高效液相色谱联用化学指纹图谱进行多模式识别以鉴定真伪 威灵仙茎

摘要

本文介绍了一种建立高效液相色谱法（HPLC）并结合化学指纹多模式识别的方法，为有效鉴别正品药材品种提供了新策略 威灵仙茎 及其掺杂物。

摘要

一种通过利用中国药材及其相关掺伪品的鉴定方法被建立 威灵仙茎 以川木通（一种普遍使用的中药）为例，采用高效液相色谱（HPLC）指纹图谱结合化学计量学方法（包括聚类分析（CA）、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）），对10批正品川木通和5批相关伪品进行了分析与比较。同时测定了β-谷甾醇的含量。建立了川木通的对照化学指纹图谱，共标定出12个共有峰。10批正品川木通样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度为0.910–0.989，而5批伪品的相似度仅为0.133–0.720。基于色谱图中的共有峰，通过PCA将15批样品划分为三个含量层级，通过CA聚为四类，实现了正品川木通与川木通伪品的清晰区分。进一步通过OPLS-DA筛选出7种可有效鉴别正品川木通与伪品川木通的差异性成分。10批正品川木通中β-谷甾醇含量为97.53–161.56 µg/g，而5批伪品中β-谷甾醇含量差异较大，其中伪品的β-谷甾醇含量为 Clematis peterae Hand.-Mazz. 和 Clematis gouriana Roxb. 变种 finetii Rehd. et Wils. 显著低于正品川木通的含量。本研究建立的高效液相色谱指标成分含量测定与化学指纹图谱多模式识别方法，为有效鉴别正品中药材及相关伪品提供了新策略。

引言

川木通是毛茛科植物小木通（Clematis armandii Franch.）或绣球藤（Clematis montana Buch.-Ham.）的干燥藤茎，是一味临床上常用的中药^1,2,3。其主要用于治疗湿热所致的泌尿系统疾病、水肿、口舌生疮、乳汁分泌不足、关节僵硬及肌肉疼痛等症状⁴。川木通 traditionally 采自野生资源，主要分布于中国西南地区，尤以四川产者品质最佳^5,6。由于其与近缘混伪品在形态特征上极为相似，鉴别难度较大^7,8,9,10。2020年版《中国药典》对川木通的质量标准仅规定了性状、显微鉴别和薄层鉴别，未设立含量测定项目，难以有效鉴别混伪品，存在一定的用药安全隐患。此外，目前关于川木通及其相关植物的系统比较与鉴别研究报道较少。因此，建立能够确保川木通药材真实性的质量控制....

方案

1. 化学指纹检测方法

1. 色谱条件
   1. 配制乙腈（A）/水（B）流动相。在高效液相色谱仪软件中设置如下梯度程序：0–20 分钟，3%A–10%A；20–25 分钟，10%A–13%A；25–65 分钟，13%A–25%A；65–75 分钟，25%A–40%A；75–76 分钟，40%A–3%A；76–85 分钟，3%A–3%A。
   2. 保持流动相流速为 1.0 mL/min。
   3. 在 C18 色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm）上进行色谱分离，柱温维持在 30 °C。
   4. 设定进样体积为 10 µL。
   5. 在 205 nm 波长下检测样品。
      注：有关色谱条件的具体设置，请参阅高效液相色谱仪工作软件的操作规程（材料表）。
2. 样品溶液的制备
   1. 将原料通过内径为 850 µm ± 29 µm 的尼龙筛网研磨，使其颗粒大小均匀。
   2. 准确称取 2 g 研磨后的原料，置于带塞的 50 mL 锥形瓶中，加入 50 mL 甲醇。盖紧瓶塞后，超声处理（600 W，40 kHz）30 分钟。
   3. 随后将锥形瓶冷却至室温（RT）。再次称量样品，并通过补加损失的提取剂使重量恢复至初始值。
   4. 取 4 mL 含药材提取物的甲醇溶....

结果

川木通的色谱指纹图谱及相似度分析（SA）
精密度、重复性和稳定性的相对保留时间RSD值分别低于0.46%、1.65%和0.53%；相对峰面积的RSD值分别低于4.23%、3.56%和3.96%。如图1A、B所示，在10批正品川木通样品的HPLC指纹图谱中，共有12个明显共有峰（从峰1至峰12）。由于10号峰的峰面积相对较大，且分离度良好，同时为各批次样品中均存在的成分，因此被选作参照峰，用于考察指纹图谱的稳定性和重现性。随后以10号峰作为参照峰（S），计算其余11个峰的相对保留时间。

在相似性分析中，相关系数越接近1，表明样品之间的相似性越高。表1显示，10批川木通的相似度为0.910–0.989。结果表明，这10批川木通具有较高的相似性和良好的一致性，可用于评价川木通的整体质量。图1C显示了其5批伪品的指纹图谱。5批伪品指纹图谱与川木通对照指纹图谱的相似.......

