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研究Stentor coeruleus中的习惯化现象

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DOI：

10.3791/64692

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2023年1月6日

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of California San Francisco

本文内容

摘要

我们介绍一种利用与微控制器板连接的装置来定量测定喇叭虫（Stentor）习惯化的方法，该装置能够以指定的力度和频率施加机械脉冲。同时，我们还提供了该装置的组装方法以及实验设置方案，以最大限度地减少外界干扰。

摘要

学习通常与复杂的神经系统相关，但越来越多的证据表明，从单细胞到多细胞生物，所有生命层次都可能表现出智能行为。在自然系统和人工系统中，学习是指系统参数根据新信息进行适应性更新的过程，而智能则是促进学习的计算过程的一种度量。Stentor coeruleus 是一种生活在池塘中的单细胞生物，能够表现出习惯化现象，即在重复刺激后行为反应逐渐减弱的一种学习形式。Stentor 在受到机械刺激时会发生收缩，这显然是一种逃避水生捕食者的反应。然而，反复施加低强度扰动会诱导其产生习惯化，表现为收缩概率逐步降低。本文介绍了一种利用与微控制器板连接的装置定量测定Stentor习惯化的方法，该装置可按设定的力和频率施加机械脉冲，并包括装置的构建方法以及实验设置方案，以最大限度减少外界干扰。与以往用于机械刺激Stentor的方法相比，该设备可在单次实验过程中通过计算机控制调节刺激强度，从而显著增加可应用的输入序列种类。在单细胞水平上理解习惯化现象，将有助于阐明不依赖复杂神经回路的学习范式。

引言

学习通常与复杂的神经系统相关，但越来越多的证据表明，从单细胞到各种生命层次均能表现出智能行为。在自然系统和人工系统中，学习是指系统参数根据新信息进行的适应性更新1，而智能则是促进学习的计算过程的一种度量2。

Stentor coeruleus 是一种生活在池塘中的单细胞生物，能够表现出习惯化现象，即在重复刺激后行为反应逐渐减弱的一种学习形式3. 喇叭虫 在机械刺激下发生收缩3，这是对水生捕食者的一种明显逃避反应。然而，重复的低强度扰动会诱导习惯化，表现为收缩反应概率逐渐降低3. 习惯化后的 喇叭虫 在受到高强度机械刺激后仍会收缩4 或光刺激5这些观察结果与汤普森（Thompson）和斯宾塞（Spencer）提出的动物习惯化经典标准相一致6强烈表明原始的收缩反应减弱是由于学习所致，而非疲劳或ATP耗竭。作为一种自由生活的细胞， 喇叭虫 可以不受周围细胞的显著干扰而进行研究，这与多细胞组织中的情况不同。其他多个特点也使得 喇叭虫 一个适用于学习研究的可操作体系：其较大的体型（1 mm）及其可量化的习惯化反应3注射与显微操作的便捷性7，已完全测序的基因组8，以及RNA干扰（RNAi）工具的可获得性9. 利用该模式生物研究无大脑或神经系统条件下的细胞学习，需要一种可重复的刺激方法 喇叭虫 细胞并测量其反应。

本文介绍了一种利用与微控制器板连接的装置定量测定喇叭虫（Stentor）习惯化的方法，该装置可按指定的力度和频率施加机械脉冲，并包括装置的构建方法以及以最小化外界干扰的方式设置实验的步骤（图1）。在单细胞水平上理解习惯化现象，将有助于表征不依赖复杂神经回路的学习范式。

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图1：习惯化实验装置示意图。 含有Stentor的培养皿放置在习惯化装置的柔性金属尺上方。习惯化装置的衔铁以特定的力度和频率敲击金属尺，从而在细胞视野中产生刺激波。USB显微镜摄像头记录Stentor对刺激的反应。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：习惯化实验工作流程概要。 该图展示了使用习惯化装置研究Stentor的基本步骤。本图使用BioRender.com制作。改编自BioRender.com（2022）的“流程图模板”。检索自 https://app.biorender.com/biorender-templates。 请点击此处查看此图的放大版本。

