斑马鱼 Tol2 系统：一种基于 Gateway 的模块化与可变转基因方法

摘要

本研究描述了一种模块化Tol2转基因系统方案，该方法基于Gateway克隆技术，用于构建转基因载体并将其注射到斑马鱼胚胎中。

摘要

胎儿酒精谱系障碍（FASD）是一组由产前乙醇暴露引起的、具有高度变异性的结构缺陷和认知功能障碍。由于FASD病理机制复杂，动物模型对我们目前理解乙醇诱导的发育缺陷起到了关键作用。斑马鱼因其在遗传和发育过程方面与人类高度保守，已成为研究乙醇诱导发育缺陷的有力模型。作为一种模式系统，斑马鱼具备多种适合发育研究的特性，包括可产生大量体外受精的胚胎，这些胚胎具有良好的遗传可操作性和透明性。这使得研究人员能够在多种遗传背景下精确控制乙醇暴露的时间和剂量。斑马鱼中一个重要的遗传工具是转基因技术。然而，构建转基因载体并建立转基因品系往往复杂且困难。为解决这一问题，斑马鱼研究人员建立了基于转座子的Tol2转基因系统。该模块化系统采用多靶点Gateway克隆策略，可快速组装完整的基于Tol2转座子的转基因载体。本文中，我们介绍这一灵活的Tol2系统工具箱，以及一套用于构建适用于斑马鱼转基因和乙醇研究的转基因载体的操作方案。

引言

产前乙醇暴露会导致一系列结构缺陷和认知障碍，统称为胎儿酒精谱系障碍（fetal alcohol spectrum disorders, FASD）^1,2,3,4。多种因素之间的复杂关系使得在人类中研究和理解FASD的病因极具挑战性。为应对这一挑战，已广泛采用多种动物模型。这些模型中可用的生物学和实验工具对于揭示乙醇致畸作用的机制基础至关重要，且这些模型系统的研究结果与人类乙醇暴露研究的发现高度一致^5,6。其中，斑马鱼已成为研究乙醇致畸作用的有力模型^7,8，部分原因在于其体外受精、繁殖力高、遗传操作便利以及胚胎透明等优势。这些优点使斑马鱼成为利用转基因斑马鱼品系开展FASD实时活体成像研究的理想模型。

转基因斑马鱼已被广泛用于研究胚胎发育的多个方面⁹。然而，构建转基因载体并建立相应的转基因品系可能极为困难。一个标准的转基因结构需要一个具有活性的启动子元件来驱动转基因表达，以及一个多聚A信号或"尾部"，所有这些都需包含在一个稳定的细菌载体中，以便于载体的常规维护。传统上构建多组分转基因结构需要进行多个耗时的亚克隆步骤¹⁰。基于PCR的方法（如Gibson组装）可以规避部分与亚克隆相关的问题。然而，每构建一个独特的转基因结构，都必须设计并验证特异性的引物¹⁰。除了转基因构建之外，基因组整合、种系传递以及对正确转基因整合的筛选也一直存在挑战。本文中，我们描述了一种基于转座子的Tol2转基因系统（Tol2Kit）的操作方案^10,11。该模块化系统利用多靶点Gateway克隆技术，能够从不断扩展的"入门"和"目的"载体文库中快速生成多种转基因构建体。整合的Tol2转座元件可显著提高转基因效率，实现多个转基因的快速构建及其在基因组中的稳定整合。利用该系统，我们展示了如何构建内胚层特异性转基因斑马鱼品系，以研究胎儿酒精谱系障碍（FASD）中组织特异性结构缺陷的机制。最终，本方案表明，这种模块化的系统设置和转基因构建方法将极大促进基于斑马鱼的FASD研究。

方案

本实验所用的斑马鱼胚胎均按照既定的IACUC方案进行培育和饲养¹²。这些方案已获得路易斯维尔大学的批准。

注意：本研究使用了野生型斑马鱼品系 AB 以及 bmp4^st72;smad5^b1100 双突变体品系。实验中使用的所有水均为无菌反渗透水。共聚焦图像在激光扫描共聚焦显微镜下采集。内胚层测量使用 ImageJ 中的测量工具完成。所有统计分析均使用统计学软件进行。

