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方法文章

孔雀石绿测定法用于发现热休克蛋白90抑制剂

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DOI：

10.3791/64693

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2023年1月20日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Gangneung Institute of Natural Products, Korea Institute of Science and Technology (KIST), 2School of Life Sciences, University of Sussex

本文内容

摘要

孔雀石绿检测方案是一种简单且经济高效的方法，可用于发现热休克蛋白90（Hsp90）抑制剂以及其他针对ATP依赖性酶的抑制化合物。

摘要

热休克蛋白90（Hsp90）是一个有前景的抗癌靶点，因为它对多种致癌蛋白具有分子伴侣作用。Hsp90的活性依赖于其将三磷酸腺苷（ATP）水解为二磷酸腺苷（ADP）和游离磷酸的能力。Hsp90的ATP酶活性与其分子伴侣功能密切相关；ATP可结合至Hsp90的N端结构域，而干扰该结合已被证明是抑制Hsp90功能最有效的策略。Hsp90的ATP酶活性可通过比色法的孔雀绿检测法进行测定，该方法可定量ATP水解所产生的游离磷酸量。本文描述了一种利用孔雀绿磷酸检测试剂盒测定酵母Hsp90 ATP酶活性的实验流程。此外，以格尔德霉素作为真实抑制剂为例，提供了发现Hsp90抑制剂的详细操作步骤。最后，讨论了该检测方法在针对酵母Hsp90的抑制剂分子高通量筛选（HTS）中的应用。

引言

热休克蛋白90（Hsp90）是一种分子伴侣，可维持与癌症发生和进展相关蛋白的稳定性。此外，介导抗肿瘤药物耐药性产生的蛋白也是Hsp90的客户蛋白1。与正常细胞相比（Hsp90可能占总蛋白的不到2%），Hsp90在所有类型的癌细胞中普遍存在过表达（>90%的细胞蛋白）。而且，癌细胞中的Hsp90与共伴侣蛋白形成复合物，而在正常细胞中则主要以游离、非复合状态存在2,3。近年来，多项研究表明，Hsp90抑制剂在体外（in vitro）和体内（in vivo）实验中均具有清除衰老细胞的作用，并显著延长了小鼠的寿命4,5,6。上述所有研究结果均证实，Hsp90抑制剂可能对多种癌症类型有效，且不良反应较少，产生耐药的可能性也较低。Hsp90的伴侣功能依赖于其N端结构域结合ATP，并将其水解为ADP和游离磷酸7。研究发现，能够竞争性结合Hsp90 ATP结合位点的小分子可成功抑制该蛋白的伴侣功能。迄今为止，这仍是抑制Hsp90最有效的策略，相关抑制剂已进入临床试验阶段的事实也支持了这一策略的有效性8。其中一种药物Pimitespib已于2022年6月在日本获批用于治疗胃肠道间质瘤（GIST）9。这是自1994年确认该分子伴侣具有药物靶点潜力以来，首个获批的Hsp90抑制剂10。

孔雀石绿检测法是一种简单、灵敏、快速且经济的检测无机磷酸盐的方法，适用于针对特定靶点化合物的自动化和高通量筛选（HTS）11。该方法已成功应用于小规模实验室条件下以及高通量筛选中Hsp90抑制剂的筛选12,13,14,15,16,17。该检测利用比色法测定由Hsp90 ATP酶活性产生的游离无机磷酸盐。定量原理基于游离磷酸盐与钼酸盐形成磷钼酸复合物，该复合物进一步与孔雀石绿反应生成绿色产物（图1）。这种快速的颜色变化可在分光光度计或酶标仪上于600–660 nm波长范围内进行测定18,19。

