用于分离多种循环肿瘤细胞的临床微流控芯片平台

摘要

临床微流控芯片是一种重要的生物医学分析技术，可简化临床患者血液样本的预处理，并对循环肿瘤细胞（CTCs）进行免疫荧光染色 原位 在芯片上，实现单个循环肿瘤细胞的快速检测与鉴定。

摘要

循环肿瘤细胞（CTCs）在癌症的预后、诊断及抗癌治疗中具有重要意义。由于CTCs数量稀少且具有异质性，对其进行计数在判断患者病情方面至关重要。CTCs从原发肿瘤脱落，进入血液循环系统，并可能在远端部位增殖，从而导致肿瘤转移。由于CTCs携带与原发肿瘤相似的信息，分离并进一步表征CTCs对于癌症的监测与诊断具有关键作用。对稀有CTCs进行计数、亲和性修饰以及临床免疫荧光染色是CTCs分离的有效方法，因其具备高灵敏度并提供必要的分析要素。微流控芯片提供了一种无痛的液体活检方法。本文介绍一系列用于临床微流控芯片的实验方案，该芯片是一种多功能的CTCs分离平台，集成了CTCs分离、分析及早期诊断所需的一系列功能与服务，从而促进生物分子分析与癌症治疗。该方案包括稀有肿瘤细胞计数、临床患者血液预处理（包括红细胞裂解）以及CTCs的分离与识别 原位 在微流控芯片上。该程序可实现对肿瘤细胞或循环肿瘤细胞（CTCs）的精确定量。此外，该程序还包含一个工具，可将CTC分离与多种微流控芯片及免疫荧光鉴定相结合。 原位 在芯片上进行生物分子分析。

引言

循环肿瘤细胞（CTCs）在癌症的预后、诊断及抗癌治疗中具有重要意义。由于CTCs数量稀少且具有异质性，对其进行计数至关重要。对稀有CTCs进行计数、亲和性修饰以及临床免疫荧光染色是分离CTCs的有力技术，因其以高灵敏度提供了必要的检测要素¹。将少量肿瘤细胞与正常血液混合，可高度模拟真实患者血液，因为2–3 mL的真实患者血液中仅含有1–10个CTCs。为解决关键的实验难题，相较于使用大量悬浮于PBS中或混入正常血液的肿瘤细胞，采用少量肿瘤细胞可使血细胞数量保持在较低水平，从而使实验条件更接近实际情况。

癌症是全球首要的死亡原因²。循环肿瘤细胞（CTCs）是从原发肿瘤脱落并进入血液和淋巴循环系统的肿瘤细胞³。当CTCs迁移至新的可存活环境时，会生长形成继发性肿瘤，这一过程称为转移，导致了约90%癌症患者的死亡⁴。CTCs在癌症的预后评估、早期诊断以及癌症机制研究中具有重要意义。然而，CTCs在患者血液中极为稀少且具有高度异质性^5,6。

微流控芯片提供了一种非侵入性肿瘤的液体活检方法。其优势在于便携、成本低，并具有与细胞相匹配的尺度。利用微流控芯片分离循环肿瘤细胞（CTC）主要分为两类：基于亲和力的方法，依赖抗原-抗体结合^7,8,9，是最早且应用最广泛的CTC分离方法；以及基于物理特性的芯片，利用肿瘤细胞与血细胞在尺寸和变形能力上的差异^{10,11,12,13,14,15}，无需标记且操作简便。相较于其他技术，微流控芯片的优势在于基于大椭圆微滤结构的物理捕获方式能够牢固地截留CTC，捕获效率高。其原因是椭圆形微柱被排列成线-线间隙构成的狭长通道，这种线-线间隙不同于传统微柱（如菱形微柱）形成的点-点间隙。基于波形芯片的CTC捕获则结合了基于物理特性和基于亲和力的两种分离机制。波形芯片捕获包含30个波形阵列，其圆形微柱表面包被有抗EpCAM抗体。CTC通过小间隙被截留，而大间隙则用于加快流速。未能被捕获的CTC需进入下一阵列的小间隙，并通过芯片内集成的亲和力捕获机制实现捕获¹⁶。

本实验方案的目的是展示如何利用微流控芯片对稀有数量的肿瘤细胞进行计数以及循环肿瘤细胞（CTC）的临床分析。该方案详细描述了CTC分离步骤、获取少量肿瘤细胞的方法、基于小椭圆滤膜、大椭圆滤膜和梯形滤膜的临床物理分离技术、亲和性修饰及富集过程¹⁷。

