本研究描述了一种模块化Tol2转基因系统方案，该方法基于Gateway克隆技术，用于构建转基因载体并将其注射到斑马鱼胚胎中。
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本文内容
摘要
摘要
胎儿酒精谱系障碍（FASD）是一组由产前乙醇暴露引起的、具有高度变异性的结构缺陷和认知功能障碍。由于FASD病理机制复杂，动物模型对我们目前理解乙醇诱导的发育缺陷起到了关键作用。斑马鱼因其在遗传和发育过程方面与人类高度保守，已成为研究乙醇诱导发育缺陷的有力模型。作为一种模式系统，斑马鱼具备多种适合发育研究的特性，包括可产生大量体外受精的胚胎，这些胚胎具有良好的遗传可操作性和透明性。这使得研究人员能够在多种遗传背景下精确控制乙醇暴露的时间和剂量。斑马鱼中一个重要的遗传工具是转基因技术。然而，构建转基因载体并建立转基因品系往往复杂且困难。为解决这一问题，斑马鱼研究人员建立了基于转座子的Tol2转基因系统。该模块化系统采用多靶点Gateway克隆策略，可快速组装完整的基于Tol2转座子的转基因载体。本文中，我们介绍这一灵活的Tol2系统工具箱，以及一套用于构建适用于斑马鱼转基因和乙醇研究的转基因载体的操作方案。
引言
产前乙醇暴露会导致一系列结构缺陷和认知障碍，统称为胎儿酒精谱系障碍（fetal alcohol spectrum disorders, FASD）1,2,3,4。多种因素之间的复杂关系使得在人类中研究和理解FASD的病因极具挑战性。为应对这一挑战，已广泛采用多种动物模型。这些模型中可用的生物学和实验工具对于揭示乙醇致畸作用的机制基础至关重要，且这些模型系统的研究结果与人类乙醇暴露研究的发现高度一致5,6。其中，斑马鱼已成为研究乙醇致畸作用的有力模型7,8，部分原因在于其体外受精、繁殖力高、遗传操作便利以及胚胎透明等优势。这些优点使斑马鱼成为利用转基因斑马鱼品系开展FASD实时活体成像研究的理想模型。
转基因斑马鱼已被广泛用于研究胚胎发育的多个方面9。然而，构建转基因载体并建立相应的转基因品系可能极为困难。一个标准的转基因结构需要一个具有活性的启动子元件来驱动转基因表达，以及一个多聚A信号或"尾部"，所有这些都需包含在一个稳定的细菌载体中，以便于载体的常规维护。传统上构建多组分转基因结构需要进行多个耗时的亚克隆步骤10。基于PCR的方法（如Gibson组装）可以规避部分与亚克隆相关的问题。然而，每构建一个独特的转基因结构，都必须设计并验证特异性的引物10。除了转基因构建之外，基因组整合、种系传递以及对正确转基因整合的筛选也一直存在挑战。本文中，我们描述了一种基于转座子的Tol2转基因系统（Tol2Kit）的操作方案10,11。该模块化系统利用多靶点Gateway克隆技术，能够从不断扩展的"入门"和"目的"载体文库中快速生成多种转基因构建体。整合的Tol2转座元件可显著提高转基因效率，实现多个转基因的快速构建及其在基因组中的稳定整合。利用该系统，我们展示了如何构建内胚层特异性转基因斑马鱼品系，以研究胎儿酒精谱系障碍（FASD）中组织特异性结构缺陷的机制。最终，本方案表明，这种模块化的系统设置和转基因构建方法将极大促进基于斑马鱼的FASD研究。
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方案
本实验所用的全部斑马鱼胚胎均按照既定的IACUC方案12进行饲养和繁殖。这些方案已获得路易斯维尔大学的批准。
注意：本研究使用了野生型斑马鱼品系 AB 以及 bmp4st72;smad5b1100 双突变体品系。实验中使用的所有水均为无菌反渗透水。共聚焦图像在激光扫描共聚焦显微镜下采集。内胚层测量使用 ImageJ 中的测量工具完成。所有统计分析均使用统计学软件进行。
1. 配制溶液与培养基
- 细菌培养基：按照生产商说明书溶解LB肉汤或琼脂，并进行高压灭菌。在将培养基倒入100 mm培养皿之前，加入氨苄青霉素（50 µg/mL）、卡那霉素（50 µg/mL）或氨苄青霉素/氯霉素组合（分别为50 µg/mL和30 µg/mL）。
- 配制20倍胚胎培养基储备液：将以下成分溶解于1 L水中：17.5 g NaCl、0.75 g KCl、2.9 g CaCl2、0.41 g K2HPO4、0.142 g Na2HPO4和4.9 g MgSO4·7H2O。使用0.22 µm真空过滤系统对储备液进行过滤除菌，并于4 °C保存。
