方法文章

用于临床应用的封闭式半自动化人源间充质干细胞制备流程

DOI：

10.3791/64707

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2023年3月17日

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1Bioprocessing Technology Institute (BTI), Agency for Science, Technology and Research (A STAR), 2Thermo Fisher Scientific, 3Thermo Fisher Scientific

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种利用逆流离心系统以封闭式半自动化方式从多层培养瓶中收获贴壁细胞的实验方案。通过少量修改现有步骤，该方案也可适用于从其他细胞扩增平台收获贴壁细胞和悬浮细胞。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人源间充质干细胞（hMSCs）目前正被探索作为多种疾病的有前景的细胞治疗手段，预计在未来几年内将获得更多的临床应用市场批准。为了推动这一转化进程，解决规模化、批间可重复性、成本、法规合规性和质量控制等方面的瓶颈问题至关重要。通过实现工艺的封闭化并采用自动化生产平台，可有效应对这些挑战。在本研究中，我们开发了一种封闭式半自动化工艺，利用逆流离心法对来自多层培养瓶的华通氏胶（Wharton's jelly, WJ）来源的人源间充质干细胞（WJ-hMSCs）进行传代和收获。WJ-hMSCs在符合监管要求的无血清无异源成分（SFM XF）培养基中扩增，其细胞增殖能力（群体倍增）和形态学特征与在传统含血清培养基中扩增的WJ-hMSCs相当。我们建立的封闭式半自动化收获方案表现出高细胞回收率（约98%）和高细胞活力（约99%）。通过逆流离心法洗涤和浓缩的细胞保持了WJ-hMSC的表面标志物表达、集落形成单位（CFU-F）、三系分化潜能以及细胞因子分泌谱。本研究开发的半自动化细胞收获方案可便捷地应用于多种贴壁细胞和悬浮细胞的小至中等规模处理，通过直接连接不同的细胞扩增平台，实现体积浓缩、洗涤和低终体积收获。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人源间充质干细胞（hMSCs）因其具有治疗潜力和强大的自我更新能力，是组织工程和细胞治疗领域临床应用的理想候选细胞 体外 这对于生成具有临床相关剂量的细胞至关重要1,2,3根据 ClinicalTrials.gov 的数据，目前有超过 1,000 项针对各种疾病状况的临床试验正在进行中4鉴于人们对使用hMSCs的兴趣日益增加，未来不久将会有更多的临床试验和市场批准接踵而至。5,6然而，间充质干细胞（hMSCs）的生产在批次间一致性、高风险原材料的使用、因大量开放式和人工操作步骤带来的污染风险等方面存在诸多固有挑战，此外，生产过程涉及多个单元操作，劳动力成本较高，扩增或放大生产的成本高昂，且面临监管方面的障碍。6,7,8,9,10,11,12这些问题仍然是当前和未来市场准入的重要障碍。

开发封闭式、模块化、自动化的生产解决方案，并使用低风险的辅助试剂，将有助于解决这些挑战。这还能确保产品品质的一致性，降低因人为错误导致批次失败的可能性，减少劳动力成本，并提高工艺标准化水平和法规合规性，例如在数字化批次记录保存方面8,12,13,14。为了获得具有临床意义的细胞剂量，无论是自体还是同种异体细胞，关键在于实现上游细胞扩增和下游处理全过程的封闭式、自动化、流程化生产。

在上游hMSC扩增中，目前最常用的两种生产工艺是扩增培养（2D单层培养）和放大培养（基于3D微载体的悬浮系统）15,16,17,18。其中，由于生产成本低且操作简便，2D单层培养法是最传统且应用最广泛的hMSC扩增方法19。

由多个扁平表面培养皿在培养容器内堆叠构成的多层培养瓶常用于扩大间充质干细胞（hMSC）的生产规模。这类系统通常包含从1层到40层的培养容器20，需在生物安全柜内手动操作。在细胞传代和收获过程中，需通过移液或整体倾斜容器的方式，手动加入和倾倒扩增培养基、解离试剂以及洗涤缓冲液。此外，由于这些容器体积庞大且重量较重，同时操作多个容器具有挑战性且耗时。