1. 配制溶液与培养基

1. 细菌培养基：按照生产商说明溶解LB肉汤或琼脂，并进行高压灭菌。在将培养基倒入100 mm培养皿之前，加入氨苄青霉素（50 µg/mL）、卡那霉素（50 µg/mL）或氨苄青霉素/氯霉素组合（分别为50 µg/mL和30 µg/mL）。
2. 配制20倍胚胎培养基储备液：将以下成分溶解于1 L水中：17.5 g NaCl、0.75 g KCl、2.9 g CaCl₂、0.41 g K₂HPO₄、0.142 g Na₂HPO₄和4.9 g MgSO₄·7H₂O。使用0.22 µm真空过滤系统对储备液进行过滤除菌，并于4 °C保存。
   注意：出现的白色沉淀可忽略，不会影响培养基效果。
3. 在19 L水中溶解1.2 g NaHCO₃，并加入1 L 20倍胚胎培养基储备液，配制成工作浓度的胚胎培养基溶液，并将该溶液维持在28 °C。
4. 配制2%酚红溶液：将20 mg酚红钠盐溶解于1 mL无RNase水中，室温保存。

2. 胚胎注射模具

1. 制备琼脂糖注射板时，将琼脂糖加入胚胎培养基中，加热至沸腾，使其终浓度为3%。
2. 将50 mL琼脂糖溶液倒入100 mm培养皿中，在琼脂糖仍处于液态时，轻轻将注射模具放入琼脂糖中，以防止模具下方产生气泡。
3. 让琼脂糖平板冷却。待琼脂糖完全凝固后，移除注射模具，并于4 °C保存，待用。

3. 注射移液管

1. 使用垂直移液管拉制仪，将含有细丝的1.0 mm（外径）毛细管拉制成针尖，电磁阀设为2.5，加热元件设为14.6。
   注意：只要能将毛细管整齐均匀地拉成两根针尖，任何加热式拉制仪均可使用，但注射针尖需在斑马鱼胚胎注射前1周内拉制，以确保注射结果的一致性。
   1. 将毛细管放入拉制仪中，拧紧两端夹具，然后启动加热元件。
   2. 拉制毛细管以形成两根注射针尖。
   3. 从拉制仪中取出毛细管，并将其存放于空的培养皿中，培养皿内放置一条雕塑用黏土，作为针尖的固定支架。

4. 转座酶 mRNA 的制备

1. 使用NotI限制性内切酶线性化含有转座酶的Tol2Kit质粒：在0.5 mL微量离心管中依次加入以下组分：10 µL转座酶质粒（150 ng/µL）、1.5 µL限制性内切酶反应缓冲液、0.3 µL NotI内切酶。
2. 用无RNase的水将反应体系补至20 µL，混匀后于37 °C过夜消化。
3. 通过向消化反应体系中加入1 µL 0.5 M EDTA（pH 8.0）、2 µL 5 M NH₄OAc和80 µL 100% EtOH终止转座酶消化反应，混匀后于−20 °C冷藏过夜。
4. 在4 °C条件下以14,000x g离心20分钟，吸除上清液，并将DNA沉淀重悬于无RNase的水中。
5. 使用荧光计测定线性化质粒的浓度（单位为纳克每微升，ng/µL）：先运行2 µL无RNase水作为空白对照，再运行2 µL线性化质粒样品。
   注：质粒浓度通常在100–200 ng/µL之间。
6. 在0.5 mL微量离心管中按顺序加入以下组分，建立SP6 mRNA合成反应体系：10 µL 2x NTP/CAP、2 µL 10x反应缓冲液、0.1–1 µg线性DNA模板和2 µL SP6酶混合物。
7. 用无RNase的水将反应体系补至20 µL，混匀后于37 °C孵育2小时。
8. 孵育2小时后，加入1 µL DNase，充分混匀，并在37 °C继续孵育15分钟。
9. 向反应管中加入30 µL LiCl沉淀溶液以终止SP6反应，混匀后于−20 °C冷藏过夜。
10. 在4 °C条件下以14,000 x g离心20分钟使mRNA沉淀，吸除上清液后用1 mL 80% EtOH（用无RNase水稀释）洗涤mRNA沉淀。
11. 在4 °C条件下再次以14,000 x g离心20分钟使mRNA沉淀，吸除上清液，将沉淀置于空气中自然干燥。
12. 将mRNA沉淀重悬于20 µL无RNase的水中，使用荧光计按照步骤4.5所述方法测定mRNA浓度（单位为ng/µL），应至少达到100 ng/µL；每管分装100 ng mRNA用于单次使用，并于−80 °C保存。
    ​注：为确保mRNA未发生降解，可取2 µL mRNA样品快速进行DNA电泳，确认在1,950 bp处出现单一条带。