方案

注意：习惯化实验工作流程的摘要见图2。

1. 组装习惯化装置

  1. 将电机驱动器连接到电机（见图3）。
    1. 将驱动板上标有 A 的两根导线连接到电机的蓝色和红色导线上。将驱动板上标有 B 的两根导线连接到电机的绿色和黑色导线上。
      注意：从上方俯视驱动板，电机导线位于顶部时，四根输入导线应按以下顺序连接至电机引线：蓝色、红色、黑色、绿色。
  2. 搭建如图4所示的面包板电路，特别注意将LED以正确的极性连接。
  3. 将驱动板的 Vcc（+5 V）连接到白色面包板的顶部电源轨，将驱动板的 Gnd 连接到面包板的底部电源轨。
  4. 将面包板的地线连接到微控制器板的接地引脚。将绿色LED、红色LED、开关和按钮的导线分别连接到微控制器板的数字引脚8、9、10和11。
  5. 将微控制器板的数字引脚2和3分别连接到驱动板的 Step 和 Dir 导线。
  6. 将微控制器板的数字引脚4、5、6和7连接到驱动板的导线。
    1. 将引脚4连接至MS1，引脚5连接至MS2，引脚6连接至MS3，引脚7连接至Enable。
  7. 使用12 V电源为驱动板供电。将12 V电源插入通过两根红色导线连接至电机驱动板的黑色/绿色适配器插头。
    ​注意：切勿将12 V电源插入微控制器板的插口。
  8. 将控制程序（https://github.com/WallaceMarshallUCSF/StentorHabituation/blob/main/stentor_habituator_stepper_v7.ino） 下载到微控制器板上。
  9. 使用USB线缆将微控制器板连接至计算机，该计算机也将作为微控制器板的电源。
  10. 检查用户控制功能是否正常。
    1. 确认滑动开关可开启和关闭自动模式。在自动模式下，系统将按照用户设定的固定时间间隔执行步进操作（见下文）。
    2. 检查自动模式开启时绿色LED是否亮起。
    3. 检查在电机施加脉冲前1秒红色LED是否闪烁。红色LED为预警灯，用于提示系统即将施加机械脉冲。
    4. 测试红色按钮，每次按下该按钮时，无论系统是否处于自动模式，均会触发一次1/16微步。

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图3：适应性装置的组成部分。 所有标注的电子元件均为组装该设备所必需。请点击此处查看该图的放大版本。

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图 4：电子电路图。 这是面包板上的电路。连接到微控制器板的导线编号如实验方案中所述。D1 和 D2 分别为红色和绿色发光二极管（LED），并通过 330 Ω 电阻连接至接地端。两个开关通过 10 KΩ 电阻上拉。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 建立习惯化实验

  1. 获取 喇叭虫.
  2. 用0.01%多聚鸟氨酸溶液包被35 mm培养皿。
    1. 加入3 mL 0.01%多聚鸟氨酸溶液至培养板中，过夜放置。
    2. 用超纯水洗涤平板两次，再用巴氏灭菌的泉水（PSW）洗涤一次（材料表).
  3. 向35 mm培养皿中加入3.5 mL PSW。
  4. 洗涤 喇叭虫 在6孔板中（材料表).
    1. 向第一个孔中加入 3 mL PSW，向第二和第三个孔中各加入 5 mL PSW。使用 P1,000 移液器加入 2 mL 喇叭虫 从培养皿转移到6孔板的第一个孔中。
    2. 识别个体 喇叭虫 使用体视显微镜（材料表）然后使用 P20 移液器转移 100 喇叭虫 从第一个孔转移到第二个孔。
    3. 识别个体 喇叭虫 使用体视显微镜观察，然后用P20移液器转移100 喇叭虫 从第二个孔转移到第三个孔。
  5. 使用 P200 移液器转移 100 喇叭虫 在总体积为 500 µL 从6孔板的第三孔转移至35 mm培养皿，使35 mm培养皿中的终体积为4 mL。
  6. 将一张（7 cm × 7 cm）的白纸粘贴至习惯化装置的金属尺上，确保白纸左侧边缘距离靠近衔铁一端的尺端 2 cm。
  7. 使用双面胶带将35 mm培养皿底部粘附于驯化装置上尺子顶端的2英寸×2英寸纸张中央。
  8. 将35 mm培养板置于驯化装置中至少2小时（可延长至过夜），并保持盖子关闭。在整个适应期间，确保培养板处于与实验条件一致的环境光照下（即，避免细胞受到明暗波动的影响）。此外，需确保培养板不受任何因意外晃动造成的机械扰动。
  9. 将USB显微镜摄像头居中放置（材料表35 mm 培养皿正上方 喇叭虫如有需要，可在通用串行总线（USB）显微镜摄像头下方放置一个支撑物（如移液器吸头盒）以调节高度；也可使用铁架台调节高度。
  10. 在笔记本电脑上安装网络摄像头录像应用程序（材料表）并用其对细胞进行可视化观察 通过 显微镜输入。
    1. 打开网络摄像头录像应用程序，从下拉菜单中选择USB显微镜。调节USB显微镜摄像头的焦距，使细胞清晰可见。
    2. 调整USB显微镜相机的位置，以使视野中的细胞数量最大化。
  11. 打开微控制器板串行监视器：选择 无行尾 并将其设置为 9,600 波特。
  12. 使用 l 在微控制器板程序中发出指令，使电枢下降至恰好接触尺子。使用 r 必要时发出指令以抬高手臂，调整至准确位置。
    注意：如果电枢距离标尺较远，请输入 d 禁用电机线圈电流的指令，以便手动将机械臂移向标尺。手动移动机械臂后，使用 e 启用电机线圈电流并保持机械臂锁定在当前位置的指令。在实验开始前，若机械臂已正确下降，则其底部末端应距离标尺左边缘1 cm。机械臂通过撞击标尺来传递机械脉冲。
  13. 使用 i 启动习惯化装置自动模式的指令。
  14. 在命令行中输入步长。5级为最小步长，1级为最大步长。基线习惯化实验采用4级步长。
    注意：5级刺激导致圆规向下位移约0.5 mm；4级刺激导致向下位移约1 mm；3级刺激导致向下位移约2 mm；2级刺激导致向下位移约3–4 mm；1级刺激导致向下位移约8 mm。5级刺激产生的衔铁对圆规的向下峰值力约为0.122 N；4级刺激产生的向下峰值力约为0.288 N；3级刺激产生的向下峰值力约为0.557 N。由于衔铁接触圆规后会引起明显的振动，1级和2级刺激所产生的向下作用力难以通过测力计进行精确量化。
  15. 输入脉冲之间的时间间隔（单位：分钟）。基线习惯化实验所用的时间间隔为 1 min。
  16. 点击红色录制按钮，使用网络摄像头录制应用程序开始录制视频。然后，拨动适应装置上的开关，启动实验并进行第一次自动机械脉冲递送。

