斑马鱼生殖系编辑的精子筛选快速分离方法

摘要

CRISPR-Cas 技术已彻底改变了基因组编辑领域。然而，发现并分离出理想的种系编辑仍是一个主要瓶颈。因此，本实验方案描述了一种可靠的方法，利用标准的 PCR、限制性酶切和凝胶电泳技术，快速筛选经 CRISPR 注射的 F0 代斑马鱼精子中的种系编辑。

摘要

靶向 CRISPR-Cas 核酸酶技术的出现，彻底改变了在已建立和新兴的模式系统中进行精确基因组编辑的能力。CRISPR-Cas 基因组编辑系统利用合成的向导 RNA（sgRNA）将 CRISPR 相关（Cas）内切酶靶向至特定的基因组 DNA 位点，在该位点处 Cas 内切酶产生双链断裂。细胞通过内在的易错机制修复双链断裂，导致插入和/或缺失，从而破坏该基因座。此外，在此过程中引入双链 DNA 供体或单链 DNA 寡核苷酸，可促使实现精确的基因组编辑，编辑范围从单核苷酸多态性到小的免疫标签，甚至大型荧光蛋白构建体。然而，该流程中的一个主要瓶颈在于发现并分离生殖系中所需的编辑。本方案概述了一种在特定基因座高效筛选和分离生殖系突变的可靠方法 斑马鱼 （斑马鱼）；然而，这些原则可能适用于任何模型生物 体内 可以进行精子采集。

引言

CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas 系统是一种强大的工具，可用于在 Danio rerio（斑马鱼）模型系统中进行位点特异性的诱变和精确的基因组编辑^1,2,3,4。Cas-核糖核蛋白（RNP）由两个主要组分构成：一种 Cas 内切酶（通常为 Cas9 或 Cas12a）和一条位点特异性的合成向导 RNA（sgRNA）⁵。Cas-RNP 可在目标位点产生双链断裂（DSB），该断裂可通过两种内在修复机制之一进行修复。非同源末端连接（NHEJ）修复机制具有易错性，通常在 DSB 周围产生多种插入或缺失（indels）。如果这些 indels 导致移码突变或蛋白质序列中出现提前终止，就可能对功能造成有害影响。另一种修复机制为同源定向修复（HDR），其利用在 DSB 位点两侧具有同源区域的供体模板来修复损伤。研究人员可利用 HDR 系统实现精确的基因组编辑。具体而言，他们可以共注射一种双链 DNA 供体构建体，其中包含预期的编辑序列以及与基因组中 DSB 位点两侧同源的区域。由于商业化生产的 CRISPR 组分在规模经济上的提升，对多个位点进行筛选以及开展大规模精确基因组编辑工作的门槛已显著降低。然而，在有....

方案

本研究遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的规定进行。实验方案已获得德克萨斯大学奥斯汀分校动物护理与使用委员会（AUP-2021-00254）的批准。

1. 为 CRISPR 诱变设计 sgRNA

1. 获取包含目标位点的外显子序列。
2. 设计一条合成的向导RNA（sgRNA），其原间隔序列邻近基序（PAM）位点需针对特定的Cas内切酶。
   1. 若共注射供体质粒，应设计sgRNA，使其预测切割位点尽可能靠近目标编辑位置。
      注意：APE 是一款免费软件，带有用于查找 Cas9 sgRNA 位点的工具¹¹或者，也可以使用诸如 CHOPCHOP 之类的工具，该工具提供在线界面，可用于设计 sgRNA，并兼顾 Cas9 及其他 Cas 核酸酶的不同 PAM 位点¹².
3. 设计上下游引物以扩增CRISPR/Cas切割位点周围的区域。PCR产物长度应约为200-400个碱基对（bp），以便在后续实验步骤中通过凝胶电泳分辨出小的插入或缺失（indel）。
   注意：CHOPCHOP¹¹ 自动为其输出的每个sgRNA设计引物。
4. 可选：设计含有目标编辑的DNA供体....

结果

本方案中描述的实验方法可通过分析从F0代显微注射雄性精子中获得的数千个基因组，更快地鉴定基因组编辑或推测的有害等位基因。图2展示了如何解读使用本方案获得的结果。

为了在p2ry12基因座中引入突变，将Cas9内切酶和特异性针对p2ry12的sgRNA注射到单细胞期的斑马鱼胚胎中（图2B，灰色高亮区域）。将F0代注射后的鱼饲养至性成熟，并从六条单独的雄鱼中收集精子。使用高温和碱性条件（HotSHOT法DNA提取）从精子样本中提取DNA，并在PCR扩增p2ry12基因座之前进行中和处理。PCR产物在高浓度（4%）琼脂糖凝胶中以高电压（150 V）电泳分离1.5小时。在此示例中，野生型扩增片段在凝胶上表现为一条明亮的单一DNA条带，长度约为250个碱基对（图2C；WT）。相比之下，含有插入或缺失（indel）的F0代注射雄鱼的扩增产物在凝胶上表现为多条带（<.......

