复合盐胁迫对辣椒（Capsicum annuum L.）种子萌发及耐盐性影响的分析

摘要

以下论文介绍了一种用于测定两种具有不同耐盐性差异的辣椒品种在六种混合盐浓度处理下的种子萌发、幼苗生长及生理指标的实验方案。该方案可用于评估辣椒品种的耐盐性。

摘要

为确定辣椒（Capsicum annuum L.）在萌发阶段的耐盐性及其生理机制，选用耐盐性差异较大的两个品种——Hongtianhu 101 和 Xinxiang 8 作为试验材料。采用等摩尔比例的 Na₂CO₃、NaHCO₃、NaCl、CaCl₂、MgCl₂、MgSO₄ 和 Na₂SO₄ 配制出 0、3、5、10、15 和 20 g/L 共六种混合盐浓度处理。通过测定种子萌发、幼苗生长及相关生理指标，结合隶属函数分析法对耐盐性进行综合评价。结果表明，随着混合盐浓度的升高，两个品种的发芽势、发芽指数、发芽率、种子活力指数、根长和根鲜重均显著下降，而相对盐害率则逐渐上升；下胚轴长度和地上部鲜重先升高后降低；丙二醛（MDA）含量、脯氨酸（Pro）含量、过氧化氢酶（CAT）活性、过氧化物酶（POD）活性和超氧化物歧化酶（SOD）活性均呈现先下降后上升的趋势。在所有盐浓度处理下，Hongtianhu 101 的发芽势、发芽指数、发芽率、种子活力指数、根长、根鲜重、MDA 和 Pro 含量以及 CAT 活性均高于 Xinxiang 8；但其下胚轴长度、地上部鲜重和相对盐害率则低于 Xinxiang 8。耐盐性综合评价结果显示，两种材料的隶属函数加权总值均随混合盐浓度升高先上升后下降。与隶属函数值最高的 5 g/L 处理相比，3 g/L、10 g/L 和 15 g/L 处理的综合评价指数分别下降了 4.7%–11.1%、25.3%–28.3% 和 41.4%–45.1%。本研究为辣椒耐盐品种的选育、耐盐生理机制解析以及耐盐栽培提供了理论依据。

引言

盐渍化是全球作物生产力的主要限制因素 之一¹。目前，全球约有19.5%的灌溉土地和2.1%的旱地受到盐渍化影响，每年约有1%的农业用地退化为盐碱地。预计到2050年，全球50%的可耕地将受到盐渍化的影响^2,3。除自然因素（如岩石自然风化、沿海地区附近的咸性雨水、地表快速蒸发和降雨量少）外，不合理的农业管理方式也加剧了土壤盐渍化进程。土壤盐渍化会抑制植物根系生长，降低水分和养分从根部向叶片的吸收与运输。这种抑制作用导致植物出现生理缺水、营养失衡和离子毒害，进而造成作物产量下降甚至绝收。耕地盐渍化正逐渐成为影响全球农业粮食生产的最重要非生物胁迫因素之一⁴。盐胁迫减少了可用于农业的可耕地面积，可能导致未来农产品供需之间出现严重失衡。因此，深入研究土壤盐渍化对作物生长及其生理生化机制的影响，有助于培育耐盐品种、实现盐渍土壤的可持续利用以及保障农产品安全。

辣椒（Capsicum annuum L.）因其较高的营养价值和药用价值而在全球广泛种植。例如，辣椒素是一种生物碱，是辣椒辛辣味的主要来源。辣椒素可用于镇痛、减重，并有助于改善心血管系统、胃肠道及呼吸系统功能，还具有多种其他应用⁵。辣椒还富含多种生物活性物质，尤其是各类抗氧化化合物（如类胡萝卜素、酚类物质和黄酮类化合物）以及维生素C⁶。目前，辣椒是中国种植面积最大的蔬菜作物，年种植面积超过1.5 × 10⁶ 公顷，占中国蔬菜总种植面积的8%–10%。辣椒产业已成为中国最大的蔬菜产业之一，且产值最高⁷。然而，辣椒种植常受到多种生物胁迫（如害虫和真菌）和非生物胁迫（尤其是盐胁迫）的影响，盐胁迫会直接对种子萌发、生长和发育产生不利影响，导致辣椒果实产量和品质下降⁸。

