斑马鱼 Tol2 系统：一种基于 Gateway 的模块化与可变转基因方法

摘要

本研究描述了一种模块化Tol2转基因系统方案，该方法基于Gateway克隆技术，用于构建转基因载体并将其注射到斑马鱼胚胎中。

摘要

胎儿酒精谱系障碍（FASD）是一组由产前乙醇暴露引起的、具有高度变异性的结构缺陷和认知功能障碍。由于FASD病理机制复杂，动物模型对我们目前理解乙醇诱导的发育缺陷起到了关键作用。斑马鱼因其在遗传和发育过程方面与人类高度保守，已成为研究乙醇诱导发育缺陷的有力模型。作为一种模式系统，斑马鱼具备多种适合发育研究的特性，包括可产生大量体外受精的胚胎，这些胚胎具有良好的遗传可操作性和透明性。这使得研究人员能够在多种遗传背景下精确控制乙醇暴露的时间和剂量。斑马鱼中一个重要的遗传工具是转基因技术。然而，构建转基因载体并建立转基因品系往往复杂且困难。为解决这一问题，斑马鱼研究人员建立了基于转座子的Tol2转基因系统。该模块化系统采用多靶点Gateway克隆策略，可快速组装完整的基于Tol2转座子的转基因载体。本文中，我们介绍这一灵活的Tol2系统工具箱，以及一套用于构建适用于斑马鱼转基因和乙醇研究的转基因载体的操作方案。

引言

产前乙醇暴露会导致一系列结构缺陷和认知障碍，统称为胎儿酒精谱系障碍（fetal alcohol spectrum disorders, FASD）^1,2,3,4。多种因素之间的复杂关系使得在人类中研究和理解FASD的病因极具挑战性。为应对这一挑战，已广泛采用多种动物模型。这些模型中可用的生物学和实验工具对于揭示乙醇致畸作用的机制基础至关重要，且这些模型系统的研究结果与人类乙醇暴露研究的发现高度一致^5,6。其中，斑马鱼已成为研究乙醇致畸作用的有力模型^7,8，部分原因在于其体外受精、繁殖力高、遗传操作便利以及胚胎透明等优势。这些优点使斑马鱼成为利用转基因斑马鱼品系开展FASD实时活体成像研究的理想模型。

转基因斑马鱼已被广泛用于研究胚胎发育的多个方面⁹。然而，构建转基因载体并建立相应的转基因品系可能极为困难。一个标准的转基因结构需要一个具有活性的启....

方案

本实验所用的全部斑马鱼胚胎均按照既定的IACUC方案¹²进行饲养和繁殖。这些方案已获得路易斯维尔大学的批准。

注意：本研究使用了野生型斑马鱼品系 AB 以及 bmp4^st72;smad5^b1100 双突变体品系。实验中使用的所有水均为无菌反渗透水。共聚焦图像在激光扫描共聚焦显微镜下采集。内胚层测量使用 ImageJ 中的测量工具完成。所有统计分析均使用统计学软件进行。

1. 配制溶液与培养基

1. 细菌培养基：按照生产商说明书溶解LB肉汤或琼脂，并进行高压灭菌。在将培养基倒入100 mm培养皿之前，加入氨苄青霉素（50 µg/mL）、卡那霉素（50 µg/mL）或氨苄青霉素/氯霉素组合（分别为50 µg/mL和30 µg/mL）。
2. 配制20倍胚胎培养基储备液：将以下成分溶解于1 L水中：17.5 g NaCl、0.75 g KCl、2.9 g CaCl₂、0.41 g K₂HPO₄、0.142 g Na₂HPO₄和4.9 g MgSO₄·7H₂O。使用0.22 µm真空过滤系统对储备液进行过....