5. 多位点 Gateway 克隆以构建用于转基因的入门载体

注意：本方案改编自 Kwan 等人¹⁰，其中 LR 反应采用半反应形式进行，总体积为 5 µL。若要生成新的入门载体，需使用 5'、中间和 3' 供体载体进行 BP 反应^10,13。

1. 进行反应时，收集 p5E、pME 和 p3E 各 10 fmol，以及 20 fmol 的目的载体（pDest）。
   注意：多位点LR重组使用四种不同的质粒载体：5'端入门载体（p5E）、中间入门载体（pME）、3'端入门载体（p3E）和目的载体（pDest），以生成由Tol2重复序列侧翼包围的唯一转基因构建体，该构建体可直接注射至斑马鱼胚胎中。
   1. 从质粒来源确定所有四个载体的大小（以碱基对计）表1，Tol2Kit Wiki 页面¹⁴ 或 Addgene¹¹；参见 材料表).
      注意：对于新型载体，需进行全质粒测序 通过 商业测序公司可提供质粒精确的大小（单位：bp）。
   2. 使用荧光计测定所有四种载体的浓度，单位为纳克每微升（ng/µL），具体操作如步骤4.5所述。
   3. 根据DNA的分子量为660 g/mol以及质粒的大小（以bp计），计算为达到10 fmol（入门载体）或20 fmol（目的载体）所需的质粒总质量（单位：ng）。
      
      注意：科罗拉多大学安舒茨医学校区的Mosimann实验室提供了一个可免费使用的电子表格，用于计算LR反应中所需质粒的量（单位：ng）以及所需载体的体积（单位：µL）。¹⁵.
2. 为了构建下述的重组体， sox17:EGFPCAAX，使用以下载体：包含斑马鱼的 p5E 载体 sox17 启动子，大小为 6,918 bp¹⁶；一种pME载体，包含预nylated EGFP，大小为3,345 bp¹⁰；一种p3E载体，包含SV40晚期poly A信号序列，长度为2,838 bp¹⁰；以及大小为 5,883 bp 的 pDest¹⁰.
3. 根据步骤 5.1.2 测定的质粒浓度以及每种载体（步骤 5.1.3）的纳克（ng）用量，计算每种质粒达到 10 fmol（入门载体）或 20 fmol（目的载体）所需的总体积（微升，µL），然后将该体积除以 2，用于 5 µL 的半量 LR 反应（下表所列数值均列出） 表 2).
   
   1. 要生成10 fmol的p5E-sox17，使用45.66 ng（浓度为140.3 ng/µL），用无菌水稀释4倍，得到0.65 µL。
   2. 要生成10 fmol的pME-EGFPCAAX，使用22.08 ng（浓度为213.5 ng/µL），用无菌水稀释10倍，得到0.52 µL。
   3. 要生成 10 fmol 的 p3E-poly A，取 15.73 ng（浓度为 276.1 ng/µL），用无菌水稀释 20 倍，得到 0.57 µL。
   4. 对于20 fmol的目的载体，使用77.66 ng的pDest（浓度为307.3 ng/µL），用无菌水稀释5倍，得到1.63 µL。
4. 在0.5 mL微量离心管中，混合步骤5.3确定的p5E、pME、p3E和pDest的体积，以配制5 µL的半量LR反应体系，然后加入无菌水使总体积达到4 µL。
5. 剧烈涡旋混匀LR酶混合液，每次1分钟，共2次，以确保充分混匀；然后向反应体系中加入1 µL，彻底混匀。
6. 25 °C 下孵育过夜（16+ 小时）。
7. 通过加入0.5 µL蛋白酶K（2 µg/µL）终止LR反应，37 °C孵育10分钟，然后冷却至室温。
8. 将3-4 µL质粒加入已解冻的化学感受态细胞中，冰上静置25-30分钟，进行转化。
9. 在细胞置于冰上的同时，将两块LB-氨苄青霉素琼脂平板恢复至室温。
10. 将细胞在42°C水浴中热激 precisely 30 s。
11. 热激后，向细胞中加入250 µL不含抗生素的丰富液体培养基，于37 °C振荡培养1.5小时。
12. 将300 µL细菌涂布于一个氨苄青霉素平板上，37°C过夜培养。
13. 次日早晨，筛选菌落以检测是否存在两种表型：透明和不透明，挑选透明菌落（如 Kwan 等人所述）¹⁰一次接种一个液体培养物，然后在37 °C下振荡培养过夜。
    注意：清晰的菌落几乎总是含有正确的LR菌落（>85% 的时间）。
14. 按照制造商说明，使用商业试剂盒对每种液体培养物进行质粒提取，并对每种质粒进行诊断性酶切，以确认转基因结构的正确大小，从而验证LR Gateway反应已成功进行。
15. 使用0.5–1 µL质粒，按照步骤5.4–5.12所述的标准细菌转化方案重新转化正确的转基因构建体，仅在37 °C孵育1小时。
16. 重新划线培养菌落，并按照步骤5.14确认每个菌落均含有LR转基因构建体。
17. 按照步骤4.5所述测定质粒浓度（胚胎注射所需浓度至少为150 ng/µL）。