讨论

本方案描述了一种利用CRISPR-Cas技术，通过聚焦分析F0代雄性个体的精子基因组，快速鉴定潜在基因组编辑或靶向突变的方法。该方案适用于其他可非致死性采集精子样本的动物模型。该方法可提高对目标编辑的筛选通量，尤其有助于识别罕见的HDR介导的基因敲入事件。此外，该方法通过快速筛查单个潜在F0代携带者一份精子样本中可能存在的数千个基因组，显著减少了为获得稳定生殖系编辑所需使用的实验动物数量，相比之下，传统方法则可能需要对来自潜在F0代携带者杂交产生的数百个胚胎逐一进行筛选。

本方案在已有斑马鱼精子采集方案的基础上，增加了一种利用高分辨率凝胶电泳鉴定生殖系编辑的可重复技术^{7,10,14,16,17,18}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖粉末	Fisher BioReagents	BP1356-100
繁殖用鱼缸	Carolina Biological	161937
BstNI 限制性内切酶	NEB	R0168S
Cas9 核酸内切酶	IDT	1081060
DNA 标准分子量标记，100 bp	Thermo Scientific	FERSM0241
dnah10 供体质粒构建体	Sigma-Aldrich	DNA 寡核苷酸管装；0.025 nM，标准脱盐纯化，干燥。 供体链在 5'’ 和 3'’ 末端的前三个磷酸键处均含有硫代磷酸键（5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3'）
dnah10 正向引物	Sigma-Aldrich	DNA 寡核苷酸管装；0.025 nM，标准脱盐纯化，干燥（5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3'）
dnah10 反向引物	Sigma-Aldrich	DNA 寡核苷酸管装；0.025 nM，标准脱盐纯化，干燥（5'-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3'）
dnah10 合成 sgRNA	Synthego	合成 sgRNA，靶序列：5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'
电泳电源	Thermo Scientific	105ECA-115
滤膜镊子	Millipore	XX6200006P
鱼（系统）用水	通用	n/a
凝胶电泳系统（包括制胶架、梳子和电泳槽）	Thermo Scientific	B2
凝胶成像灯箱	Azure Biosystems	AZI200-01
凝胶染色液，10000 倍浓缩液	Invitrogen	S33102
玻璃烧杯，250 mL	通用	n/a
隔离用鱼缸，0.8 L	Aquaneering	ZT080
带橡胶头的微量毛细管，20 µL	Drummond	1-000-0020/CA
微型离心机	Bio-Rad	12011919EDU
移液器，多种规格及配套吸头	通用	n/a
微波炉	通用	n/a
无核酸酶水	Promega	P119-C
纸巾	通用	n/a
PCR 管，0.2 mL	Bioexpress	T-3196-1
带孔/槽的塑料勺	通用	n/a
KCl 溶液，0.2 M，无 RNA 酶	Sigma-Aldrich	P9333
p2ry12 正向引物	Sigma-Aldrich	DNA 寡核苷酸管装；0.025 nM，标准脱盐纯化，干燥（5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3'）
p2ry12 反向引物	Sigma-Aldrich	DNA 寡核苷酸管装；0.025 nM，标准脱盐纯化，干燥（5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3'）
p2ry12 合成 sgRNA	Synthego	合成 sgRNA，靶序列：5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3'
限制性内切酶 10X 缓冲液	NEB	B6003SVIAL
NaOH 溶液，50 mM	Thermo Scientific	S318; 424330010
海绵，1 英寸 × 1 英寸，带小椭圆形凹槽	通用	n/a
体视显微镜	Zeiss	Stemi 508
Taq 聚合酶预混液，2X	Promega	M7122
TBE 缓冲液浓缩液，10X	VWR	E442
PCR 仪	Bio-Rad	1861096
组织纸	Fisher Scientific	06-666
三卡因甲磺酸盐溶液（Syncaine，MS-222），鱼水中浓度 0.016%（pH 7.0±0.2）	Syndel	200-266
Tris 碱，1M（用 HCl 调节至 pH 8.0）	Promega	H5131