讨论

用于研究的样品采集是构建多模式识别以鉴定中药材真伪的第一步关键环节。通过市场调研发现，四川雅安、凉山和乐山是川木通野生资源的主要产区。同属相关品种也具有相同的地理分布^6,20；常有将CC、DC、DE、XS和SMT误作川木通使用的情况^16,21；因此，本研究在上述产地采集了10批正品川木通和5批混伪品样本，并对品种的准确性进行了确认。

第二个关键步骤是筛选高效液相色谱（HPLC）指纹图谱的检测条件，以尽可能多地展示化学成分的信息。本研究中，如补充图1所示，在不同的制备条件下（包括提取方法、提取溶剂和提取时间）获得了色谱峰的数量和峰面积，从而确定了川木通样品溶液的最佳制备方法。另一方面，比较了样品在不同色谱条件下的色谱峰数量和分离度。考察了流动相体系，如乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.5%乙酸溶液、乙腈-纯水、乙腈-0.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸	Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., 天津, 中国	2017381038
乙腈	Sigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., 上海, 中国	WXBD5243V
β-谷甾醇	美赛生物技术有限公司, 重庆, 中国	20210201
C18色谱柱	越旭材料科技有限公司, 上海, 中国	Welch Ultimate LP
川木通	国强中药饮片有限公司, 四川, 中国	19020103	CMT-1
川木通	洪雅瓦屋山药业有限公司, 四川, 中国	200701	CMT-2
川木通	宏浦药业有限公司, 四川, 中国	200701	CMT-3
川木通	宏浦药业有限公司, 四川, 中国	200901	CMT-4
川木通	新仁泰药业有限公司, 四川, 中国	210701	CMT-5
川木通	浩博药业有限公司, 四川, 中国	210401	CMT-6
川木通	新仁泰药业有限公司, 四川, 中国	200901	CMT-7
川木通	五胜药业集团有限公司, 四川, 中国	201201	CMT-8
川木通	利民中药饮片有限公司, 四川, 中国	201001	CMT-9
川木通	玉和堂药业有限公司, 四川, 中国	210501	CMT-10
银叶铁线莲（Levl. et Vant.）W. T. Wang	中国四川省天全县三郎乡马子桥	-	CC
茴香叶铁线莲变种钝齿茴香叶铁线莲 Rehd. et Wils.	中国四川省洪雅县七里坪乡黑林村	-	DC
彼得铁线莲 Hand.-Mazz.	中国四川省汉源县黄木乡黄木村	-	DE
古氏铁线莲 Roxb. 变种 费氏铁线莲 Rehd. et Wils	中国四川省峨眉县黄湾乡混合岗山	-	XS
费氏铁线莲 Levl. et Vaniot.	中国四川省峨眉县黄湾乡万年村	-	SMT
电子天平	上海豪庄衡平科学仪器有限公司,  中国	FA1204
麦角甾醇	美赛生物技术有限公司, 重庆, 中国	20210201
乙醇	科龙化工有限公司, 成都, 中国	2021112602
乙酸乙酯	致远化学试剂有限公司, 天津, 中国	2017042043
甲酸	科龙化工有限公司, 成都, 中国	2016062901
高效液相色谱	Agilent, 美国	1260
IBM SPSS Statistics 26.0 版	国际商业机器公司, 美国	-
甲醇	Sigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., 上海, 中国	WXBD6409V
甲醇	科龙化工有限公司, 成都, 中国	202010302
正丁醇	致远化学试剂有限公司, 天津, 中国	2020071047
石油醚	致远化学试剂有限公司, 天津, 中国	2020090125
磷酸	科密欧化学试剂有限公司, 天津, 中国	20200110
SESCF-TCM 2012 版	中国国家药典委员会	-	http://114.247.108.158:8888/login
豆甾醇	美赛生物技术有限公司, 重庆, 中国	20210201
三氯甲烷	国药集团化学试剂有限公司, 上海, 中国	20200214
Umetrics SIMCA 14.1.0.2047 版	Umetrics, 瑞典	-	https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download
超纯水机	优普超纯科技有限公司, 四川, 中国	UPH-II-10T
超声波清洗器	昆山合创超声仪器有限公司, 江苏, 中国	KH3200E