随后，在从多层培养瓶收获细胞后，培养基更换、细胞洗涤以及体积浓缩所需的离心步骤是整个细胞制备工艺流程中的关键环节21传统的台式离心是一种主要为开放式且依赖手工操作的过程，涉及多个步骤，例如在生物安全柜内将细胞悬液转移至带盖试管或瓶中、离心沉淀细胞、手动吸除上清液、用缓冲液重悬细胞以及反复洗涤细胞。这一过程显著增加了因开盖和关盖操作导致的污染风险，同时也提高了在手动吸液或移液过程中丢失细胞沉淀物的可能性22在处理基于贴壁细胞（如hMSCs）的多层培养系统时，操作人员需要在离心机与生物安全柜之间反复来回穿梭，同时操作重量较大的装置。这些手动操作步骤繁琐，存在人为错误和污染风险，且必须在B级洁净室环境中进行，成本较高23此外，传统的手动离心过程难以放大，且可能引起细胞剪切和应激；因此，最大限度地提高细胞回收率、存活率以及残留杂质的清除效率是其他主要挑战22商业化cGMP规模的细胞治疗生产需要封闭式、模块化的自动化解决方案，以降低污染风险，确保产品品质的一致性，减少人力和生产成本，并提高工艺的可靠性24,25多层培养瓶可通过在其中一个端口安装无菌0.2 µm滤膜以实现无菌气体交换，并将第二个端口无菌连接来作为封闭系统操作 通过 连接器或通过焊接导管直接连接至自动化细胞处理仪器，用于细胞收获。我们致力于通过评估一种创新的封闭式逆流离心机，实现脐带华通胶间充质干细胞（WJ-hMSC）传代和收获过程中多数步骤的封闭化与自动化，该设备专为细胞、基因或组织类产品的生产而设计。该逆流离心机还具有灵活的适应性，可执行多种细胞处理应用，包括基于细胞大小的分离、培养基/缓冲液置换、浓缩以及多种细胞类型的收获。8,26,27,28该仪器使用封闭式一次性试剂盒，可通过管路焊接或无菌连接器与转移袋进行无菌连接，也可直接连接至任意选定的扩增平台。

在本研究中，我们设计了一种定制的管路组件，以实现一次性逆流离心套件与多层培养瓶之间的封闭式无菌连接。我们优化了一种实验方案，可在单次操作中以完全封闭且半自动化的方式，通过酶法解离、清洗并收获多层培养瓶中的华通氏胶间充质干细胞（WJ-MSCs）。对收获的WJ-hMSCs进行了纯度（表面标志物分析）和效力（成纤维细胞集落形成单位、三系分化能力及细胞因子分泌谱）表征，以确保终产品符合批次放行的关键质量属性（CQAs）要求。

方案

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1. 培养基的制备及培养器皿的包被

  1. 培养基制备
    1. 传统含血清培养基的配制：将 αMEM（445 mL）、胎牛血清（FBS）（50 mL）和 100× 青霉素-链霉素溶液（5 mL）混合，配制传统含血清培养基。
    2. 配制完全无血清 XF 培养基。
      1. 在无菌条件下，向 500 mL 的 SFM XF 基础培养基中加入 5 mL 的 SFM XF 添加剂（100×）和 5 mL 的 100× L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（见材料表），配制成 500 mL 的培养基。
      2. 通过将 50 mL 注射器连接至培养基袋的适当接口，在无菌条件下向 2 L 的 SFM XF 基础培养基袋中加入 20 mL 定制的 MSC SFM XF 添加剂（100×）和 20 mL 的 100× L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（见材料表），配制成 2 L 的培养基袋。
        注意：在用于细胞培养前，需向完全无血清 XF 培养基中添加生长因子或细胞因子（未随培养基提供）：PDGF-BB（20 ng/mL）、基础 FGF（4 ng/mL）和 TGFβ（0.5 ng/mL）。
  2. 使用纤连蛋白（vitronectin）包被细胞培养容器，用于无血清培养
    1. 在 4 °C 条件下解冻纤连蛋白（VTN-N；0.9 mg/mL）储备液。
    2. 使用不含钙和镁的无菌 Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）将解冻后的 VTN-N 稀释至工作浓度 5 µg/mL。
      注意：VTN-N 应在使用前立即稀释，稀释后的纤连蛋白溶液不得储存。
    3. 按每 10 cm2 表面积加入 1 mL 稀释后的 VTN-N 溶液，最终包被浓度为 0.5 µg/cm2。例如，向 T-75 培养瓶（75 cm2）中加入 7.5 mL 稀释液；向 T-175 培养瓶（175 cm2）中加入 17.5 mL 稀释液；向标准四层多层培养瓶（2,528 cm2）中加入 250 mL 稀释液；向十层多层培养瓶（6,320 cm2）中加入 630 mL 稀释液。
    4. 在无菌条件下，于室温（RT）孵育培养容器 1 小时。
      注意：包被后的培养容器可在 4 °C 保存最多 1 周。应用实验室封口膜包裹培养容器以防止干燥。使用前需将培养容器在室温预热至少 1 小时。
    5. 吸除 VTN-N 溶液并弃去，立即加入足量的培养基以防止包被表面干燥。
      ​注意：去除 VTN-N 溶液后无需冲洗培养容器。