3. 分析实验视频

  1. 在视频中首次出现机械脉冲之前，暂停并计数固定在35 mm培养皿底部且呈伸长、喇叭状形态的Stentor数量（图5A，视频1）。
  2. 在首次脉冲之后立即计数固定在培养皿底部并收缩成球状形态的Stentor数量（图5B，视频1）。
    注意：收缩的细胞与伸长的细胞易于区分，因为在收缩事件中，Stentor的体长在10 ms内缩短超过50%3。
  3. 将第二次计数结果除以第一次计数结果，以确定对机械刺激产生收缩反应的Stentor所占比例。
  4. 对实验视频中的所有机械脉冲重复步骤3.1–3.3。

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图5：Stentor 在受到机械刺激后发生收缩。（A）Stentor 处于伸长状态，并附着在培养皿底部。（B）Stentor 在接受来自习惯化装置的4级机械刺激后发生收缩。图像由USB显微镜拍摄。请点击此处查看该图的放大版本。

视频 1：视频 喇叭虫 收缩。 该 喇叭虫 每隔一分钟，细胞会从习惯化装置接收到一次4级机械刺激。这些细胞尚未产生习惯化，因此在接收到脉冲后会发生收缩。细胞置于培养皿中，培养皿放置在习惯化装置上方。 请点击此处下载该视频。

结果

上述方法采用4级机械脉冲，频率为每分钟1次敲击，应在1小时内导致喇叭虫（Stentor）收缩概率逐渐降低。这表明已产生习惯化现象（见图6、视频2）。

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图6：基线习惯化。 在以每分钟1次的频率施加4级机械脉冲后，Stentor 的收缩概率在1小时内逐渐下降（n = 22–27）。请点击此处查看该图的放大版本。

视频 2. 已习惯化的Stentor视频。 细胞在持续接受每分钟 1 次、相同强度的机械脉冲刺激 1 小时后，再接受一次 4 级机械刺激。大多数细胞在此 1 小时内已对刺激产生习惯化，因此不再发生收缩。请点击此处下载该视频。

改变机械脉冲施加的力度和/或频率可以改变Stentor的习惯化动态。例如，使用2级脉冲以每分钟1次的频率刺激，在1小时内可阻止习惯化的发生（见图7）。5级脉冲应仅引发极少或不引发Stentor的收缩。

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图7：较强刺激下1小时内未出现习惯化现象。 在以每分钟1次的频率施加2级机械脉冲后，Stentor 的收缩概率在1小时内未出现明显下降（n = 7–33）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

该实验方案中最关键的步骤是确保 Stentor 处于有利于收缩发生的最佳状态。在习惯化实验中，Stentor 的收缩反应要求其通过黏性固着器锚定在表面，因为当它们自由游动时很少发生收缩。然而，用于习惯化实验的35 mm培养皿底部通常不利于锚定，除非其表面已用多聚鸟氨酸包被。此外，在习惯化实验开始前至少2小时内，Stentor 不能受到任何机械扰动，因为 Stentor 的遗忘时间尺度为2–6小时3。如果在实验开始前2小时内对 Stentor 施加了机械刺激，则有可能导致其在实验前已产生一定程度的习惯化，从而降低习惯化装置施加第一次机械脉冲后的收缩概率。最后，在分析阶段，应仅统计在脉冲刺激后发生收缩的 Stentor 数量，而不应计入脉冲施加前偶然发生的自发性收缩，以准确读取对机械刺激产生收缩反应的细胞比例。