6. 将转基因注射到胚胎中

1. 将一次性转座酶 mRNA 样品和 Tol2 转基因构建体在冰上解冻，并将琼脂糖注射板预温至室温。
2. 在冰上混合以下成分：150 ng 质粒、100 ng 转座酶 mRNA 和 2% 酚红（0.3 µL），然后加入无 RNA 酶的水，使总体积达到 3 µL。
3. 使用转移移液管将单细胞期胚胎转移到已完全覆盖 EM 的注射板（如步骤 2 所述）中，并轻轻将约 50–75 个胚胎压入注射板的每个槽内。
4. 将 mRNA/质粒/酚红混合物加入毛细玻璃注射针的开口端，将毛细针固定在注射装置的夹具上，然后打开注射装置。
   注意：注射装置利用压缩气体（如空气）在激活时脉冲式注入所需体积（见步骤 6.5）的 mRNA/质粒/酚红混合物进入胚胎。
5. 将毛细针插入注射板的 EM 中，用镊子折断针尖，使注射装置仅能泵出少量的 mRNA/质粒/酚红混合物。
6. 向胚胎的细胞体中注射一小份 3 nL 的 mRNA/质粒/酚红混合物。
   注意：3 nL 的注射量理论上可使七份等体积的混合物恰好并列分布于胚胎中线。
7. 完成胚胎注射后，轻轻将胚胎从注射板的槽中推出，用移液管转移至含有新鲜 EM（约 40 mL）的 100 mm 培养皿中，于 28.5 °C 下孵育，使胚胎继续发育。

7. 筛选转基因插入的胚胎

1. 为了表达荧光蛋白，选择荧光转基因应表达的适当发育阶段，并在荧光解剖显微镜下筛选荧光的存在。
   注意：这些胚胎在表达上将呈现嵌合性，并显示出转基因构建体的基因组插入。
2. 通过筛选荧光转基因标记（如步骤7.1所述）来筛选非荧光转基因，例如由心脏特异性启动子驱动的cmlc2基因的GFP，或由晶状体特异性启动子αcyrstallin驱动的mCherry，这些标记包含在不同的目的载体中。
3. 让确认含有转基因插入的胚胎完全发育至成年斑马鱼阶段。
4. 一旦潜在的转基因鱼达到繁殖年龄，将其分别与野生型斑马鱼交配，以个体为单位筛选生殖系传递情况和转基因表达水平。
5. 选择那些胚胎发育正常且表现出最强且最适表达水平的成鱼，作为独特的转基因斑马鱼品系，用于后续实验与分析。
   注意：作为筛选转基因构建体基因组插入的替代方法，可设计仅扩增转基因构建体而不扩增野生型DNA的PCR引物。

结果

为了构建转基因载体，我们采用了 Tol2 转基因系统。使用了三种入门载体：p5E 载体包含基因的启动子/增强子元件，pME 载体包含由启动子/增强子元件驱动表达的基因，p3E 载体至少包含一个多聚腺苷酸尾（polyA tail），通过这三种载体共同构建转基因表达载体。 通过 多点 Gateway LR 克隆。目的载体 pDest 提供 Tol2 重复序列，用于在斑马鱼胚胎中将转基因构建体插入基因组，并包含细菌生长所需的所有基本遗传信息（图1A）。在本论文中，我们构建并注射了一种 sox17:EGFPCAAX 转基因构建体。内胚层标记基因的启动子， sox17用于在斑马鱼内胚层发育过程中驱动膜定位的EGFP表达。对于表达非荧光蛋白的转基因构建体，可使用含有荧光转基因标记（如）的pDest载体 cmlc2:EGFP 可用于辅助基因组插入（图1A).