2. WJ-hMSC 扩增

  1. 将WJ-hMSCs（p2）的冻存管置于37 °C水浴中快速解冻；轻轻摇动冻存管，直至内容物开始融化。
  2. 解冻后，将WJ-hMSCs以5,000个细胞/cm2的密度接种于T-175培养瓶中（无需VTN-N包被），在含血清的经典培养基中，于37 °C、5% CO2 的湿化环境中培养以扩增细胞。经过两次传代（至p4）后，将扩增的细胞以所需的冻存培养基制备为工作细胞库（WCB）。
  3. 采用自动细胞计数仪，按照细胞活力与计数方法进行细胞计数，以确定总细胞数、细胞活力及细胞大小29。
  4. 从p4代开始，将WJ-hMSCs以5,000个细胞/cm2的密度接种于T-75培养瓶中，分别使用含血清的经典培养基或SFM XF无血清培养基培养（使用SFM XF培养基时需采用VTN-N包被的培养瓶）。
  5. 在两种培养基中均连续培养共三轮传代（共12天），通过将每轮传代结束时计得的活细胞数除以该轮传代开始时的活细胞数（即细胞接种日），计算每轮传代的细胞扩增倍数（倍增率）。

3. 种子扩增培养的规模放大

  1. 在T-175培养瓶中扩增WJ-hMSC
    1. 将第4代（p4）的WJ-hMSC迅速解冻：将冻存管置于37 °C水浴中，缓慢旋转冻存管，直至溶液开始融化。
    2. 以5,000个细胞/cm2的密度将细胞接种至VTN-N包被的T-175培养瓶中。将培养瓶置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。
    3. 为获得最佳性能和细胞生长效果，每2–3天更换一次用过的培养基，使用新配制并预热的完全SFM XF培养基。
  2. 多层培养瓶的操作（图1A，B）
    1. 所有无菌连接操作均需在无菌环境中进行。
    2. 在生物安全柜内拆开多层培养瓶的包装。
    3. 将预先灭菌的空气滤器（0.2 µm）连接至一个端口，以便在使用逆流离心机进行液体转移时释放压力。
    4. 将定制管路组件中的多层培养瓶连接头插入另一个端口（图1B）。
    5. 将定制管路组件中的PVC管与含有完全SFM XF培养基的2 L PVC转移袋进行热合连接。
      注意：在通过重力流将培养基加入多层系统前，应充分混匀培养基袋。确保PVC转移袋悬挂位置高于多层培养瓶。
    6. 将多层培养瓶侧放（长边朝下），使空气滤器位于上方（图1B）。
    7. 打开PVC管路上的夹子，开始填充多层培养瓶。填充过程中确保各层之间的培养基液面保持水平。
    8. 当所有层中的培养基完全水平后，将多层培养瓶转为短边朝下放置，端口保持竖直向上。
    9. 关闭PVC管路上的夹子，并用MPC蓝色封闭帽替换管路连接，移除转移袋。
      注意：不要移除空气滤器，以便在细胞扩增过程中进行气体交换。
    10. 将多层培养瓶调整至培养位置。
      注意：滤器和管路连接口应朝上。
    11. 通过将多层培养瓶连接至吸液瓶来排空培养基；将培养瓶置于吸液瓶上方，液体将自然流出。
      注意：可将多层培养瓶侧向倾斜，利用重力完全排尽用过的培养基。或者，也可使用定制管路组件将废液倒入废液瓶中。
    12. 重复步骤3.2.5–3.2.11以补充新鲜培养基。
  3. 在多层培养瓶中传代WJ-hMSC（T-175 > 4层 > 10层）
    1. 使用前，将细胞解离试剂（TrypLE）和完全SFM XF培养基置于37 °C培养箱中预热。
    2. 吸除T-175培养瓶中的用过的培养基并弃去。
    3. 用预热的DPBS洗涤细胞单层，吸除并弃去DPBS。
    4. 向每个培养瓶中加入TrypLE，确保完全覆盖细胞单层，并在37 °C孵育5–10分钟。
    5. 将细胞悬液转移至无菌的50 mL锥形管中。
    6. 在室温下以100–200 × g 离心5分钟。吸除并弃去DPBS，注意不要扰动细胞沉淀。
    7. 用少量预热的完全SFM XF培养基（10 mL）重悬细胞沉淀，用于细胞计数。
    8. 如上文第2节所述，向VTN-N包被的四层培养容器中加入约800 mL完全SFM XF培养基。按5,000个细胞/cm2的密度接种（即每瓶1.26 × 107个活细胞）。轻轻摇动细胞悬液，确保细胞均匀分布。
    9. 置于37 °C、5% CO2、湿度充足的培养箱中培养。
    10. 为获得最佳细胞生长效果，每2–3天更换一次用过的培养基，使用新鲜预热的完全SFM XF培养基，直至细胞达到60%–80%融合度，或准备传代至10层多层培养瓶。
    11. 如第2节所述，向VTN-N包被的10层多层培养瓶中加入约2 L完全SFM XF培养基。按5,000个细胞/cm2的密度接种（即每瓶3.1 × 107个细胞）。轻轻摇动细胞悬液，确保细胞均匀分布。
    12. 置于37 °C、5% CO2、湿度充足的培养箱中培养。
    13. 为获得最佳细胞生长效果，每2–3天更换一次用过的培养基，使用新鲜预热的完全SFM XF培养基，直至细胞达到60%–80%融合度，或准备收获细胞。