本实验方案描述了利用孔雀绿法对酵母Hsp90进行检测，并进一步筛选针对该分子伴侣的抑制剂的操作步骤。以天然产物分子格尔达那霉素（geldanamycin, GA）作为已知的抑制剂对照，该分子最早证实了Hsp90具有可成药性10。由于可用于测试的化合物分子数量日益增多，高通量筛选（HTS）已成为当前药物发现项目中不可或缺的一部分。过去两年中，由于迫切需要对现有药物进行重新定位以治疗新冠病毒感染，该技术的重要性进一步凸显20,21。因此，本文详细介绍了采用孔雀绿法对酵母Hsp90蛋白进行小分子高通量筛选的具体流程。

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方案

1. 实验室规模孔雀石绿检测法

  1. 测定缓冲液的配制
    1. 根据表1中所示的组成和配制方法配制测定缓冲液。
  2. 磷酸盐标准品的配制
    1. 使用绿色孔雀石试剂盒（malachite green assay phosphate assay kit）中提供的1 mM磷酸盐标准品（储存于4 °C）。
    2. 取40 µL的1 mM磷酸盐标准品加入960 µL超纯水中，得到40 µM的磷酸盐溶液（预混溶液）。按照试剂盒说明书，将预混溶液用超纯水进行系列稀释，制备0至40 µM的磷酸盐梯度溶液。
  3. 酵母Hsp90的配制
    1. 使用浓度为0.66 mg/mL的酵母Hsp90甘油储备液。使用前置于冰上解冻。
    2. 取8 µL（5.98 µg，0.80 µM）酵母Hsp90用于检测ATP酶活性。确保在加入孔雀石绿试剂后，空白组与阳性对照组之间的光密度差值至少为0.5且小于1.0。本实验中，空白组（不含Hsp90）与阳性对照组（含Hsp90）的吸光度差值为0.510。
  4. ATP的配制
    1. 将1 mg ATP转移至含有453.39 µL超纯水的离心管中，配制成4 mM的储存液。计算时以无水ATP为准（分子量[m.w.] = 551.14）。ATP需现用现配，因其会随时间发生自发水解。
    2. 向每孔加入4 µL ATP储存液，使终浓度为0.2 mM（每孔总反应体积为80 µL）。ATP应在反应体系中最后加入，并使用多通道移液器同时加入所有孔，以确保所有反应同步开始。
  5. 格尔达那霉素（GA）的配制
    1. 将1 mg GA溶于178.37 µL DMSO中，配制成10 mM的储存液（分子量[m.w.] = 560.64）。使用该储存液通过逐级稀释法在DMSO中配制4 mM、0.8 mM、0.16 mM、0.032 mM、0.0064 mM和0.00128 mM的溶液。
    2. 向各孔中加入2 µL上述储存液，使终浓度分别为0.1 mM、0.02 mM、0.004 mM、0.0008 mM、0.00016 mM和0.000032 mM。
    3. 按照表2和表3所述设置各孔，其中空白组含缓冲液 + 水 + DMSO，阴性对照组含Hsp90缓冲液 + 水 + DMSO。含GA的孔（Hsp90缓冲液 + 水 + GA）作为阳性对照组。
  6. 微孔板的准备及加样顺序
    1. 按照表2所示布局准备96孔板。对于在620 nm处有吸收的化合物，应单独设置一孔用于记录该波长下的吸光度。GA无需单独设孔，因本实验所用浓度的GA在620 nm处无吸收。
    2. 根据表3中各组分的总体积分别配制各溶液。
    3. 首先向各孔中加入超纯水，随后加入所需量的测定缓冲液和化合物溶液（例如GA溶液）。
    4. 然后向相应孔中加入Hsp90，并在室温下于板式振荡器上振荡2分钟。
    5. 使用多通道移液器加入4 µL ATP溶液。用铝箔纸包裹微孔板，在室温下以200 rpm振荡2分钟。随后将微孔板在37 °C孵育3小时。
  7. 孔雀石绿试剂的配制与添加
    1. 孔雀石绿试剂由试剂A（3M HCl中的钼酸铵）和试剂B（孔雀石绿和聚乙烯醇）组成。使用前将试剂恢复至室温。将试剂A与试剂B按100:1的比例混合（1,000 µL:10 µL）。该混合试剂需在使用前3小时内配制，因其不稳定，超过3小时后开始分解。
    2. 在完成步骤1.6.5的3小时后，使用多通道移液器按照与ATP相同的加样顺序，向各孔加入20 µL孔雀石绿试剂以终止反应。
    3. 室温孵育15分钟后，在酶标仪中测定各孔在620 nm处的吸光度。

