例如利用单细胞RNA测序分析血管内活检样本，或对完整组织进行空间转录组学分析^9,15,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-0 丝线缝合线	Ethicon	A184H
布托啡诺	Sigma-Aldrich	B9275
导管	Terumo	CG415	4F 滑导导管
血管内压力传感器	Millar	SPR-524
安乐死溶液	Virbac	PVS111
导丝	Terumo	GR1804
碘海醇	ThermoFisher	466651000	含碘造影剂
氯胺酮	Biorbyt	orb61131
LabChart 软件	ADInstruments
利多卡因	Spectrum	LI102
微导管	Medtronic	EV3 105-5056	Marathon 微导管
微导丝	Medtronic	EV3 103-0608	Mirage 微导丝
PowerLab	ADInstruments
兔脑 2 mm 冠状切片模具	Ted Pella	15026
生理盐水	FisherScientific	23-535435
鞘管	Merit Medical	PSI-5F-11
Xylazine	ThermoFisher	J61430.14