注意：出现的白色沉淀可忽略，不会影响培养基效果。 - 在19 L水中溶解1.2 g NaHCO3，并加入1 L 20倍胚胎培养基储备液，配制成工作浓度的胚胎培养基溶液，并将该溶液维持在28 °C。
- 配制2%酚红溶液：将20 mg酚红钠盐溶解于1 mL无RNase的水中，室温保存。
2. 胚胎注射模具
- 制备琼脂糖注射板时，将琼脂糖加入胚胎培养基中，加热至沸腾，使其终浓度为 3%。
- 将 50 mL 琼脂糖溶液倒入 100 mm 培养皿中，在琼脂糖仍处于液态时，轻轻将注射模具置于琼脂糖中，以防止模具下方产生气泡。
- 让琼脂糖平板冷却。待琼脂糖完全凝固后，移除注射模具，并于 4 °C 保存，待用。
3. 注射移液管
- 使用垂直毛细管拉制仪，将带有细丝的1.0 mm（外径）毛细管拉制成针尖，电磁阀设定为2.5，加热元件设定为14.6。
注意：只要能将毛细管整齐均匀地拉成两根针尖，任何加热式拉制仪均可使用；但为保证显微注射结果的一致性，注射针尖应在对斑马鱼胚胎进行注射前1周内完成拉制。- 将毛细管放入拉制仪中，拧紧两端夹具，然后启动加热元件。
- 拉制毛细管以形成两根显微注射针。
- 从拉制仪中取出毛细管，并将其存放于空的培养皿中，培养皿内应放置一条作为针尖支架的油灰条。
4. 转座酶 mRNA 的制备
- 通过在0.5 mL微量离心管中混合以下组分，用NotI限制性内切酶线性化含有转座酶的Tol2Kit质粒：10 µL转座酶质粒（150 ng/µL）、1.5 µL限制性内切酶反应缓冲液、0.3 µL NotI内切酶。
- 用无RNase水将反应体系补至20 µL，混匀后于37 °C过夜消化。
- 通过向消化反应体系中加入1 µL 0.5 M EDTA（pH 8.0）、2 µL 5 M NH4OAc和80 µL 100% EtOH终止转座酶消化反应，混匀后于−20 °C过夜冷冻。
- 在4 °C下以14,000x g离心20分钟，吸除上清液，将DNA沉淀重悬于无RNase水中。
- 使用荧光计测定线性质粒的浓度（单位：纳克每微升，ng/µL），先运行2 µL无RNase水作为空白对照，再运行2 µL线性质粒。
注：质粒浓度通常在100–200 ng/µL之间。 - 在0.5 mL微量离心管中按顺序混合以下组分，设置SP6 mRNA合成反应：10 µL 2x NTP/CAP、2 µL 10x反应缓冲液、0.1–1 µg线性DNA模板和2 µL SP6酶混合液。
- 用无RNase水将反应体系补至20 µL，混匀后于37 °C孵育2小时。
- 孵育2小时后，加入1 µL DNase，充分混匀，并在37 °C继续孵育15分钟。
- 为终止SP6反应，向反应管中加入30 µL LiCl沉淀溶液，混匀后于−20 °C过夜冷冻。
- 在4 °C下以14,000 xg离心20分钟以沉淀mRNA，吸除上清液后用1 mL 80% EtOH（用无RNase水稀释）洗涤mRNA沉淀。
- 在4 °C下以14,000 xg离心20分钟以沉淀mRNA，吸除上清液，让沉淀在空气中自然干燥。
- 将mRNA沉淀重悬于20 µL无RNase水中，使用荧光计按照步骤4.5所述方法测定mRNA浓度（单位：ng/µL），应至少达到100 ng/µL；每管分装100 ng mRNA用于单次使用，并储存于−80 °C。
注：为确保mRNA未发生降解，可取2 µL mRNA样品在DNA电泳凝胶上快速检测，确认在1,950 bp处出现单一条带。
5. 多位点 Gateway 克隆构建用于转基因的入门载体
注意：本实验方案经 Kwan 等人10 的方法修改而来，其中 LR 反应采用半反应形式进行，总体积为 5 µL。若要生成新的入门载体，需使用 5'、中间和 3' 供体质粒进行 BP 反应10,13。
- 进行反应时，分别取 p5E、pME 和 p3E 各 10 fmol，以及目的载体（pDest）20 fmol。
注意：多点LR重组反应使用四种不同的质粒载体：5'端入门载体（p5E）、中间入门载体（pME）、3'端入门载体（p3E）和目的载体（pDest），以生成由Tol2重复序列侧翼包围的唯一转基因构建体，可用于注射斑马鱼胚胎。- 从质粒来源确定所有四个载体的大小（以碱基对计）表1Tol2Kit Wiki 页面14 或 Addgene11；参见 材料表).