4. 使用封闭式逆流离心法进行闭合式半自动化脐带华通胶间充质干细胞解离与收获

  1. 一次性逆流离心套件组装
    1. 连接一次性使用套装 使用一次性PVC转移袋 通过 管材焊接，类似于图中所示的配置 图1A.
      注：一次性使用试剂盒的默认流速为30-165 mL/min。
    2. 连接一个10层细胞培养瓶 将融合的WJ-hMSCs加入生物安全柜内的定制管路组件中。
    3. 将带有定制管路组件的10层培养容器转移至工作台，并焊接至一次性使用套件的E管路（内径3/32英寸PVC），如图所示 图1B.
    4. 确保进行焊接 无菌取样口连接至 G 管 高流量一次性套件
    5. 接下来，将收获管路 H 连接到装有 50 mL 注射器的无菌鲁尔接头。
      注意：在上述所有步骤中，确保手动夹具处于关闭状态，以固定每个试剂盒袋中的液体。
  2. 设置仪器运行
    1. 开启仪器电源 "开启" 通过打开仪器背面的拨动开关。
    2. 使用提供的 USB-C 线缆将笔记本电脑连接到仪器的 USB-C 端口（图1B).
    3. 从桌面或开始菜单运行逆流离心机图形用户界面（GUI）软件。
    4. 登录后，单击以加载实验方案 选择实验方案 主欢迎页面上的按钮
      注意：逆流离心收获方案（表1使用 Protocol Builder 软件创建，并在本地存储。
    5. 按下仪器上的蓝色解锁按钮，然后打开玻璃门。
    6. 将组装好的一次性套件装载到逆流离心系统上。
    7. 首先将袋子悬挂在挂钩上，按照最佳顺序排列，使其与气泡传感器条上的管路接口对齐，同时将10层多层培养瓶倾斜放置，如图所示。 图1B.
    8. 排列试剂盒 使用两个试剂盒位置按钮， 拉伸泵管 围绕蠕动泵，以及 按压白色灯泡状连接器 就位。
      注意：确保压力传感器上的管道正确放置在管道导轨中。
    9. 连接离心机腔室 通过抬起逆流离心室载体的银色杠杆，并将其复位至直立位置以固定。
    10. 按压试剂盒上每个端口的管路 进入气泡传感器条带上的轨道。
      注意：确保袋子没有缠绕，以便顺利进行实验操作。
    11. 关闭门 通过按压门锁扣。
      注意：泵夹臂将闭合，离心室将开始旋转，阀门将关闭。若不关闭舱门，系统将无法启动并运行程序。
    12. 击中 启动 GUI 上的按钮。此时将出现一个检查清单，前四项为仪器检查，后两项为用户检查（确认袋子和连接与试剂盒图示一致，确认手动夹具已打开）。
      注意：若仪器检查存在问题，将显示红色叉号而非蓝色勾选标记。
    13. 按压 确认 显示实验方案输入界面。
    14. 设置数据输入（收获体积) 对话框中的数值设为 45 mL，然后按压 确认.
      注意：如果用户创建的实验方案中设置了可变数据输入，则系统将提示输入协议参数界面。本方案中收获体积被设为可变参数，用户可根据最终的细胞密度需求选择测试不同的体积。系统允许的最小收获体积为 5 mL。每个实验方案最多仅可设置四个数据变量。
  3. 运行实验方案
    1. 点击 启动 在图形用户界面上，按下绿色的 开始 仪器上的按钮以启动程序运行（参见 表1).