2. 通过孔雀绿法高通量筛选Hsp90抑制剂

注意：高通量筛选的实验方案与实验室规模的方法类似。在两种情况下，每个孔的最终体积均为 80 µL。然而，试剂添加顺序略有不同。在基于实验室规模的方法中，共有五个加样步骤（34 µL 水、32 µL 缓冲液、2 µL 溶于 DMSO 的化合物、8 µL Hsp90，最后加入 4 µL ATP 溶液）。相比之下，高通量筛选（HTS）包含三个加样步骤（40 µL 含酵母 Hsp90 的缓冲液、18 µL 水中含化合物的 2 µL DMSO 溶液，最后加入 20 µL 溶于水的 ATP 溶液）。在高通量筛选体系中，可准确移取的最小溶液体积为 20 µL。因此，实验室规模与高通量筛选在移液操作上存在差异。

  1. 测定缓冲液的配制（pH 7.4）
    1. 在高通量筛选（HTS）中使用与实验室规模的孔雀绿测定相同的缓冲液（表1）。
  2. 酵母Hsp90蛋白的配制
    1. 使用甘油储存浓度为0.66 mg/mL的蛋白。使用前置于冰上解冻。
    2. 每孔加入8 µL（5.98 µg，0.80 µM）酵母Hsp90，以获得可测量的ATP酶活性。
    3. 将蛋白（8 µL）用缓冲液（32 µL）稀释至每孔。每孔最终工作体积为40 µL，总反应体积为80 µL。
  3. 0.8 mM ATP的配制
    1. 将1 mg ATP溶解于2,267 µL蒸馏水中，配制成0.8 mM溶液。每孔总工作体积为20 µL，总反应体积为80 µL。
  4. 格尔达那霉素（GA）/测试化合物的配制
    1. 用DMSO配制0.8 mM的GA储备液，方法同步骤1.5。取10 µL GA储备液加入90 µL水中，得到终浓度为80 µM的溶液。
    2. 在相应的测定孔中加入20 µL 80 µM GA溶液（最终总反应体积 = 80 µL），使孔内终浓度为20 µM。此作为阳性对照。
    3. 对于测试化合物，根据其评估所需的浓度，用DMSO配制溶液。
    4. 将10 µL DMSO加入90 µL水中，用于空白孔（缓冲液 + 水 + DMSO）和阴性对照孔（Hsp90缓冲液 + 水 + DMSO）的添加。测试化合物也以类似方式配制，使孔内终浓度为100 µM。
  5. 测定板的设计与加样顺序
    1. 使用四块主反应板、一块化合物板以及四块含有试剂储备液的加样板进行实验设置（图2 和 表4）。
    2. 在加样板A中，每孔加入90 µL测定缓冲液；在加样板B中，每孔加入含Hsp90的缓冲液90 µL；在加样板C和D中，分别每孔加入90 µL ATP和90 µL孔雀绿试剂（表5 和 表6）。
    3. 使用自动化多通道分液系统，从加样板A和B中分别将每孔40 µL溶液转移至主反应板1和2、以及3和4（图2 和 表6）。本实验使用Biomek(R) FXP实验室自动化工作站。
    4. 从化合物板的每孔中转移20 µL溶液至主反应板1、2、3和4（图2）。在振荡器中以200 rpm振荡1分钟。
    5. 从加样板C（ATP）的每孔中转移20 µL溶液至主反应板1、2、3和4（图2）。在振荡器中以200 rpm振荡1分钟。
    6. 将反应板在37 °C孵育3小时。
    7. 按照步骤1.7配制孔雀绿试剂。孵育3小时后，从加样板D中将20 µL孔雀绿试剂转移至主反应板1、2、3和4的各孔中（图2）。
    8. 室温孵育15分钟后，在酶标仪中于620 nm波长处测定各孔的吸光度。