注意：对于新型载体，需进行质粒全序列测定 通过 商业测序公司可提供质粒的精确大小（单位：bp）。 - 确定所有四种载体的浓度，单位为纳克每微升（ng/μL）。µL使用荧光计，按照步骤 4.5 中所述进行检测。
- 根据DNA的分子量为660 g/mol以及质粒的大小（以bp计），计算为达到10 fmol（入门载体）或20 fmol（目的载体）所需的质粒总质量（纳克，ng）。
![用于核酸定量的向量计算公式，\(向量大小 [bp] \times 10\: fmol\)。](/files/ftp_upload/64679/64679eq01.jpg "figure-protocol-1")
注意：科罗拉多大学安舒茨医学校区的Mosimann实验室提供了一个可免费获取的电子表格，用于计算所需质粒的用量（单位：ng）及体积（单位：μL） µL) LR 反应所需的载体数量15.
- 从质粒来源确定所有四个载体的大小（以碱基对计）表1Tol2Kit Wiki 页面14 或 Addgene11；参见 材料表).
- 为构建下述载体， sox17:EGFPCAAX，使用以下载体：包含斑马鱼的 p5E 载体 sox17 启动子，大小为 6,918 bp16；一种含有 prenylated EGFP 的 pME 载体，大小为 3,345 bp10；一种p3E载体，含有SV40晚期多聚A信号序列，长度为2,838 bp10；以及大小为 5,883 bp 的 pDest10.
- 根据步骤 5.1.2 测定的质粒浓度以及每种载体的纳克（ng）用量（步骤 5.1.3），计算总共需要的微升（μL）数µL每种质粒达到 10 fmol（入门载体）或 20 fmol（目的载体）所需的体积，然后将其除以二用于后续步骤 5 µL 半-LR 反应（下表所列所有数值均列于 表2).
- 要生成10 fmol的p5E-sox17，需使用45.66 ng（浓度为140.3 ng/μL）µL）并用无菌水稀释4倍，得到 0.65 µL.
- 要生成 10 fmol 的 pME-EGFPCAAX，请使用 22.08 ng（浓度为 213.5 ng/µL）并用无菌水稀释10倍以获得 0.52 µL.
- 要生成 10 fmol 的 p3E-poly A，使用 15.73 ng（浓度为 276.1 ng/µL）并用无菌水稀释20倍以获得 0.57 µL.
- 对于20 fmol的目的载体，使用77.66 ng的pDest（浓度为307.3 ng/μL）µL) 并用无菌水稀释至原浓度的五分之一，以获得 1.63 µL.
- 建立一个 5 µL 半LR反应，将第5.3步确定的p5E、pME、p3E和pDest的体积加入0.5 mL微量离心管中，然后加入无菌水，使总体积达到 4 µL.
