本研究概述了在骨细胞陷窝-管状网络（LCN）中可视化并构建骨细胞三维（3D）模型以进行计算流体动力学（CFD）分析的方法。通过该方法生成的模型有助于理解健康或病变骨骼中骨细胞的力学感知机制。
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摘要
摘要
骨细胞是能够响应机械应变和流体流动剪切应力（FFSS）的骨组织细胞，通过一种称为机械转导的过程激活多种生物通路。基于共聚焦图像构建的骨细胞网络模型是进行计算流体动力学 (CFD) 分析的有力工具，可用于评估骨细胞膜上的剪切应力，而这种应力无法通过直接测量获得。利用这些高分辨率的骨微结构图像进行计算建模，可对作用于骨组织的机械载荷进行数值模拟，进而理解载荷诱导的骨细胞刺激机制。
本研究详细阐述了利用共聚焦显微镜获取的骨陷窝-小管网络 (LCN) 图像建立三维单个骨细胞模型的方法，以使用多种计算建模软件进行计算流体动力学（CFD）分析。在进行共聚焦显微镜成像之前，需将小鼠骨组织切片并用异硫氰酸荧光素（FITC）染料染色，以标记LCN结构。在100倍分辨率下，利用共聚焦显微镜采集Z轴层扫图像，并将其导入MIMICS软件（基于图像的三维处理软件），以构建LCN及骨细胞树突状突起的表面模型。
然后在3-Matic软件（三维数据优化软件）中通过布尔运算减去这些表面，以建模围绕骨细胞胞体的陷窝液腔空间以及围绕树突并含有陷窝小管液的小管空间。三维体积流体几何模型被导入ANSYS软件（仿真软件）中进行计算流体动力学（CFD）分析。使用ANSYS CFX（CFD软件）将生理载荷以流体压力的形式施加于骨组织，并计算骨细胞及其树突结构所受的壁面剪切应力。骨陷窝-小管网络（LCN）的形态会影响骨细胞膜及细胞突起所感知的剪切应力值。因此，共聚焦图像建模方法的具体细节对于理解骨细胞的力学感受机制具有重要价值，并可为该领域的后续研究奠定基础。
引言
骨细胞被认为可响应体育锻炼调节骨量1骨细胞及其树突状突起在机械负荷下发生膜变形，使其受到流体剪切应力（FFSS）作用，该应力被骨细胞感知并触发细胞内信号传导2,3,4骨微结构会因衰老或骨质疏松症、糖尿病等骨病，以及因perlecan缺乏导致骨细胞机械响应能力受损等情况，发生骨陷窝-小管系统的形态退化或改变。5,6这些骨结构的改变导致骨细胞所经历的流体剪切应力和应变水平发生变化7,8重要的是，成骨细胞在机械负荷作用下所经历的流体剪切应力（FFSS）难以量化 体内 因为它们嵌入在钙化的骨基质中。
基于共聚焦图像的建模是一种强大的技术，可通过构建LCN的计算机模型来克服在自然环境中研究难以触及的骨细胞的局限性9,10。对LCN在三维空间中相互连接的网络进行处理和建模一直具有挑战性。目前....
