孔雀石绿检测方案是一种简单且经济高效的方法，可用于发现热休克蛋白90（Hsp90）抑制剂以及其他针对ATP依赖性酶的抑制化合物。
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本文内容
摘要
摘要
热休克蛋白90（Hsp90）是一个有前景的抗癌靶点，因为它对多种致癌蛋白具有分子伴侣作用。Hsp90的活性依赖于其将三磷酸腺苷（ATP）水解为二磷酸腺苷（ADP）和游离磷酸的能力。Hsp90的ATP酶活性与其分子伴侣功能密切相关；ATP可结合至Hsp90的N端结构域，而干扰该结合已被证明是抑制Hsp90功能最有效的策略。Hsp90的ATP酶活性可通过比色法的孔雀绿检测法进行测定，该方法可定量ATP水解所产生的游离磷酸量。本文描述了一种利用孔雀绿磷酸检测试剂盒测定酵母Hsp90 ATP酶活性的实验流程。此外，以格尔德霉素作为真实抑制剂为例，提供了发现Hsp90抑制剂的详细操作步骤。最后，讨论了该检测方法在针对酵母Hsp90的抑制剂分子高通量筛选（HTS）中的应用。
引言
热休克蛋白90（Hsp90）是一种分子伴侣，可维持与癌症发生和进展相关蛋白的稳定性。此外，介导抗肿瘤药物耐药性产生的蛋白也是Hsp90的客户蛋白1。与正常细胞相比（Hsp90可能占总蛋白的不到2%），Hsp90在所有类型的癌细胞中普遍存在过表达（>90%的细胞蛋白）。而且，癌细胞中的Hsp90与共伴侣蛋白形成复合物，而在正常细胞中则主要以游离、非复合状态存在2,3。近年来，多项研究表明，Hsp90抑制剂在体外（in vitro）和体内（in vivo）实验中均具有清除衰老细胞的作用，并显著延长了小鼠的寿命4,5,6。上述所有研究结果均证实，Hsp90抑制剂可能对多种癌症类型有效，且不良反应较少，产生耐药的可能性也较低。Hsp90的伴侣功能依赖于其N端结构域结合ATP，并将其水解为ADP和游离磷酸7。研究发现，能够竞争性结合Hsp90 ATP结合位点的小分子可成功抑制该蛋白的伴侣功能。迄今为止，这仍是抑制Hsp90最有效的策略，相关抑制剂已进入临床试验阶段的事实也支持了这一策略的有效性
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方案
1. 实验室规模孔雀石绿检测法
- 测定缓冲液的配制
- 根据表1中所示的组成和配制方法配制测定缓冲液。
- 磷酸盐标准品的配制
- 使用绿色孔雀石试剂盒（malachite green assay phosphate assay kit）中提供的1 mM磷酸盐标准品（储存于4 °C）。
- 取40 µL的1 mM磷酸盐标准品加入960 µL超纯水中，得到40 µM的磷酸盐溶液（预混溶液）。按照试剂盒说明书，将预混溶液用超纯水进行系列稀释，制备0至40 µM的磷酸盐梯度溶液。
- 酵母Hsp90的配制
- 使用浓度为0.66 mg/mL的酵母Hsp90甘油储备液。使用前置于冰上解冻。
- 取8 µL（5.98 µg，0.80 µM）酵母Hsp90用于检测ATP酶活性。确保在加入孔雀石绿试剂后，空白组与阳性对照组之间的光密度差值至少为0.5且小于1.0。本实验中，空白组（不含Hsp90）与阳性对照组（含Hsp90）的吸光度差值为0.510。
- ATP的配制
- 将1 mg ATP转移至含有453.39 µL超纯水的离心管中，配制成4 mM的储存液。计算时以无水ATP为准（分子量[m.w.] = 551....
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结果
实验结果通过游离磷酸根离子浓度引起的吸光度来解读。酵母Hsp90水解ATP后在620 nm处由游离磷酸根产生的吸光度被视为100% ATP酶活性，即0%的蛋白质抑制率。蛋白质活性受到抑制会导致ATP水解停止（游离磷酸根减少），从而表现为620 nm处吸光度的降低。
实验室规模孔雀石绿检测结果
磷酸盐标准品的标准曲线如图3所示。Hsp90的活性通过其将ATP水解为ADP和无机磷酸盐（Pi）的能力来测定。游离磷酸盐浓度越高，与孔雀石绿形成的复合物越多，从而在620 nm处产生明显的绿色，可被检测到（图4）。
抑制率按以下公式计算：
抑制率计算公式：
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讨论
Hsp90 是发现新型抗癌药物分子的重要靶点。自1994年其药物可开发性被证实以来10，已有18种分子进入临床试验。目前，有七种分子正处于不同阶段的临床试验中，单独使用或联合用药均有涉及22。所有这些小分子均为N端ATP结合抑制剂。其他抑制分子伴侣功能的策略（如C端抑制剂、中间结构域抑制剂）的发展速度不及N端抑制剂。因此，N端ATP结合抑制剂化合物仍具有发展为临床可用药物的潜力。此外，迄今为止唯一于2022年6月获批的Hsp90抑制剂（Pimitespib，用于日本胃肠道间质瘤的治疗）即为一种N端ATP结合分子9。然而，截至目前，尚无单一分子在世界其他地区达到可上市阶段23,24。导致这一失败的主要原因包括制剂问题、分子生产成本，以及部分化合物相关的耳毒性与心脏毒性等毒副作用。为克服这些不良反应，目前正探索Hsp90 N端选择性抑制剂（α和β亚型）
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致谢
本研究由韩国国家研究基金会（NRF）的韩国研究奖学金（KRF）项目资助，该奖学金为博士后研究员项目，由韩国科技部资助 & ICT（NRF-2019H1D3A1A01102952）。作者感谢KIST机构内部资助以及海洋与渔业部资助项目编号2MRB130为本项目提供的财政支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 M 氯化镁水溶液 | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1 M 氯化钾水溶液 | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96孔板 | SPL Life Sciences | 不适用 | |
| 腺苷5′′三磷酸二钠盐水合物 | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX 实验室自动化工作站 | 贝克曼库尔特 | 不适用 | |
| 化合物 3-96 | 不适用 | 不适用 | 组氨酸标签酵母Hsp90由英国萨塞克斯大学生命科学学院Chrisostomos Prodromou博士提供，该蛋白在韩国科学技术院（KIST）江陵天然产物研究所表达。由于专利侵权问题，相关细节无法披露。 |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 格尔达霉素，99%（HPLC），粉末 | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure 无DNase/RNase纯水 | 赛默飞世尔科技 | 10977015 | |
| 孔雀石绿磷酸盐测定法 检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| 多功能微孔板读板仪 Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | 不适用 | |
| Synergy HT 多功能酶标仪 | Biotek Instruments, Inc. | 不适用 | |
| Trizma 盐酸盐缓冲液，pH 7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| 酵母Hsp90 | 不适用 | 不适用 | 英国萨塞克斯大学生命科学学院，蛋白质在韩国科学技术院江陵天然产物研究所表达。主要登录号：P02829 |
参考文献
- Workman, P. Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone. Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).
- Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: e....
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重印与许可