- 剧烈涡旋振荡LR酶混合液2次，每次1分钟，以确保充分混匀，然后加入 1 µL 加入反应体系并充分混匀。
- 孵育于 25 °C 过夜（16+ 小时）。
- 通过添加终止LR反应 0.5 µL 蛋白酶K的2 µg/µL），在 37 °C 10 分钟，然后冷却至室温。
- 转化 3-4 µL 将质粒加入已解冻的化学感受态细胞中，冰上静置25-30分钟，以实现质粒的转化。
- 细胞置于冰上孵育的同时，将两块LB-氨苄青霉素琼脂平板恢复至室温。
- 将细胞进行热激处理 42°C 水浴精确30秒。
- 热激后，加入 250 µL 将不含抗生素的丰富液体培养基加入细胞中，振荡培养 37 °C 1.5 小时。
- 铺展 300 µL 一种氨苄青霉素平板上的细菌，并在 37°C 过夜。
- 次日早晨，筛选菌落中是否存在透明和不透明两种表型，挑取透明菌落（如 Kwan 等所述）10）逐一接种液体培养基，然后振荡培养 37 °C 过夜。
注意：清晰的菌落几乎总是含有正确的 LR 菌落>85% 的时间）。 - 按照制造商说明，使用商业试剂盒对每种液体培养物进行质粒提取，并对每种质粒进行诊断性酶切，以确认转基因构建体的正确大小，从而验证LR Gateway反应已成功进行。
- 使用步骤 5.4–5.12 中所述的标准细菌转化方案，将正确的转基因载体重新转化，采用 0.5–1 µL 质粒，并仅在 37 °C 1小时。
- 重新划线培养菌落，并按照步骤5.14确认每个菌落均含有LR转基因构建体。
- 按照步骤 4.5 所述测定质粒浓度（至少 150 ng/µL 用于胚胎注射）。
6. 将转基因注入胚胎
- 将一次性转座酶 mRNA 样品和 Tol2 转基因构建体在冰上解冻，并将琼脂糖注射板提前升温至室温。
- 在冰上混合以下成分：150 ng 质粒、100 ng 转座酶 mRNA 和 2% 酚红（0.3 µL）；然后加入无 RNA 酶的水，将总体积补至 3 µL。
- 使用移液管将单细胞期胚胎转移至已完全覆盖胚胎培养液（EM）的注射板（如步骤 2 所述）中，轻轻按压，使每个注射槽中放置约 50–75 个胚胎。
- 将 mRNA/质粒/酚红混合物加入毛细注射针的开放端，将毛细针插入显微注射装置的夹持臂中，然后打开显微注射装置。
注意：显微注射装置使用压缩气体（如空气）作为动力，当激活时可将设定体积（见步骤 6.5）的 mRNA/质粒/酚红混合物脉冲式注入胚胎中。 - 将毛细针插入注射板的胚胎培养液（EM）中，用镊子折断针尖，使仅能有少量 mRNA/质粒/酚红混合物流出，以便由显微注射装置精确控制注射量。
- 向胚胎的细胞体中注射 3 nL 小体积的 mRNA/质粒/酚红混合物。
注意：3 nL 的注射体积理论上可使七个注射剂量均匀分布在胚胎中轴线上。 - 完成胚胎注射后，轻轻将胚胎从注射板的槽中推出，用移液管转移至含新鲜胚胎培养液（EM，约 40 mL）的 100 mm 培养皿中，于 28.5 °C 下孵育，以促进胚胎发育。
7. 筛选转基因插入的胚胎
- 为表达荧光蛋白，选择荧光转基因应表达的适当发育阶段，并在荧光解剖显微镜下筛选荧光的存在。
注意：这些胚胎的表达呈嵌合状态，并显示转基因载体已整合至基因组中。 - 通过筛选荧光转基因标记物（如步骤7.1所述）来筛选非荧光转基因，例如由心脏特异性启动子驱动的cmlc2基因的GFP，或由晶状体特异性启动子α-crystallin驱动的mCherry，这些标记物位于不同的目的载体中。
- 让携带转基因插入的胚胎完全发育至成年斑马鱼阶段。
- 当潜在的转基因鱼达到繁殖年龄后，将其与野生型斑马鱼交配， individually 筛选其生殖系传递能力和转基因表达水平。
- 选择那些胚胎发育正常且表现出最强且最适表达模式的成年个体，作为独特的转基因斑马鱼品系，用于后续实验与分析。
注意：作为筛选转基因载体基因组插入的替代方法，可设计仅扩增转基因载体而不扩增野生型DNA的PCR引物。
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结果
为构建转基因载体，我们采用了 Tol2 转基因系统。使用三个入门载体：p5E 载体包含基因启动子/增强子元件，pME 载体包含由该启动子/增强子驱动表达的基因，以及 p3E 载体，其至少包含多聚腺苷酸尾（polyA tail），用于构建最终的转基因载体。 通过 多点 Gateway LR 克隆。目的载体 pDest 提供 Tol2 重复序列，用于在斑马鱼胚胎中将转基因构建体插入基因组，且包含细菌生长所需的所有基本遗传信息（图1A）。为本论文之目的，我们构建并注射了一种 sox17:EGFPCAAX 转基因构建体。内胚层标记基因的启动子， sox17，用于驱动斑马鱼发育内胚层中膜定位的EGFP表达。对于表达非荧光蛋白的转基因构建体，可使用含有荧光转基因标记（如）的pDest载体 cmlc2:EGFP 可用于辅助基因组插入（图1A).