方案

患者血液样本由上海医科大学附属龙华医院提供。本研究方案遵循北京大学第三医院人体研究伦理委员会的指导原则。已从患者处获得知情同意，允许将其样本用于科研目的。

1. 使用培养的肿瘤细胞进行实验前检测以评估捕获效率

1. 培养肿瘤细胞 MCF-7、MDA-MB-231 和 HeLa 以测定捕获效率。稀释肿瘤细胞悬液，计数肿瘤细胞数量，并重复操作，直至获得 1 mL PBS 中所需数量的细胞。
   1. 将细胞接种于细胞培养瓶中进行培养，起始细胞数量约为 1 x 10⁵。⁵ 1 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养细胞。在 37 °C、5% CO₂ 的湿润环境中孵育₂ 大气
   2. 当细胞系以贴壁单层形式生长至95%融合度时，按照Chen等人的描述，用0.25%胰蛋白酶溶液消化2分钟，使细胞从培养皿上脱离。¹⁶.
   3. 用钙黄绿素 AM 染色肿瘤细胞。在培养皿中加入 3 µL 钙黄绿素 AM，将培养皿置于培养箱中孵育 30 分钟。随后，用胰蛋白酶消化所有细胞。
   4. 使用细胞计数板在 PBS 中对培养的肿瘤细胞进行计数，并用 PBS 稀释至每 1 mL 含 100 个肿瘤细胞。
      注意：为了精确计数细胞数量，取50 µL获得的细胞悬液，在显微镜下观察其中肿瘤细胞数量是否为五个。根据50 µL细胞悬液中实际的肿瘤细胞数量，确定为获得100个肿瘤细胞所需吸取的细胞悬液体积。
2. 使用注射泵驱动的注射器，将含有每1 mL PBS 100个肿瘤细胞的细胞悬液以不同的流速（0.5 mL/h、1 mL/h、2 mL/h、3 mL/h、4 mL/h 和 5 mL/h）引入微流控芯片。获取各流速下的捕获效率，并确定最佳流速。
   1. 统计芯片上捕获的肿瘤细胞数量以及从出口流出的细胞数量。按以下公式计算捕获效率：
      ​捕获效率 =（捕获的细胞数 /（捕获的细胞数 + 流出的细胞数））× 100%
   2. 重复实验以获得10至100个肿瘤细胞（10、20、30、40、50、60、70、80、90、100）在不同细胞数量下的捕获效率。
3. 测试并验证微流控芯片对少量肿瘤细胞的检测能力。使用经显微拉针仪制备的中空针头，将10份样本悬液分别注入微流控芯片中，每份悬液为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个和10个肿瘤细胞稀释于1 mL PBS中。在芯片捕获细胞后，对每个样本中的肿瘤细胞进行检测与计数。
   注意：空心针长约3厘米，外径为1毫米。
4. 对正常血液样本中添加的肿瘤细胞进行临床预实验检测。
   1. 用钙黄绿素AM对肿瘤细胞进行染色，然后在5 µL PBS中计数100个肿瘤细胞。将这些细胞加入1 mL全正常血液样本中。将细胞引入芯片，通过绿色免疫荧光计数芯片上捕获的肿瘤细胞数量。执行 体内 按照上述方法在芯片上进行计数，并计算捕获后的捕获效率。
   2. 对另外九个肿瘤细胞数量浓度（10、20、30、40、50、60、70、80、90）重复步骤1.4.1。
   3. 按照步骤1.3所述，分别计数1、2、3、4、5、6、7、8、9和10个肿瘤细胞，不进行染色，加入至1 mL全血正常血液中，将这些样本注入微流控芯片，捕获芯片上的肿瘤细胞。
   4. 在芯片上使用Hoechst、CK-FITC和CD45-PE进行染色。将3–5 µL荧光染料加入20–30 µL PBS中，然后用注射器将该溶液注入微流控芯片。通过蓝色和绿色免疫荧光计数芯片上捕获的肿瘤细胞数量，以确定捕获效率。
5. 进行微流控芯片的改造，以实现基于亲和力的抗EpCAM捕获。
   注意：由于波形芯片结合了基于亲和力和基于物理特性的分离方法，需用试剂对芯片进行修饰。
   1. 在室温下，将100 µL 4%（v/v）3-巯基丙基三甲氧基硅烷乙醇溶液加入芯片中，修饰芯片表面，反应45 min。加入该溶液时应小心缓慢，避免破坏芯片内部结构，特别是上层表面与基底玻璃之间的键合。
      注意：芯片表面使用巯基硅烷进行修饰。芯片上发生的相互作用由化学键决定。通过形成化学键，实现抗原与修饰抗体之间的结合。芯片内部对多种试剂进行修饰，以建立彼此连接的化学键。最后一种被修饰的试剂是抗上皮细胞黏附分子（anti-EpCAM）。循环肿瘤细胞（CTCs）表面的EpCAM抗原与芯片内的anti-EpCAM结合，从而实现对CTCs的捕获。
   2. 用乙醇洗涤3次。在芯片上加入100 µL偶联剂N-γ-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯（GMBS，1 µM），反应30分钟。
   3. 用 PBS 洗涤 3 次。使用注射器将 1 mL PBS 加入芯片中进行洗涤。
   4. 在室温下用30–40 µL浓度为10 µg/mL的中性亲和素（neutravidin）处理芯片30分钟，使细胞固定在GMBS上，随后用PBS冲洗以去除过量的亲和素。
   5. 在含有1%（w/v）BSA的100 µL PBS中，加入3 µL浓度为10 µg/mL的抗生物素化EpCAM抗体，对芯片进行修饰，4℃孵育过夜。