通过改变习惯化装置所传递的机械脉冲的力度和频率，该方案可轻松修改以研究不同类型的习惯化动态。这还为探索其他类型的学习行为（例如可能在Stentor中发生的感觉敏化）提供了机会。此外，微控制器板的程序代码本身也可进行调整，以向Stentor施加不同模式的机械刺激。

该实验方案可能遇到的一个问题是Stentor附着频率较低，这可能会限制习惯化实验中可观察的Stentor数量。在未及时喂食或受到污染的Stentor培养物中，附着频率有时会降低。为解决此问题，应清洗一批新鲜的Stentor以建立新的培养物，并按照Lin等10所述的方案定期喂食。

该方案的局限性在于每次只能测试一块Stentor培养板，导致通量相对较低。此外，目前的软件尚不支持单细胞图像分析的自动化。因此，大多数获取的数据均为群体水平的结果。未来版本的习惯化装置及图像分析工具可能有助于实现高通量的单细胞实验。

先前对喇叭虫（Stentor）的 Habituation（习惯化）研究采用的是 Wood 所描述的方法3，而本新方案可实现实验的自动化。自动化不仅使研究人员能够可重复地施加特定强度和频率的机械刺激，还便于开展长期的习惯化实验，因为该装置可在无人监管的情况下连续运行数天。此外，本方案使用步进电机而非 Wood 实验中使用的电磁铁3，从而降低了长期使用中磁性减弱的风险，并可在单次实验过程中灵活调节刺激强度。

研究细胞的适应现象可能为临床提供新的见解，例如在适应功能受损的注意缺陷多动障碍（ADHD）和抽动秽语综合征等疾病中11。Stentor 的适应机制还可能揭示不依赖复杂细胞回路的新型非突触学习范式。最后，关于单细胞学习的研究发现可能启发人们开发对多细胞组织内细胞进行重编程的新方法——这可能是对抗疾病的另一潜在途径。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Tatyana Makushok 就 Stentor 学习问题进行的无数次讨论。本工作由美国国家科学基金会资助项目 MCB-2012647、美国国立卫生研究院资助项目 R35 GM130327，以及 Foundation Fourmentin-Guilbert 基金会的 I2CELL 奖项资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.01% 多聚鸟氨酸 Millipore SigmaP4957用于包被培养皿
35 mm 培养皿Benz Microscope Optics Center Inc.L331实验过程中容纳喇叭虫
6 孔板StemCell Technologies38016用于清洗喇叭虫
铝制光学平台，4" × 24" × 1/2"（1 件）ThorlabsMB424用于构建习惯化装置
Big easy driver 步进电机驱动板（1 件）SparkfunROB-12859用于构建习惯化装置
导轨，1" × 5''（2 件）NewportNewport CR-1用于构建习惯化装置
笔记本电脑Apple Storehttps://www.apple.com/macbook-air-m1/将笔记本电脑连接至USB显微镜以观察实验过程
大型直角支架（1 件）ThorlabsAP90RL用于构建习惯化装置
微控制器板ArduinoA000066用于控制习惯化装置
Nema 17 两相步进电机 59 N·cm 2 A 84 oz·in 48 mm 4 线引出 Stepperonline.com5-17HS19-2004S1用于构建习惯化装置
巴氏灭菌的泉水Carolina132458喇叭虫实验的培养介质
直角支架（3 件）ThorlabsAP90用于构建习惯化装置
Stemi 2000 体视显微镜Zeiss用于在清洗步骤中观察喇叭虫
Stentor coeruleusCarolina131598用于习惯化实验的细胞
USB 显微镜Celestron44308用于观察和记录实验过程
网络摄像头录像软件Apple Storehttps://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12安装此应用程序以录制实验视频

参考文献

  1. Dussutour, A. Learning in single cell organisms. Biochemical and Biophysical Research Communications. 564, 92-102 (2021).
  2. Sternberg, R. J. Intelligence. Dialogues in Clinical Neuroscience. 14 (1), 19-27 (2012).
  3. Wood, D. C. Parametric studies of the response decrement produced by mechanical stimuli in the protozoan, Stentor coeruleus. Journal of Neurobiology. 1 (3), 345-360 (1969).
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  6. Thompson, R. F., Spencer, W. A. Habituation: A model phenomenon for the study of neuronal substrates of behavior. Psychological Review. 73 (1), 16-43 (1966).
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  8. Slabodnick, M. M., et al. The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell. Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).
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  10. Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. Methods for the study of regeneration in Stentor. Journal of Visualized Experiments. (136), e57759(2018).
  11. McDiarmid, T. A., Bernardos, A. C., Rankin, C. H. Habituation is altered in neuropsychiatric disorders-A comprehensive review with recommendations for experimental design and analysis. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 80, 286-305 (2017).

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USB

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