自组装人源间充质干细胞聚集体的构建、表征及其再生应用

摘要

本研究描述了一种基于人源间充质干细胞自组装构建细胞聚集体的方法，并确定了用于颅骨缺损再生治疗的形态学和组织学特征。

摘要

间充质干细胞（MSCs）具有自我更新能力和多向分化潜能，可来源于多种组织，是再生医学领域极具前景的候选细胞，尤其适用于牙齿、骨骼、软骨和皮肤的再生。MSCs通过自组装聚集形成细胞团簇，模拟发育过程中的间充质凝聚结构，可实现高密度干细胞递送，同时保留细胞间的相互作用以及细胞外基质（ECM）所构成的微环境生态位。该方法已被证实能够有效促进细胞植入与存活，从而优化外源性MSCs在组织工程中的应用，并为临床器官再生提供保障。本文提供了一套基于脐带间充质干细胞（UCMSCs）构建和表征自组装细胞聚集体的详细实验方案，并展示了其在颅骨再生中的应用实例。本实验流程的实施将有助于指导建立高效的MSC移植策略，推动组织工程与再生医学的发展。

引言

间充质干细胞（MSC）的凝聚是确保机体在早期器官发生过程中正常生长和发育的关键阶段^1,2，尤其在骨骼、软骨、牙齿和皮肤的形成中起重要作用^1,3,4。在过去的几十年中，利用体外培养的出生后MSC结合可生物降解支架的组织工程疗法，在成骨⁵和软骨再生⁶方面取得了重要进展。然而，支架的使用可能存在一些缺点，例如免疫排斥反应以及细胞亲和性与可塑性较低⁷。针对这一问题，我们研究了采用球形细胞培养方法的可行性，以获得无支架、自组装的细胞聚集体，模拟发育过程中的凝聚现象，该聚集体仅包含MSC及其分泌的细胞外基质（ECM）⁸。细胞聚集体的形成提高了应用的可塑性，可适应缺损部位的形状，同时避免了支架植入以及通过蛋白水解酶消化来获取用于移植的MSC⁹。

MSC聚集体已广泛用于骨、牙髓、牙周组织和皮肤的再生¹⁰，以及....

方案

注意：所有动物实验程序均经第四军医大学动物护理与使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行。本研究使用了从商业来源获得的冷冻保存的人脐带间充质干细胞（见材料表）。使用人源细胞的研究已获得第四军医大学伦理委员会批准。本实验以脐带间充质干细胞为例描述实验操作流程，以颅骨缺损为例说明修复需求并展示植入操作过程。所有实验均重复三次。

1. 构建脐带间充质干细胞聚集体

1. UCMSCs 的制备与培养
   1. 在无菌生物安全柜中，向一个新的 15 mL 离心管中加入 10 mL 预热的磷酸盐缓冲液（PBS）。
   2. 从液氮中取出含有冻存 UCMSCs 的冻存管，迅速放入 37 °C 水浴中。轻轻摇动冻存管，以促进细胞快速且充分地解冻。
      注意：整个操作必须在 1 分钟内完成，因为冻存液中的二甲基亚砜（DMSO）可能具有细胞毒性。
   3. 将冻存管中的细胞轻轻悬浮，然后将全部内容物转移至含有 10 mL PBS 的离心管中（步骤 1.1.1）。在 100 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，并用 10 mL PBS 洗涤细胞。
   4. 在 100 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，用完全 α-最低必需培养基（α-MEM）轻轻重悬细胞，该培养基含有 10%....

结果

根据实验流程（图1），可成功利用脐带间充质干细胞（UCMSCs）构建细胞聚集体。在使用前必须通过形态学观察和组织学分析对聚集体的质量进行评估（via）。显微镜下观察应可见完整且致密的层状结构，细胞相互交错形成编织样图案（图2A）。在聚集过程中可能出现边缘卷曲现象；过度卷曲的边缘提示聚集失败，并会留下细胞间隙（图2B）。最终形成的聚集体可通过肉眼观察，并易于剥离（图2C）。可使用活/死细胞染色试剂对聚集体进行活体观察（图2D）。活细胞的细胞质可被钙黄绿素AM（calcein AM）染成绿色，而死细胞的细胞核可被EthD-1染成红色。所有细胞核均可被Hoechst染色并呈现蓝色。扫描电镜（SEM）分析显示，表面扫描结果表明聚集体具有正常的细胞结构，并富含细胞外基质（ECM）（图3A

讨论

随着组织工程生物技术的进步，构建具有高可塑性、包含长期存活细胞并能实现最佳再生效果的可植入结构，已成为众多科学家的研究重点。目前间充质干细胞（MSCs）的植入方法多种多样，例如仅使用细胞的方法、结合细胞因子的支架材料^6,24，或干细胞与支架材料联合使用的方法⁵。本文介绍一种高效的MSC细胞团构建与植入方法，该方法通过特定培养基诱导细胞自组装形成致密的细胞簇，具有富含细胞外基质（ECM）的优势，便于收获和应用。所沉积的ECM可作为天然支架，促进宿主与植入细胞团之间的生物分子交换，从而增强MSCs的递送效率和定植能力^25,26。通过该方式获得的细胞团，其细胞可被自然沉积的ECM紧密包裹，为组织再生提供更完整且生理模拟性更高的细胞微环境^27,28。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1x)	Sigma	T4049	细胞传代
自动脱水机	LEICA	ASP200s	聚集体脱水
离心机	Eppendorf	5418R	离心
离心管	Thermo Nunc	339650	离心
培养皿	Thermo	150466	UCMSCs 培养
乙醇	SCR	10009218	聚集体脱水
胎牛血清	Sijiqing	11011-8611	UCMSCs 培养
镊子	JZ	JD1080	收获聚集体
戊二醛	Proandy	10217-1	聚集体固定
苏木精-伊红染色试剂盒	beyotime	C0105S	HE 染色
六甲基二硅氮烷	SCR	80068416	干燥聚集体表面
Hoechst33342	Sigma	14533	细胞核染色
L-谷氨酰胺	Sigma	G5792	UCMSCs 培养
活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒	Invitrogen	L3224	活/死细胞染色
Masson 染色试剂盒	ZHC	CD069	Masson 染色
最低必需培养基 Alpha 基础型 (1x)	Gibco	C12571500BT	UCMSCs 培养
石蜡	Leica	39601006	组织包埋
多聚甲醛	Saint-Bio	D16013	聚集体固定
PBS (1x)	Meilunbio	MA0015	重悬并纯化 UCMSCs
青霉素/链霉素	Procell Life Science	PB180120	UCMSCs 培养
戊巴比妥钠	Sigma	P3761	动物麻醉
Polysporin	Pfizer		防止眼部干燥
扫描电子显微镜	Hitachi	s-4800	SEM 观察
剪刀	JZ	Y00030	动物手术切口
六孔板	Thermo	140675	UCMSCs 培养
缝合针	Jinhuan	F603	闭合伤口
缝合线	Xy	4-0	闭合伤口
恒温设备	Grant	v-0001-0005	水浴
UCMSCs	Bai'ao	UKK220201	商业化 UCMSCs
维生素 C	Diyibio	DY40138-25g	聚集体诱导
二甲苯	SCR	10023418	聚集体脱水