自组装人间充质干细胞聚集体的构建、表征和再生应用

Summary

本研究描述了一种基于人间充质干细胞自组装构建聚集体的方法，并确定了颅骨缺损再生治疗的形态学和组织学特征。

Abstract

间充质干细胞 （MSC） 以其自我更新能力和多系分化潜力为特征，可以来自各种来源，并正在成为再生医学的有前途的候选者，特别是用于牙齿、骨骼、软骨和皮肤的再生。MSC 聚集的自组装方法，特别是构建模拟发育中的间充质浓缩的细胞簇，允许高密度干细胞递送以及保留的细胞间相互作用和细胞外基质 （ECM） 作为微环境生态位。该方法已被证明能够实现高效的细胞植入和存活，从而促进外源性 MSC 在组织工程中的优化应用，保障临床器官再生。本文提供了基于脐带间充质干细胞 （UCMSCs） 的自组装聚集体的构建和表征的详细方案，以及颅骨再生应用的一个例子。该程序的实施将有助于指导为组织工程和再生医学建立有效的 MSC 移植策略。

Introduction

间充质干细胞 （MSC） 凝聚是确保身体在早期器官发生 ^1,2 中正常生长和发育的重要阶段，尤其是在骨骼、软骨、牙齿和皮肤的形成中 ^1,3,4。在过去的几十年里，使用培养的产后 MSC 与可生物降解支架相结合的组织工程疗法在成骨⁵ 和软骨再生⁶ 方面取得了重要进展。然而，使用支架可能有一些缺点，例如免疫排斥，以及低细胞亲和力和可塑性⁷。在这方面，我们研究了应用球状细胞培养方法提供无支架的自组装聚集体的可行性，模拟正在发展的冷凝现象，其中仅包含 MSC 和沉积的细胞外基质 （ECM）⁸。聚集体的形成增加了应用可塑性以匹配缺陷形状，并避免了支架植入和蛋白水解酶的消化，以收获用于移植^{的 MSC 9}。

MSC 聚集体已广泛用于骨骼、牙髓、牙周组织和皮肤¹⁰ 以及其他组织和器官的再生。可以选择许多不同类型的 MSC 作为种子细胞的候选者，包括但不限于骨髓 MSC （BMMSC）、脐带间充质干细胞 （UCMSC）、脂肪组织来源的基质细胞 （ADSC） 和牙科 MSC（例如牙髓间充质干细胞 [DPSC]、来自乳牙的间充质干细胞 [SHED]¹¹ 和牙周间充质干细胞 [PDLSCs]）¹².在过去十年中，已经开发了许多用于三维细胞簇的技术，包括辅助和自组装聚集。然而，辅助聚集方法在产生 ECM 和形成均匀和紧密的聚集体方面通常较弱，因此不适合模拟生理条件 13,14,15。此外，一些辅助聚集方法需要细胞-材料相互作用才能形成稳定的结构 16,17,18,19，而这种自组装聚集方法通常可用于广泛的 MSC。值得注意的是，在我们最近的临床试验中，MSC 聚集体已成功用于在植入受伤的人类切牙后再生牙髓-牙本质复合物和牙周组织， 它们已经实现了具有生理结构和功能的从头组织再生^20,21。

本文为 MSC 聚集体构建和表征以及 体内 移植提供了全面的程序。当研究人员旨在基于干细胞应用修复组织缺陷（如牙齿、骨骼、软骨和皮肤）时，这种方法将引起他们的注意。该方法简单、方便，完全由细胞和 ECM 组成，无需额外的支架，可长时间培养获得致密稳定的聚集体²²。同时，以这种方式培养的聚集体富含 ECM，它模拟了这些高密度细胞的发育生态位，从而促进组织再生²³。构建过程可分为两个阶段:细胞制备和培养，以及细胞聚集体的自组装形成和收获。聚集体的表征包括 通过 倒置光学显微镜和扫描电子显微镜 （SEM） 进行形态学鉴定，以及 通过 苏木精和伊红 （HE） 以及 Masson 染色进行组织学分析。形成的聚集体被证明用于再生植入以修复颅骨缺损。该程序的实施将有助于指导为组织工程和再生医学建立有效的 MSC 移植策略。

Protocol

注意:所有动物程序均已获得第四军医大学动物护理和使用委员会的批准，并按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行。从商业来源获得的冻存人 UCMSCs 用于本研究（参见 材料表）。人体细胞的使用得到了第四军医大学伦理委员会的批准。以 UCMSCs 为例描述该程序。以颅骨缺损为例，显示需要修复来描述植入手术。所有实验重复 3 次。