根据上述方案中描述的数值（表2<...

讨论

斑马鱼非常适合研究乙醇暴露对发育和疾病状态的影响^7,8。斑马鱼可产生大量透明、体外受精且遗传操作便利的胚胎，从而能够在多种环境条件下同时对多个转基因标记的组织和细胞类型进行活体成像^19,20。这些优势，加上其在发育遗传学上与人类的高度保守性，使斑马鱼成为研究乙醇影响的强有力模型系统^7,8。本文中，我们描述了一种模块化方法的实验方案，用于构建和注射转基因载体，并建立转基因斑马鱼品系，以用于未来的乙醇相关研究。

已有多种不同方法用于制备转基因斑马鱼。然而，构建转基因载体以及建立转基因品系均可能具有挑战性。传统的亚克隆技术、BAC克隆或基于PCR的方法（如Gibson组装）虽可用于构建转基因载体，但通量较低且构建方式缺乏灵活性

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Addgene Tol2 工具箱	https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/
空气			由大学直接提供
氨苄青霉素	菲舍尔科技	BP1760
分析天平	VWR	10204-962
硼硅毛细管 1.0 mm 外径 × 0.75 mm 内径	FHC	30-30-0
氯化钙	VWR	97062-590
氯霉素	BioVision	2486
EDTA	菲舍尔科技	BP118-500
荧光解剖显微镜	奥林巴斯	SZX16
卡那霉素	菲舍尔科技	BP906
激光扫描共聚焦显微镜	奥林巴斯	Fluoview FV1000
Lawson 实验室供体质粒制备	https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/
LB 琼脂	菲舍尔科技	BP9724
LB 肉汤	菲舍尔科技	BP1426
低电渗/多用途/分子生物学级琼脂糖	菲舍尔科技	BP160-500
LR Clonase II Plus 酶	菲舍尔科技	12538200
硫酸镁（七水合物）	菲舍尔科技	M63-500
微量移液器支架	应用科学仪器公司	MIMPH-M-PIP
微量离心管 0.5 mL	VWR	10025-724
微量离心管 1.5 mL	VWR	10025-716
显微操作器	应用科学仪器公司	MM33
移液器吸头 10 μL	菲舍尔科技	13611106
移液器吸头 1000 μL	菲舍尔科技	13611127
移液器吸头 200 μL	菲舍尔科技	13611112
mMESSAGE mMACHINE SP6 转录试剂盒	菲舍尔科技	AM1340
Mosimann 实验室 Tol2 计算工作表	https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1
NanoDrop 分光光度计	NanoDrop	ND-1000
NcoI	NEB	R0189S
NotI	NEB	R0189S
培养皿 100 mm	菲舍尔科技	FB012924
酚红钠盐	西格玛-奥德里奇	P4758-5G
Pipetman L p1000L 微量移液器	吉尔森	FA10006M
Pipetman L p200L 微量移液器	吉尔森	FA10005M
Pipetman L p2L 微量移液器	吉尔森	FA10001M
氯化钾	菲舍尔科技	P217-500
磷酸氢二钾	VWR	BDH9266-500G
压力注射仪	应用科学仪器公司	MPPI-3
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒	Qiagen	27106
碳酸氢钠	VWR	BDH9280-500G
氯化钠	菲舍尔科技	S271-500
磷酸氢二钠	菲舍尔科技	S374-500
Stericup .22 µm 真空过滤系统	Millipore	SCGPU11RE
Tol2 维基页面	http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page
Top10 化学感受态 E. coli	菲舍尔科技	C404010
垂直移液器拉制仪	David Kopf 仪器公司	720
斑马鱼显微注射模具	Adaptive Science Tools	i34