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方案
动物实验经密苏里大学堪萨斯城分校（UMKC）机构动物护理与使用委员会批准，并符合相关联邦指南。
1. 骨组织制备流程
- 取4月龄和22月龄雌性C57BL6小鼠的股骨，用预冷的含4%多聚甲醛的PBS在4 °C、轻柔振荡条件下固定24小时，随后用PBS冲洗，并在包埋前保存于70%乙醇中。
注意：固定液体积应约为组织体积的20倍 - 根据制造商说明，使用快速聚合丙烯酸树脂（材料表）迅速包埋骨组织。
注意：此步骤中使用快速聚合树脂至关重要（约10分钟聚合）。其目的是在使用金刚石锯切片时支撑骨组织，同时避免树脂渗入骨小管网络（LCN），否则会阻碍FITC染料的渗透。 - 使用金刚石锯在股骨大转子上方的标准化位置切割300 µm厚的横截面切片，并在FITC染色前于4 °C保存在70%乙醇中。
- 依次使用600、800和1200目砂纸对切片进行抛光，最终厚度约为90–100 μm。
注意：使用数字卡尺确保达到合适的厚度。 - 将切片分别在70%、95%和100%乙醇中各冲洗5分钟。
- 在室温（RT）避光、温和振荡条件下，用1% FITC的100%乙醇溶液染色4小时。
- 在100%乙醇中避光、轻柔振荡洗涤30分钟，随后在避光条件下过夜空气干燥。
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结果
本方案描述了如何构建基于共聚焦显微图像的骨细胞模型，以研究骨细胞及其树突状突起在机械负荷作用下所承受的流体流动剪切应力（FFSS）大小。选取一只老年和一只年轻C57BL6小鼠，用于建立年轻和老年共聚焦图像来源的骨细胞模型。另外六个模拟骨细胞模型由同一年轻骨细胞模型通过几何结构修饰技术生成，以研究因衰老或骨疾病导致的骨陷窝-小管网络（LCN）形态改变。几何结构修饰的参数包括陷窝-小管厚度、小管密度和直径。在保持其他参数不变的情况下，每次仅改变其中一个参数，从而构建出经几何修饰的骨细胞模型。因此，可单独考察每个形态学参数对FFSS的影响。结果表明，在这些骨细胞模型中，骨细胞所经历的FFSS大小存在差异，显示出FFSS对LCN形态的依赖性。FFSS数值被预测于骨细胞模型的不同部位，例如骨细胞胞体或树突膜区域。在所有模型中，树突所承受的FFSS值均高于骨细胞胞体膜。
图5 显示了直接基于共聚焦FITC图像序列生成的年轻与衰老骨细胞模型的流体剪切应力（FFSS）分布等高线，以及通过几何形变技术由模型1衍生出的另外六个骨细胞模型的FF.......
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讨论
本方案概述了一种共聚焦成像技术，用于成像骨细胞并进行计算建模。在共聚焦成像之前，需对骨组织样本进行切片和染色的骨样本制备处理。将100倍放大的共聚焦图像导入多种软件中，以构建骨细胞及其陷窝-小管系统的计算机模型。最后，基于共聚焦图像所构建的模型进行计算流体动力学（CFD）分析，以模拟因身体活动在骨细胞及树突膜周围产生的流体剪切应力（FFSS）；由于骨细胞深埋于骨基质中，难以接近，此类研究在活体（in vivo）条件下具有较高的技术挑战性。本方案还可用于在多物理场建模中，结合有限元或流固耦合（FSI）方法，测定其他类型的应力或应变。
由于使用FITC染色骨骼可获得高分辨率图像，共聚焦成像已被用于可视化骨陷窝-小管网络（LCN）7,9,24,25。尽管小管的直径接近显微镜的分辨率极限，但仍可获得可靠的共聚焦图像，足.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此致谢美国国家科学基金会（NSF，项目编号 NSF-CMMI-1662284，项目负责人：T Ganesh）、美国国立卫生研究院（NIH - NIA P01 AG039355，项目负责人：LF Bonewald）以及（NIH/SIG S10OD021665 和 S10RR027668，项目负责人：SL Dallas），以及密苏里大学堪萨斯城分校研究生院研究资助计划。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1200目砂纸 | Buehler | 30-5170-012-100 | |
| 3-Matic 软件 | Materialise | https://www.materialise.com/en/industrial/software/3-matic | 三维数据优化软件 |
| 600目砂纸 | Buehler | 30-5118-600-100 | |
| 800目砂纸 | Buehler | 30-5170-800-100 | |
| ANSYS 软件 | ANSYS | https://www.ansys.com/ | 仿真软件 |
| 异硫氰酸荧光素（FITC） | Sigma-Aldrich | F7250 | |
| ImageJ 软件 | https://imagej.net/ij/ | ||
| 显微镜用浸油 | Leica Microsystems | 195371-10-9 | |
| Leica TCS Sp5 II 共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | TCS Sp5 II | |
| Leitz 1600 内孔金刚石切割锯 | Leica | ||
| MIMICS Innovation Suite 软件 | Materialise | https://www.materialise.com/en/healthcare/mimics-innovation-suite | 基于三维图像的处理软件 |
| Permount 封片介质 | Fisher scientific | SP15-500 | |
| Sampl-Kwick 快速固化丙烯酸树脂包埋套装 | Buehler | 20-3560 | |
| 单平台实验室摇床 | Reliable scientific INC | Model 55S |
参考文献
- Li, M. C. M., Chow, S. K. H., Wong, R. M. Y., Qin, L., Cheung, W. H. The role of osteocytes-specific molecular mechanism in regulation of mechanotransduction - A systematic review. J Orthop Translat. 29, 1-9 (2021).
- Fritton, S. P., Weinbaum, S.
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重印与许可