2. 利用芯片进行临床实验以计数循环肿瘤细胞（CTCs）

1. 使用红细胞裂解液（RBCL）对临床癌症患者血液样本进行预处理，或用注射器将 2-3 mL 血液样本直接注入微流控芯片。
   1. 进行预处理，耗时约 30 分钟。将全血样本收集至抗凝管中。向 2-3 mL 血液中加入 6-9 mL RBS 裂解液。在室温下以 111 × g 离心 5-8 分钟，弃去上层透明红色液体。
2. 按照以下步骤在芯片上捕获、染色、识别并计数细胞。
   1. 按照步骤 1 所述方法在芯片上捕获细胞。使用 Hoechst、CK-FITC 和 CD45-PE 对芯片上捕获的循环肿瘤细胞（CTC）进行染色。CK-FITC 是肿瘤细胞的特异性染料，CD45-PE 用于白细胞染色。
   2. 将 3 µL CK-FITC 加入 20 µL PBS 中。将该溶液吸入注射器，并将稀释后的 CK-FITC 泵入芯片。染色 30 分钟后，向芯片中注入 300 µL PBS 洗涤芯片。
   3. 将 3 µL CD45-PE 加入 20 µL PBS 中。将该溶液吸入注射器，并将稀释后的 CD45-PE 泵入芯片。静置 30 分钟后，向芯片中注入 300 µL PBS 洗涤芯片。
   4. 使用倒置荧光显微镜在 20× 或 40× 放大倍数下识别 CTC。CTC 发出蓝色和绿色荧光，白细胞（WBC）发出蓝色和红色荧光。通过蓝色和绿色荧光识别 CTC，通过蓝色和红色荧光识别 WBC。
   5. 根据免疫荧光图像，统计芯片上捕获的 CTC 数量。将 CTC 定义为 Hoechst+/CK-FITC+/CD45−，将 WBC 定义为 Hoechst+/CK-FITC−/CD45+。
3. 通过注射器将 PBS 反向注入微流控芯片，冲洗以富集捕获的 CTC，并从入口处收集芯片上捕获的 CTC。使用含有 1 mL PBS 的注射器，从出口端注入，在 2-3 分钟内富集芯片上捕获的 CTC，并从入口端收集。每次洗涤使用 1 mL PBS，重复 3 次。
4. 按照以下步骤对微流控芯片上捕获的肿瘤细胞或 CTC 进行染色。
   1. 使用钙黄绿素 AM（calcein AM）染色。将 5 µL calcein AM 加入 20 µL PBS 中，染色 30 分钟后，在室温下以 111 × g 离心 2 分钟，获得肿瘤细胞，并重悬于 1 mL PBS 中。
   2. 为识别细胞核，以最佳流速向芯片中加入 20 µL DAPI 溶液（将 10 µL DAPI 试剂溶于 20 µL PBS 中）：对于大椭圆微滤器，流速为 1 mL/h；对于梯形微滤器，流速为 1.5 mL/h。随后通入 20 µL 抗角蛋白原液（将 3 µL 抗角蛋白抗体溶于 20 µL PBS 中），反应 30 分钟。
   3. 对芯片上捕获的白细胞进行染色。在 CTC 被捕获后，向芯片中加入 25 µL 抗 CD45 抗体溶液（将 5 µL 抗 CD45 溶液溶于 20 µL PBS 中），染色 30 分钟。用 PBS 洗涤后，识别同时发出蓝色和绿色荧光的上皮细胞。
5. 按照以下步骤使用荧光显微镜进行免疫荧光鉴定。
   1. 使用荧光显微镜，以蓝光激光激发样本。寻找发出蓝色荧光的细胞，即有核细胞。使用以下放大倍数之一：10×、20× 或 40×。找到肿瘤细胞的清晰视野。对于蓝光激光源，激发波长为 420-485 nm，发射波长为 515 nm。
   2. 保持样本位置不变，切换至另一激光源。旋转荧光显微镜，以绿光激光激发样本。寻找发出绿色荧光的细胞，提示为肿瘤细胞。使用相同放大倍数对同一视野拍照。同时发出蓝色和绿色荧光的细胞被识别为肿瘤细胞。对于绿光激光源，激发波长为 460-550 nm，发射波长为 590 nm。
   3. 保持样本位置不变，切换至另一激光源。旋转荧光显微镜，以红光激光激发样本。寻找发出红色荧光的细胞。使用相同放大倍数对同一视野拍照。同时发出蓝色和红色荧光的细胞被识别为白细胞。
   4. 保存上述每种激光源获得的图像。使用不同颜色的光源对同一视野拍摄多张图像。
   5. 使用紫外光，激发波长为 330-400 nm，发射波长为 425 nm。使用紫光，激发波长为 395-415 nm，发射波长为 455 nm。
6. 按照步骤 1.2.1 计算捕获效率。