使用上述方案中所述的数值（表 2
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讨论
斑马鱼非常适合研究乙醇暴露对发育和疾病状态的影响7,8。斑马鱼可产生大量透明、体外受精且遗传操作便利的胚胎，从而能够在多种环境条件下同时对多个转基因标记的组织和细胞类型进行活体成像19,20。这些优势，加上其在发育遗传学上与人类的高度保守性，使斑马鱼成为研究乙醇影响的强有力模型系统7,8。本文中，我们描述了一种模块化方法的实验方案，用于构建和注射转基因载体，并建立转基因斑马鱼品系，以用于未来的乙醇相关研究。
已有多种不同方法用于制备转基因斑马鱼。然而，构建转基因载体以及建立转基因品系均可能具有挑战性。传统的亚克隆技术、BAC克隆或基于PCR的方法（如Gibson组装）虽可用于构建转基因载体，但通量较低且构建方式缺乏灵活性
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院/酒精滥用国家研究所（NIH/NIAAA）资助，项目编号R00AA023560，授予C.B.L.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Addgene Tol2 工具箱 | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| 空气 | 由大学直接提供 | ||
| 氨苄青霉素 | 菲舍尔科技 | BP1760 | |
| 分析天平 | VWR | 10204-962 | |
| 硼硅毛细管 1.0 mm 外径 × 0.75 mm 内径 | FHC | 30-30-0 | |
| 氯化钙 | VWR | 97062-590 | |
| 氯霉素 | BioVision | 2486 | |
| EDTA | 菲舍尔科技 | BP118-500 | |
| 荧光解剖显微镜 | 奥林巴斯 | SZX16 | |
| 卡那霉素 | 菲舍尔科技 | BP906 | |
| 激光扫描共聚焦显微镜 | 奥林巴斯 | Fluoview FV1000 | |
| Lawson 实验室供体质粒制备 | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB 琼脂 | 菲舍尔科技 | BP9724 | |
| LB 肉汤 | 菲舍尔科技 | BP1426 | |
| 低电渗/多用途/分子生物学级琼脂糖 | 菲舍尔科技 | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus 酶 | 菲舍尔科技 | 12538200 | |
| 硫酸镁（七水合物） | 菲舍尔科技 | M63-500 | |
| 微量移液器支架 | 应用科学仪器公司 | MIMPH-M-PIP | |
| 微量离心管 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| 微量离心管 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| 显微操作器 | 应用科学仪器公司 | MM33 | |
| 移液器吸头 10 μL | 菲舍尔科技 | 13611106 | |
| 移液器吸头 1000 μL | 菲舍尔科技 | 13611127 | |
| 移液器吸头 200 μL | 菲舍尔科技 | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 转录试剂盒 | 菲舍尔科技 | AM1340 | |
| Mosimann 实验室 Tol2 计算工作表 | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop 分光光度计 | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| 培养皿 100 mm | 菲舍尔科技 | FB012924 | |
| 酚红钠盐 | 西格玛-奥德里奇 | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L 微量移液器 | 吉尔森 | FA10006M | |
| Pipetman L p200L 微量移液器 | 吉尔森 | FA10005M | |
| Pipetman L p2L 微量移液器 | 吉尔森 | FA10001M | |
| 氯化钾 | 菲舍尔科技 | P217-500 | |
| 磷酸氢二钾 | VWR | BDH9266-500G | |
| 压力注射仪 | 应用科学仪器公司 | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 | Qiagen | 27106 | |
| 碳酸氢钠 | VWR | BDH9280-500G | |
| 氯化钠 | 菲舍尔科技 | S271-500 | |
| 磷酸氢二钠 | 菲舍尔科技 | S374-500 | |
| Stericup .22 µm 真空过滤系统 | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 维基页面 | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 化学感受态 E. coli | 菲舍尔科技 | C404010 | |
| 垂直移液器拉制仪 | David Kopf 仪器公司 | 720 | |
| 斑马鱼显微注射模具 | Adaptive Science Tools | i34 |
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重印与许可