种子萌发是植物与环境相互作用的初始阶段。种子萌发对周围介质的变化极为敏感，尤其是土壤盐胁迫，可能对生理和代谢产生相反的影响，最终扰乱作物的正常生长、发育和形态建成⁹。以往研究广泛探讨了盐胁迫下辣椒种子的萌发及幼苗生长情况，但多数研究仅使用NaCl作为诱导胁迫的单一盐分^10,11,12。然而，土壤盐害主要源于钠盐、钙盐和镁盐解离产生的Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-、CO₃^2-和SO₄^2-等离子的毒性作用。由于离子间的协同与拮抗效应，混合盐与单一盐对作物生长发育的影响可能存在显著差异。目前，辣椒种子在混合盐条件下的萌发与生长特性仍不明确。因此，本研究选用两种耐盐性差异显著的辣椒品种作为试验材料，通过分析七种盐等摩尔混合后不同盐浓度对辣椒种子萌发、生长及生理生化指标的影响，揭示辣椒种子萌发对盐胁迫的响应机制，同时为培育健壮辣椒幼苗以及在盐渍化耕地上实现高产优质栽培提供理论依据。

方案

注意：本文介绍了一种评估辣椒种子在不同混合盐胁迫条件下萌发及幼苗生长的响应特征与内部机制的实验方案，可作为种子耐盐性评价的参考方法。

1. 实验准备

1. 准备具有强耐盐性的红田湖101和低耐盐性的新乡8号作物种子。
2. 配制0.2%的KMnO₄溶液作为种子消毒试剂。首先称取4.0 g KMnO₄，然后加入2,000 mL蒸馏水。
   注：高锰酸钾由于具有强氧化性，通常不稳定；因此需在使用前现配。
3. 使用七种盐类配制混合盐，包括碳酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、氯化钙、氯化镁、硫酸镁和硫酸钠¹³。每种盐加入相同的摩尔量，其质量分别占混合盐总质量比的14.8%、11.7%、8.2%、15.5%、13.3%、16.7%和19.8%。
4. 准备直径为9 cm的一次性培养皿和中速定性滤纸。
   ​注：培养皿的材质可以更换，但培养皿和滤纸的直径必须一致。

2. 种子浸泡与萌发前准备

1. 进行种子优化时，从每个品种中选取大小一致、饱满的辣椒种子，其中红天虎101和新乡8号种子的平均直径分别为4.2 mm和3.7 mm。根据测试工作量计算所选种子的总数。
2. 进行种子消毒时，将选好的辣椒种子置于0.2% KMnO₄溶液中浸泡15分钟，然后用蒸馏水冲洗五次。
3. 进行种子浸种时，将灭菌后的种子放入蒸馏水中，浸泡24小时。用蒸馏水多次冲洗种子，晾干后备用。
   ​注意：不同作物种子的浸种时间可能有所不同。

3. 种子萌发与幼苗生长

1. 配制六种浓度的混合盐溶液：0（对照）、3、5、10、15 和 20 g/L。使用电导率仪测定盐溶液的电导率；其电导率（EC 值）分别为 0.092、3.05、4.73、8.33、11.53 和 15.22 ms/cm。
2. 种子准备：将 40 粒辣椒种子均匀放置于培养皿中，培养皿内铺有两层滤纸。为六个实验处理组分别准备种子，并对每个处理重复五次。
3. 种子萌发：向培养皿中加入适量的六种不同浓度的混合盐溶液，确保滤纸保持湿润。将种子置于 28 °C、空气湿度为 80% 的恒温培养箱中，在黑暗条件下进行萌发。
4. 种子萌发后，将幼苗继续在光照条件下（光照强度约为 450 Lux，光周期为 12/12 h）于培养箱中培养 14 天。幼苗生长阶段的温度和湿度必须与萌发阶段保持一致。
5. 每隔 12 小时补充培养皿中的溶液，以维持滤纸湿润，并每隔 24 小时用相应浓度的混合盐溶液彻底冲洗滤纸，以保持培养皿内混合盐浓度恒定。
   ​注意：用于湿润种子的盐溶液添加量可根据种子萌发和生长阶段进行调整。维持培养皿中盐溶液浓度恒定的方法有多种。除本实验所述方法外，还可采用按重量补充蒸馏水的策略。