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结果

实验结果通过游离磷酸根离子浓度引起的吸光度来解读。酵母Hsp90水解ATP后在620 nm处由游离磷酸根产生的吸光度被视为100% ATP酶活性，即0%的蛋白质抑制率。蛋白质活性受到抑制会导致ATP水解停止（游离磷酸根减少），从而表现为620 nm处吸光度的降低。

实验室规模孔雀石绿检测结果
磷酸盐标准品的标准曲线如图3所示。Hsp90的活性通过其将ATP水解为ADP和无机磷酸盐（Pi）的能力来测定。游离磷酸盐浓度越高，与孔雀石绿形成的复合物越多，从而在620 nm处产生明显的绿色，可被检测到（图4）。

抑制率按以下公式计算：

抑制率计算公式：

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讨论

Hsp90 是发现新型抗癌药物分子的重要靶点。自1994年其药物可开发性被证实以来10，已有18种分子进入临床试验。目前，有七种分子正处于不同阶段的临床试验中，单独使用或联合用药均有涉及22。所有这些小分子均为N端ATP结合抑制剂。其他抑制分子伴侣功能的策略（如C端抑制剂、中间结构域抑制剂）的发展速度不及N端抑制剂。因此，N端ATP结合抑制剂化合物仍具有发展为临床可用药物的潜力。此外，迄今为止唯一于2022年6月获批的Hsp90抑制剂（Pimitespib，用于日本胃肠道间质瘤的治疗）即为一种N端ATP结合分子9。然而，截至目前，尚无单一分子在世界其他地区达到可上市阶段23,24。导致这一失败的主要原因包括制剂问题、分子生产成本，以及部分化合物相关的耳毒性与心脏毒性等毒副作用。为克服这些不良反应，目前正探索Hsp90 N端选择性抑制剂（α和β亚型）

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致谢

本研究由韩国国家研究基金会（NRF）的韩国研究奖学金（KRF）项目资助，该奖学金为博士后研究员项目，由韩国科技部资助 & ICT（NRF-2019H1D3A1A01102952）。作者感谢KIST机构内部资助以及海洋与渔业部资助项目编号2MRB130为本项目提供的财政支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 M 氯化镁水溶液Sigma-Aldrich63069-100ml
1 M 氯化钾水溶液Sigma-Aldrich60142-100ml
96孔板SPL Life Sciences不适用
腺苷5′′三磷酸二钠盐水合物Sigma-AldrichA7699-5G
Biomek FX 实验室自动化工作站贝克曼库尔特不适用
化合物 3-96不适用不适用组氨酸标签酵母Hsp90由英国萨塞克斯大学生命科学学院Chrisostomos Prodromou博士提供，该蛋白在韩国科学技术院（KIST）江陵天然产物研究所表达。由于专利侵权问题，相关细节无法披露。
二甲基亚砜Sigma-AldrichD8418
格尔达霉素，99%（HPLC），粉末AK Scientific, Inc.V2064
Invitroge UltraPure 无DNase/RNase纯水赛默飞世尔科技10977015
孔雀石绿磷酸盐测定法  检测试剂盒Sigma-AldrichMAK307-1KT
多功能微孔板读板仪 Synergy HTBiotek Instruments, Inc.不适用
Synergy HT 多功能酶标仪Biotek Instruments, Inc.不适用
Trizma 盐酸盐缓冲液，pH 7.4Sigma-Aldrich93313-1L
酵母Hsp90不适用不适用英国萨塞克斯大学生命科学学院，蛋白质在韩国科学技术院江陵天然产物研究所表达。主要登录号：P02829

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