结果

整个装置包括一个注射泵、一个注射器和一个微流控芯片。将注射器中的细胞悬液连接至注射泵，并将细胞悬液引入微流控芯片以捕获细胞。所使用的所有微流控芯片的捕获效率均约为90%或更高。对于波浪形芯片，我们设计了具有不同间隙的微结构。小间隙用于捕获循环肿瘤细胞（CTCs），大间隙则用于加快流速。细胞悬液在大间隙区域中快速流动，未被捕获的CTCs倾向于在后续阵列的小间隙中被捕获¹⁶。对于椭圆形芯片，我们设计了线-线间隙而非点-点间隙，以形成狭窄的通道，从而增强捕获效率。因此实现了较高的捕获效率¹。我们设计了椭圆形结构以避免边缘和角落，从而维持细胞活性。梯形滤膜结构包含两条带有嵌入式梯形和圆形微柱障碍物的圆形螺旋通道。对于梯形滤膜结构，MCF-7、MDA-MB-231和HeLa细胞的捕获效率分别为94%、95%和93%¹⁸。

图1显示，所有肿瘤细胞均被波形芯片捕获。由于所有肿瘤细胞均富集在波形微...

讨论

癌症的预后和早期诊断对癌症治疗具有重要影响¹。利用微流控芯片分离循环肿瘤细胞（CTC）可实现无创液体活检。然而，CTC在血液中极为稀少且具有高度异质性¹，这使得CTC的分离极具挑战性。CTC具有与其来源原发肿瘤相似的特性，因此在癌症转移过程中发挥着关键作用¹。

本方案可实现对微流控芯片捕获循环肿瘤细胞（CTC）的完整分析。该方案涵盖了与CTC分离相关的所有关键步骤，例如红细胞裂解（RBCL）分析（被仔细记录并归类到不同模块）、稀有肿瘤细胞获取、最佳流速确定、捕获效率评估、临床表征及细胞计数。对操作过程的严谨管理有助于临床患者样本的处理。本方案支持临床患者样本的预处理与处理，为临床医生提供重要的技术支持。

在循环肿瘤细胞（CTC）分离过程中，稀有肿瘤细胞的预处理极难操作。该难题通过使用拉针仪拉制的空心针吸取所需数量的肿瘤细胞（如1、2、3、4、5、6、7、8、9和10个）得以解决。随后，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Calcein AM	BIOTIUM	80011
校准的微毛细移液管	Sigma- Aldrich	P0799
CD45-PE	BD Biosciences	560975
CK-FITC	BD Biosciences	347653	细胞角蛋白单克隆抗体
DMEM	HyClone	SH30081.05
胎牛血清（FBS）	GIBCO,USA	26140
Hoechst 33342	Molecular Probes, Solarbio Corp., 中国	C0031
青霉素-链霉素	英瑞来生物科技, 中国
红细胞裂解液（RBCL）	Solarbio, 北京	R1010