4. 指标测量与计算

1. 种子萌发指标的测定
   1. 播种后每日测定种子萌发率，以胚根突破种皮并达到种子直径长度一半作为萌发标志。
   2. 使用以下公式计算萌发率、萌发势、相对盐害率、萌发指数和种子萌发活力指数：
      萌发率 (%) = （播种后第7天正常萌发种子数 / 供试种子数）× 100
      萌发势 (%) = （播种后第3天正常萌发种子数 / 供试种子数）× 100
      相对盐害率 (%) = （对照组萌发率 - 处理组萌发率）/ 对照组萌发率 × 100
      以播种后第7天的种子萌发率进行计算
      萌发指数 (GI) = ∑ [Gt/Dt]
      其中 Gt 表示播种后某一时间段 (t) 的种子萌发数，Dt 表示相应的萌发天数
      种子萌发活力指数 (VI) = GI × S
      ​其中 S 为根长
2. 幼苗生长指标的测定
   1. 播种后第14天，从每个培养皿中随机选取10株具有代表性的幼苗，测量其根长和下胚轴长度。
   2. 用刀片将辣椒幼苗分为两部分：根部和地上部分。用擦拭法去除幼苗表面水分后，分别称重以测定鲜重。
3. 按以下步骤测定辣椒幼苗的抗氧化酶活性、丙二醛（MDA）含量和脯氨酸（Pro）含量。
   1. 为保存辣椒幼苗样品，在播种后第14天从各处理组中选取具有代表性的完整幼苗（约24.0 g）。去除表面水分后，立即用液氮速冻1分钟，并置于超低温冰箱（-80 °C）中保存。
      注：超低温冰箱中保存的辣椒幼苗样品数量应充足，以防部分指标需重新检测。
   2. 从每组三个重复处理中各取出约1.0 g幼苗样品。将样品放入离心管中，加入液氮，使用研磨棒充分研磨，用于测定幼苗生理指标。所测定的指标及测定方案如下。
   3. 使用市售试剂盒（基于分光光度法）分别测定幼苗保护性酶活性（过氧化物酶 [POD]、过氧化氢酶 [CAT]、超氧化物歧化酶 [SOD]）、丙二醛（MDA）含量和脯氨酸（Pro）含量¹⁴。
      注：前期观察发现15 g/L与20 g/L混合盐浓度之间的盐胁迫无显著差异，因此仅测定五个盐浓度（0、3、5、10 和 15 g/L）。
4. 采用隶属函数法综合评价耐盐性
   注：隶属函数采用模糊数学方法，将定性评价转化为定量评价¹⁵，用于评估多种受盐胁迫影响的生理指标。
   1. 根据周斌 Liu 等人¹⁵提出的公式计算隶属函数值：
      Ri = (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
      若某性状与耐盐性呈负相关，则计算其逆向隶属函数：
      Ri = 1 - (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
      ​累加各生理指标的隶属值，其中 Xi 为某性状的实测值，Xmax 和 Xmin 分别为该性状的最大值和最小值，Ri 为该性状的隶属值。
   2. 纳入以下相关指标用于隶属函数值计算：种子萌发特性（萌发势、萌发率、萌发指数、种子萌发活力指数）、萌发期幼苗生长特性（根长、下胚轴长、根鲜重、地上部鲜重）、MDA、Pro 及保护性酶活性（CAT、POD、SOD）。各指标分别获得其隶属函数值。
5. 使用电子表格软件和 SPSS 软件（版本 22.0）对试验数据进行分析处理，采用最小显著差异法（LSD）进行多重比较以判断差异显著性。采用 Pearson 相关性分析探讨复合盐胁迫下辣椒种子萌发与幼苗生理指标之间的相关性。