1. UCMSC 骨料的构建

1. UCMSCs 的制备和培养
   1. 将 10 mL 预热的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 加入无菌生物安全柜中的新 15 mL 离心管中。
   2. 从液氮中取出含有冷冻 UCMSCs 的冷冻管，并将其快速放入 37 °C 水浴中。轻轻摇动试管，以促进快速彻底的细胞解冻。
      注意:整个过程必须在 1 分钟内完成，因为冷冻液中的二甲基亚砜 （DMSO） 可能会引起细胞毒性。
   3. 将细胞略微悬浮在冷冻管中，并将所有内容物转移到含有 10 mL PBS 的离心管中（步骤 1.1.1）。将样品以 100 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，用 10 mL PBS 洗涤细胞。
   4. 将样品以 100 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，用含有 10% 胎牛血清 （FBS）、1% 青霉素-链霉素和 584 mg/L 谷氨酰胺的完全 α-最低必需培养基 （α-MEM） 轻轻重悬细胞。
   5. 将重悬的细胞接种在 10 cm 培养皿中（通常一管一到两个培养皿，取决于离心后的细胞总量，密度为 5 × 10⁶ 个细胞）。在培养皿中加入完整的 α-MEM 培养基，总体积为 10 mL。
   6. 轻轻摇动培养皿以分散细胞。将培养皿在 37 °C 和 5% CO₂ 中在加湿室中孵育。孵育过夜后，弃去上清液培养基，加入 5 mL PBS 1-2x 以去除非贴壁细胞。加入 10 mL 新鲜的 α-MEM 完全培养基。每 2 天更换一次培养基。
   7. 对于细胞传代，当细胞达到 80%-90% 汇合时，弃去上清液并用 5 mL PBS 洗涤细胞以彻底去除培养基。将细胞在 2 mL 的 0.25% 胰蛋白酶-1 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA） 中于 37 °C 孵育 2 分钟。
   8. 当细胞在显微镜下变成圆形且细胞间连接断开时，将细胞与培养皿分离，而不会对细胞结构造成太大破坏。通过添加 4 mL 完全 α-MEM 培养基来中和胰蛋白酶。
   9. 通过在新鲜的 15 mL 离心管中移液，反复轻柔地从培养皿中收集细胞。将样品以 100 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，用完全 α-MEM 培养基重悬细胞，然后将它们接种在新鲜培养皿或孔板中。每 2 天更换一次培养基。
      注:根据缺陷区域的大小，25 mm³ 的缺陷需要使用培养形成聚集体的 6 孔板细胞孔。
2. 骨料的形成和收获
   1. 通过将 50 μg/mL 维生素 C 添加到含有 10% FBS、1% 青霉素-链霉素和 584 mg/L 谷氨酰胺的 α-MEM 中来制备细胞聚集体诱导培养基。
      注意:使用维生素 C 时应避免阳光直射，因为维生素 C 在光照下会氧化并变得无效。
   2. 当步骤 1.1.12 中的细胞达到 95% 汇合时（补充图 S1），将培养基更改为细胞聚集诱导培养基;每 2 天更换一次新鲜细胞聚集体诱导培养基。
   3. 诱导 7-10 天后（诱导时间的长短取决于干细胞类型，UCMSCs 的边缘通常为 ~7 天），在显微镜下寻找成型的聚集体，厚边缘与培养皿底部分离。
   4. 丢弃培养基，用 PBS 轻轻洗涤细胞 2 次。使用小型无菌镊子轻轻地将聚集体从边缘推到中间，折叠聚集体。
   5. 在某些情况下，UCMSCs 可以自发地向中心卷曲以形成固体冷凝物。此结构等效于步骤 1.2.4 中获得的聚合。