结果

为构建转基因载体，我们采用了 Tol2 转基因系统。使用三个入门载体：p5E 载体包含基因启动子/增强子元件，pME 载体包含由该启动子/增强子驱动表达的基因，以及 p3E 载体，其至少包含多聚腺苷酸尾（polyA tail），用于构建最终的转基因载体。 通过 多点 Gateway LR 克隆。目的载体 pDest 提供 Tol2 重复序列，用于在斑马鱼胚胎中将转基因构建体插入基因组，且包含细菌生长所需的所有基本遗传信息（图1A）。为本论文之目的，我们构建并注射了一种 sox17:EGFPCAAX 转基因构建体。内胚层标记基因的启动子， sox17，用于驱动斑马鱼发育内胚层中膜定位的EGFP表达。对于表达非荧光蛋白的转基因构建体，可使用含有荧光转基因标记（如）的pDest载体 cmlc2:EGFP 可用于辅助基因组插入（图1A).

使用上述方案中所述的数值（表 2

讨论

斑马鱼非常适合研究乙醇暴露对发育和疾病状态的影响^7,8。斑马鱼可产生大量透明、体外受精且遗传操作便利的胚胎，从而能够在多种环境条件下同时对多个转基因标记的组织和细胞类型进行活体成像^19,20。这些优势，加上其在发育遗传学上与人类的高度保守性，使斑马鱼成为研究乙醇影响的强有力模型系统^7,8。本文中，我们描述了一种模块化方法的实验方案，用于构建和注射转基因载体，并建立转基因斑马鱼品系，以用于未来的乙醇相关研究。

已有多种不同方法用于制备转基因斑马鱼。然而，构建转基因载体以及建立转基因品系均可能具有挑战性。传统的亚克隆技术、BAC克隆或基于PCR的方法（如Gibson组装）虽可用于构建转基因载体，但通量较低且构建方式缺乏灵活性

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Addgene Tol2 工具箱	https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/
空气			由大学直接提供
氨苄青霉素	菲舍尔科技	BP1760
分析天平	VWR	10204-962
硼硅毛细管 1.0 mm 外径 × 0.75 mm 内径	FHC	30-30-0
氯化钙	VWR	97062-590
氯霉素	BioVision	2486
EDTA	菲舍尔科技	BP118-500
荧光解剖显微镜	奥林巴斯	SZX16
卡那霉素	菲舍尔科技	BP906
激光扫描共聚焦显微镜	奥林巴斯	Fluoview FV1000
Lawson 实验室供体质粒制备	https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/
LB 琼脂	菲舍尔科技	BP9724
LB 肉汤	菲舍尔科技	BP1426
低电渗/多用途/分子生物学级琼脂糖	菲舍尔科技	BP160-500
LR Clonase II Plus 酶	菲舍尔科技	12538200
硫酸镁（七水合物）	菲舍尔科技	M63-500
微量移液器支架	应用科学仪器公司	MIMPH-M-PIP
微量离心管 0.5 mL	VWR	10025-724
微量离心管 1.5 mL	VWR	10025-716
显微操作器	应用科学仪器公司	MM33
移液器吸头 10 μL	菲舍尔科技	13611106
移液器吸头 1000 μL	菲舍尔科技	13611127
移液器吸头 200 μL	菲舍尔科技	13611112
mMESSAGE mMACHINE SP6 转录试剂盒	菲舍尔科技	AM1340
Mosimann 实验室 Tol2 计算工作表	https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1
NanoDrop 分光光度计	NanoDrop	ND-1000
NcoI	NEB	R0189S
NotI	NEB	R0189S
培养皿 100 mm	菲舍尔科技	FB012924
酚红钠盐	西格玛-奥德里奇	P4758-5G
Pipetman L p1000L 微量移液器	吉尔森	FA10006M
Pipetman L p200L 微量移液器	吉尔森	FA10005M
Pipetman L p2L 微量移液器	吉尔森	FA10001M
氯化钾	菲舍尔科技	P217-500
磷酸氢二钾	VWR	BDH9266-500G
压力注射仪	应用科学仪器公司	MPPI-3
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒	Qiagen	27106
碳酸氢钠	VWR	BDH9280-500G
氯化钠	菲舍尔科技	S271-500
磷酸氢二钠	菲舍尔科技	S374-500
Stericup .22 µm 真空过滤系统	Millipore	SCGPU11RE
Tol2 维基页面	http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page
Top10 化学感受态 E. coli	菲舍尔科技	C404010
垂直移液器拉制仪	David Kopf 仪器公司	720
斑马鱼显微注射模具	Adaptive Science Tools	i34