结果

种子萌发特性
随着混合盐浓度的增加，红甜湖101和新乡8号的萌发势和萌发指数均显著下降。两个品种在盐浓度0–3 g/L范围内萌发指标急剧下降，在3–20 g/L范围内则呈缓慢而稳定的下降趋势（图1A，B）。随着混合盐浓度升高，两个品种的萌发率逐渐降低，而相对盐害率则逐渐上升。在盐浓度为3–15 g/L时，两个品种的萌发率和相对盐害率之间无显著差异；但在其他所有盐浓度下，差异均达到显著水平（图1C，D）。就品种间的耐盐性而言，随着混合盐浓度的增加，红甜湖101种子的萌发势、萌发指数和萌发率均高于新乡8号，而其相对盐害率则低于新乡8号。

随着混合盐浓度的增加（0–15 g/L），两个品种的种子发芽活力指数显著下降。当混合盐浓度为15 g/L时，红甜湖101和新乡8号的种子发芽活力指数分别比对照组下降了91.0%和94.6%。值得注意的是，当混合盐浓度从15 g...

讨论

该研究方法包含四个影响实验结果准确性的关键步骤。首先，由于高盐浓度溶液中溶质含量增加导致混合盐溶解性差，以及氯化钙等试剂本身在水中的溶解度较低，更难溶解，因此称量后的试剂必须在研钵中充分研磨。此外，试剂必须完全溶解 通过 超声波处理后再测定其吸水能力。其次，每次配制的盐溶液必须充分振荡均匀，并加入培养皿中使用。第三，加入盐溶液后，各培养皿需保持适宜的水层，且每个培养皿中的水分状态应相对一致。最后，种子萌发后的光照条件必须保持一致。

本研究中，可通过选择不同直径的培养皿来调整单个培养皿中的测试种子数量。根据各种植区域土壤盐胁迫的具体情况，可调整单一盐分添加的比例，以使其与当地土壤盐胁迫的实际状况保持一致。尽管该方法具有实用性，但对于较小的种子（如油菜、冰菜和苋菜）或较大的种子（如刀豆和蚕豆），在使用该方法研究耐盐性时，会出现幼苗长度和鲜重测定操作困难，或单个培养皿中种子数量过少难以重复实验数据等问题，从而导致研究困难。

本文所述方法用于测定不同混合盐浓度下种子的萌发特性及幼苗生长情况，并通过分析内部生理酶活性揭...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钙	中国上海实验试剂有限公司	分析纯试剂
离心机	中国上海卢鑫仪离心机仪器有限公司	TGL-16M
离心管	无	无
电导率仪	上海仪器&安普&电子科学仪器有限公司，中国	DDSJ-308F
恒温恒湿箱	中国宁波莱福科技有限公司	PSX-280H
数显游标卡尺	中国德力集团有限公司	DL90150
电子天平	梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，中国	ME802E/02
滤纸	中国杭州富阳北木浆纸业有限公司	GB/T1914-2017
研磨棒	无	无
红天堂湖  101	Seminis种子（北京）有限公司，中国	11933955/100147K1-137
制冰机	中国上海科华仪器有限公司	IM150G
液氮	无	无
氯化镁	天津科密欧化学试剂有限公司，中国	分析纯试剂
硫酸镁	天津科密欧化学试剂有限公司，中国	分析纯试剂
培养皿	江苏易哲教学仪器有限公司，中国	I-000163
折叠刀	无	无
高锰酸钾（KMnO₄）4	中国西安西龙科技有限公司	分析纯试剂
纯水设备	中国四川优普超纯科技有限公司	UPT-I-20T
碳酸氢钠	中国西安西龙科技有限公司	分析纯试剂
碳酸钠	中国西安西龙科学有限公司	分析纯试剂
氯化钠	中国西陇科学有限公司	分析纯试剂
硫酸钠	中国西陇科学有限公司	分析纯试剂
测试试剂盒	中国苏州科明生物科技有限公司，中国苏州	分光光度法
超低温冰箱	SANYO Techno Solution TottoriCo.,Ltd.	MDF-382
紫外-可见分光光度计	中国上海精密科学仪器有限公司	760CRT
新乡 8	江西农旺高科技有限公司，中国	GPD 胡椒 2017(360013)