自组装人间充质干细胞聚集体的构建、表征和再生应用

Summary

本研究描述了一种基于人间充质干细胞自组装构建聚集体的方法，并确定了颅骨缺损再生治疗的形态学和组织学特征。

Abstract

间充质干细胞 （MSC） 以其自我更新能力和多系分化潜力为特征，可以来自各种来源，并正在成为再生医学的有前途的候选者，特别是用于牙齿、骨骼、软骨和皮肤的再生。MSC 聚集的自组装方法，特别是构建模拟发育中的间充质浓缩的细胞簇，允许高密度干细胞递送以及保留的细胞间相互作用和细胞外基质 （ECM） 作为微环境生态位。该方法已被证明能够实现高效的细胞植入和存活，从而促进外源性 MSC 在组织工程中的优化应用，保障临床器官再生。本文提供了基于脐带间充质干细胞 （UCMSCs） 的自组装聚集体的构建和表征的详细方案，以及颅骨再生应用的一个例子。该程序的实施将有助于指导为组织工程和再生医学建立有效的 MSC 移植策略。

Introduction

间充质干细胞 （MSC） 凝聚是确保身体在早期器官发生 ^1,2 中正常生长和发育的重要阶段，尤其是在骨骼、软骨、牙齿和皮肤的形成中 ^1,3,4。在过去的几十年里，使用培养的产后 MSC 与可生物降解支架相结合的组织工程疗法在成骨⁵ 和软骨再生⁶ 方面取得了重要进展。然而，使用支架可能有一些缺点，例如免疫排斥，以及低细胞亲和力和可塑性⁷。在这方面，我们研究了应用球状细胞培养方法提供无支架的自组装聚集体的可行性，模拟正在发展的冷凝现象，其中仅包含 MSC 和沉积的细胞外基质 （ECM）⁸。聚集体的形成增加了应用可塑性以匹配缺陷形状，并避免了支架植入和蛋白水解酶的消化，以收获用于移植^{的 MSC 9}。

MSC 聚集体已广泛用于骨骼、牙髓、牙周组织和皮肤

Protocol

注意:所有动物程序均已获得第四军医大学动物护理和使用委员会的批准，并按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行。从商业来源获得的冻存人 UCMSCs 用于本研究（参见 材料表）。人体细胞的使用得到了第四军医大学伦理委员会的批准。以 UCMSCs 为例描述该程序。以颅骨缺损为例，显示需要修复来描述植入手术。所有实验重复 3 次。

1. UCMSC 骨料的构建

1. UCMSCs 的制备和培养
   1. 将 10 mL 预热的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 加入无菌生物安全柜中的新 15 mL 离心管中。
   2. 从液氮中取出含有冷冻 UCMSCs 的冷冻管，并将其快速放入 37 °C 水浴中。轻轻摇动试管，以促进快速彻底的细胞解冻。
      注意:整个过程必须在 1 分钟内完成，因为冷冻液中的二甲基亚砜 （DMSO） 可能会引起细胞毒性。
   3. 将细胞略微悬浮在冷冻管中，并将所有内容物转移到含有 10 mL PBS 的离心管中（步骤 1.1.1）。将样品以 100 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，用 10 mL PBS 洗涤细胞。
   4. 将样品以 100 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，用含有 10% 胎牛血清 （FBS）、1%....

Results

根据实验工作流程，可以从 UCMSCs 成功构建聚集体（图 1）。使用前必须 通过 形态学观察和组织学分析评估聚集体的质量。形成的层状结构应该是完整和致密的，通过显微镜观察，细胞交织形成编织图案（图 2A）。在聚合期间可以发现边缘卷曲;过度卷曲的边缘表示聚集不成功，留下细胞间隙（图 2B）。最终的聚集体可以通过目视检查查看并轻松分离（图 2C）。可以使用活/死染色剂活体观察聚集体（图 2D）。活细胞的细胞质可以被钙黄绿素 AM 染色并呈绿色，而死细胞的细胞核可以被 EthD-1 染色并呈红色。所有细胞核都可以用 Hoechst 染色并呈现蓝色。正如在 SEM 下分析的那样，表面扫描显示聚集体具有正常的细胞结构，并且在 ECM 中丰富（图 3A），而横截面扫描表明一定.......

Discussion

随着组织工程生物技术的进步，构建具有高可塑性并包含长期存活细胞以实现最佳再生的植入结构的策略一直是许多科学家关注的重点。目前有多种 MSC 植入方法，例如仅细胞植入方法、用细胞因子补充的支架 ^6,24 或干细胞和支架的组合⁵。本文提出了一种高效的 MSC 聚集体构建和植入方法，该方法涉及细胞自组装形成由特定培养基诱导的浓缩簇，具有丰富的细胞 ECM 易于收获和应用的优势。沉积的 ECM 充当天然支架，以增强宿主和植入聚集体之间的生物分子交换，从而促进 MSC 的递送和植入^25,26。以这种方式获得聚集体，细胞可以被自然沉积的 ECM 紧密包裹，从而为组织再生提供更完整和生理模拟的细胞生态位^27,28

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% 胰蛋白酶-EDTA （1x）	Sigma	T4049	细胞传代
自动脱水机	LEICA	ASP200s	脱水聚集体
离心	Eppendorf	5418R	离心
离心管	Thermo Nunc	339650	离心
培养皿	150466		UCMSCs 的热培养
乙醇	SCR	10009218	脱水聚集体
致命牛血清	四季青	11011-8611	UCMSCs 培养
镊子		JZ JD1080	收获聚集体
戊二醛	Proandy	10217-1	骨料
木精和伊红染色试剂盒	beyotime	C0105S	HE 染色
六甲基二硅氮烷	SCR	80068416	干骨料表面
Hoechst33342	Sigma	14533	细胞核染色
L-谷氨酰胺	Sigma	G5792	UCMSCs
活/死活力/细胞毒性培养试剂盒	Invitrogen	L3224	活/死细胞染色
Masson's 染色试剂盒	ZHC	CD069	Masson 染色
最低必需培养基 α 碱性 （1x）	Gibco	C12571500BT	UCMSCs
石蜡	徕卡	39601006	组织包埋
聚甲醛	Saint-Bio	D16013	聚集体固定
PBS （1x）	美伦生物	MA0015	重悬纯化 UCMSCs
青霉素/链霉素	Procell 生命科学	PB180120	UCMSCs
培养 戊巴比妥钠	Sigma	P3761	动物麻醉
多孢菌素	辉瑞		防止眼睛干涩
扫描电子显微镜	日立	s-4800	SEM 观察
剪刀	JZ	Y00030	动物手术切口
六孔板	热	140675	UCMSCs 培养
缝合	金环	F603	闭合伤口
缝合	线 Xy	4-0	闭合伤口
恒温设备	Grant	V-0001-0005	水浴
UCMSCs	Bai'ao	UKK220201	商业 UCMSCs
维生素 C	Diyibio	DY40138-25g	骨料诱导
二甲苯	SCR	10023418	脱水骨料