2. 聚集体的形态学鉴定

1. 一般和显微镜观察
   1. 观察聚集体致密且集成，不易被机械力损坏，例如分离和移植过程中的拉扯。
   2. 在显微镜下，寻找具有编织图案的一定厚度的膜状结构。
2. 活细胞/死细胞染色
   1. 将细胞以每孔 1 × 10⁶ 个细胞的密度接种在 6 孔板中。
   2. 准备 2 μM 钙黄绿素 AM 和 4 μM EthD-1 工作溶液并使用 PBS。
   3. 向细胞中加入 0.3% triton 5 分钟，用 PBS 洗涤 3 次以诱导细胞死亡，作为染色的对照。
   4. 用 PBS 洗涤细胞、聚集体和死诱导细胞两次。
   5. 在步骤 2.2.2 中向每个孔中加入 100 μL PBS 和 100 μL 制备的染色溶液。
   6. 在 RT 下孵育样品 30 分钟。用 PBS 洗涤样品两次。
   7. 向每个孔中加入 200 μL 10 μg/mL Hoechst，并在室温下孵育样品 5 分钟。用 PBS 瓦氏样品两次。
   8. 在荧光显微镜下观察。
3. SEM 观察
   1. 将步骤 1.2.4 或 1.2.5 中获得的聚集体进行种子和诱导细胞。在步骤 1.2.4 中形成聚集体后，用 PBS 洗涤细胞。或 1.2.5.
   2. 使用戊二醛固定细胞至少 4 小时。
   3. 用 PBS 洗涤样品，然后通过 30%、50%、70%、80%、90% 至 100% 的乙醇梯度浓度脱水，每次脱水 5 分钟。用无水乙醇处理 2 次。
   4. 将聚集体浸入 3 mL 六甲基二硅氮烷中 30 分钟。吸出所有液体并彻底自然干燥样品。
      注意:整个过程需要在通风橱中进行，因为六甲基二硅氮烷具有挥发性和剧毒。
   5. 用双面碳胶带将干燥的样品粘在样品台上，并用金属涂覆表面。将样品在室温 （RT） 下储存数天。
   6. 在 SEM 下观察。
      1. 将样品装回机器内。将机器电压调整为 5 k，焦距调整为 ~12 mm。调整对焦栏，直到出现清晰的图片。
      2. 以低放大倍率捕获图像。调整放大倍率并重新聚焦以获得更高放大倍率的图像。
         注意:观察前不能触摸聚集体的表面，以免破坏表面形态。

3. 聚集体的组织学分析

1. 样品的固定和切片
   1. 将步骤 1.2.4 或 1.2.5 中获得的聚集体用 4% 多聚甲醛在 4 °C 下固定至少 24 小时。固定后，用 PBS 洗涤，并将样品放入包埋盒中过夜，用流水冲洗。
   2. 按照制造商的说明，使用自动脱水机通过梯度乙醇、二甲苯和石蜡对样品进行脱水。整个过程如下:85% 乙醇 RT 2 h，95% 乙醇 RT 2 h，95% 乙醇 RT 2 h，100% 乙醇 RT 2 h，100% 乙醇 RT 1.5 h，二甲苯 RT 45 min，二甲苯 RT 45 min，石蜡 RT 30 min， 石蜡在 RT 下放置 1.5 小时，最后在 60 °C 下放置石蜡 2 小时。
   3. 用石蜡包埋样品。准备大约 5 μm 厚的切片，将它们粘附在阳离子载玻片上，并在 45 °C 下将载玻片干燥 2 小时。
   4. 依次通过二甲苯脱蜡 15 分钟，两次，以及 100%、90%、80% 和 70% 乙醇（每次 5 分钟）。
   5. 用流水缓慢冲洗载玻片 3 次，持续 5 分钟。
2. HE 染色
   1. 用苏木精染色 3-5 分钟，用水冲洗，然后小心去除组织周围多余的液体。
   2. 用含有 1% 盐酸的乙醇分馏 3-5 秒，然后用流水冲洗，在此期间颜色会变浅并呈蓝色。去除组织周围多余的水分。
   3. 用伊红染色 1 分钟，用流水冲洗，并去除组织周围多余的液体。
   4. 用 70%、80%、90% 和 100% 乙醇脱水各 10 秒，二甲苯脱水 15 分钟，两次，并在密封片材前在通风橱中自然干燥。
   5. 加入中性树脂滴剂并用盖玻片密封载玻片。在光学显微镜下观察。
3. Masson 三色染色
   1. 用 Weigert 苏木精铁染色 5 分钟，用水冲洗，然后擦干。
   2. 用含有 1% 盐酸的乙醇分馏 3-5 秒，然后用流水冲洗，在此期间颜色会变浅并呈蓝色。擦干表面。
   3. 用 Lixin 红酸性洋红色溶液染色 5-10 分钟，然后用蒸馏水快速冲洗。
   4. 用磷钼酸水溶液处理 3-5 分钟。
   5. 直接用苯胺蓝溶液复染 5 min，不用水洗涤。
   6. 用 1% 冰醋酸处理 1 分钟。
   7. 用 70%、80%、90% 和 100% 乙醇脱水各 10 秒，二甲苯脱水 15 分钟，两次，并在密封片材前在通风橱中自然干燥。
   8. 加入中性树脂滴剂并用盖玻片密封载玻片。在光学显微镜下观察。

4. 植入

1. 通过腹膜内注射 50 mg/kg 戊巴比妥钠麻醉裸鼠。
   注意:根据捏住脚垫时没有角膜反射和肢体反应，确认小鼠已正确麻醉。涂抹眼膏以防止干燥。
2. 用碘伏消毒后，用无菌小剪刀在裸鼠耳朵后面的皮肤上切出一个横向切口（~3-4 cm）。
3. 向前拉皮肤以露出颅骨。用 11# 刀片轻轻画出计划缺损区域的边缘，去除骨碎片。缺陷区域是直径约为 4 mm 的圆形区域。使用生理盐水冲洗伤口并提供足够的止血。
4. 在植入前，用无菌纱布浸入步骤 1.2.5 或 1.2.6 中获得的聚集体以吸收表面水分。将骨料放入该区域并略微加压以填充缺陷。
5. 拉动后更换皮肤，以确保植入物固定。用 1/2、4 × 10 斜缝线和 4-0 缝合线闭合切口。
6. 手术后，将动物放在复温毯上，直到它们活跃起来，然后将它们放回笼子中。
   注意:在动物恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前，不得让动物无人看管。接受手术的动物在完全康复之前不会送回其他动物的陪伴处。

Results

根据实验工作流程，可以从 UCMSCs 成功构建聚集体（图 1）。使用前必须 通过 形态学观察和组织学分析评估聚集体的质量。形成的层状结构应该是完整和致密的，通过显微镜观察，细胞交织形成编织图案（图 2A）。在聚合期间可以发现边缘卷曲;过度卷曲的边缘表示聚集不成功，留下细胞间隙（图 2B）。最终的聚集体可以通过目视检查查看并轻松分离（图 2C）。可以使用活/死染色剂活体观察聚集体（图 2D）。活细胞的细胞质可以被钙黄绿素 AM 染色并呈绿色，而死细胞的细胞核可以被 EthD-1 染色并呈红色。所有细胞核都可以用 Hoechst 染色并呈现蓝色。正如在 SEM 下分析的那样，表面扫描显示聚集体具有正常的细胞结构，并且在 ECM 中丰富（图 3A），而横截面扫描表明一定...

Discussion

随着组织工程生物技术的进步，构建具有高可塑性并包含长期存活细胞以实现最佳再生的植入结构的策略一直是许多科学家关注的重点。目前有多种 MSC 植入方法，例如仅细胞植入方法、用细胞因子补充的支架 ^6,24 或干细胞和支架的组合⁵。本文提出了一种高效的 MSC 聚集体构建和植入方法，该方法涉及细胞自组装形成由特定培养基诱导的浓缩簇，具有丰富的细胞 ECM 易于收获和应用的优势。沉积的 ECM 充当天然支架，以增强宿主和植入聚集体之间的生物分子交换，从而促进 MSC 的递送和植入^25,26。以这种方式获得聚集体，细胞可以被自然沉积的 ECM 紧密包裹，从而为组织再生提供更完整和生理模拟的细胞生态位^27,28

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% 胰蛋白酶-EDTA （1x）	Sigma	T4049	细胞传代
自动脱水机	LEICA	ASP200s	脱水聚集体
离心	Eppendorf	5418R	离心
离心管	Thermo Nunc	339650	离心
培养皿	150466		UCMSCs 的热培养
乙醇	SCR	10009218	脱水聚集体
致命牛血清	四季青	11011-8611	UCMSCs 培养
镊子		JZ JD1080	收获聚集体
戊二醛	Proandy	10217-1	骨料
木精和伊红染色试剂盒	beyotime	C0105S	HE 染色
六甲基二硅氮烷	SCR	80068416	干骨料表面
Hoechst33342	Sigma	14533	细胞核染色
L-谷氨酰胺	Sigma	G5792	UCMSCs
活/死活力/细胞毒性培养试剂盒	Invitrogen	L3224	活/死细胞染色
Masson's 染色试剂盒	ZHC	CD069	Masson 染色
最低必需培养基 α 碱性 （1x）	Gibco	C12571500BT	UCMSCs
石蜡	徕卡	39601006	组织包埋
聚甲醛	Saint-Bio	D16013	聚集体固定
PBS （1x）	美伦生物	MA0015	重悬纯化 UCMSCs
青霉素/链霉素	Procell 生命科学	PB180120	UCMSCs
培养 戊巴比妥钠	Sigma	P3761	动物麻醉
多孢菌素	辉瑞		防止眼睛干涩
扫描电子显微镜	日立	s-4800	SEM 观察
剪刀	JZ	Y00030	动物手术切口
六孔板	热	140675	UCMSCs 培养
缝合	金环	F603	闭合伤口
缝合	线 Xy	4-0	闭合伤口
恒温设备	Grant	V-0001-0005	水浴
UCMSCs	Bai'ao	UKK220201	商业 UCMSCs
维生素 C	Diyibio	DY40138-25g	骨料诱导
二甲苯	SCR	10023418	脱水骨料