      注意：系统将根据方案启动步骤，首先通过缓冲液置换系统中的空气，进行引液。
    2. 一旦引物延伸完成（表1，步骤8）确保废液完全被泵入废液袋中。
      注意：当10层多层培养瓶为空时，图形用户界面（GUI）将提示用户确认容器是否为空。按下 "跳过" 如果容器为空，请按下仪器上的按钮；否则，按下绿色按钮 "播放/暂停" 按钮以继续排空容器中的残留液体。
    3. 在暂停步骤15、19和22中（表1确保提起多层培养瓶并轻轻摇晃，使缓冲液均匀分布到所有层中。完成后，将10层多层培养瓶放回原来的抽屉位置，以进行后续步骤。
      注意：对于第19步 表1 仅在摇晃后，务必将多层培养瓶平放，并在室温下孵育10–15分钟以解离细胞。
    4. 在步骤20和步骤23中（表1)，确保将胰蛋白酶消化的细胞完全转移至中间袋中。
    5. 在步骤25中手动充分混匀中间袋表1).
    6. 在步骤26中（表1），使用2 mL鲁尔注射器通过取样口取样。
      注意：为获得准确的细胞计数，建议至少进行三次取样。
    7. 在步骤29和步骤30中（表1），检查流化细胞床的稳定形成情况；其形态应与图中所示的流化细胞床相似 图1C.
      注意：如果未形成类似图示的稳定流化细胞床，则 图1C在细胞加载和洗涤步骤中，优化离心力与流速的比值（G/F）对于在腔室内形成稳定的流化细胞层（高细胞回收率）至关重要。G/F 比值取决于细胞的大小和培养基的密度。高密度的样本/洗涤缓冲液需要较高的 G/F 比值，而低密度的样本/洗涤缓冲液则可采用较低的 G/F 比值。
    8. 运行在以下时间点完成 斜坡停止 步骤（第35步） 表1），逆流离心系统上的所有夹管阀将自动关闭。
      注意：最后，在打开门之前，务必关闭手动夹具，以确保每个试剂盒袋中的液体被固定。
    9. 实验程序运行结束后，按下仪器上的蓝色解锁按钮，打开玻璃门。取出装有收获浓缩液的一次性试剂盒。
    10. 无菌条件下使用手持式管路封口器封闭收获管路。将装有浓缩细胞收获物的已封口注射器小心转移至生物安全柜中，进行细胞计数和冷冻保存。
    11. 再次使用杠杆卸下腔室，拔出灯泡连接器，并小心取下套件，将其丢弃至生物危害袋中。
    12. 使用乙醇湿巾清洁仪器，并确保关闭门。
    13. 在关闭仪器背面的电源开关之前，请先关闭图形用户界面（GUI）应用程序。
      ​注意：细胞收获实验方案在生物学重复中进行了三次测试（n = 3）。

5. 关键质量属性（CQA）评估

  1. 细胞身份表面标志物（CD73、CD90 和 CD105）以及非基质细胞标志物（CD34 和 CD45）
    1. 加入适量流式细胞术缓冲液（含 1% BSA 或 2% FBS 的 DPBS），将收获的 WJ-hMSC 细胞悬液稀释至浓度为 1 × 106 个活细胞/mL。
    2. 将 100 µL 细胞悬液加入每个微量离心管或 96 孔板中。确保每 100 µL 细胞悬液中至少含有 0.1 × 106 个细胞。
    3. 根据抗体供应商推荐的稀释比例，向样品中加入荧光素偶联抗体。
    4. 避光孵育 20 分钟。
    5. 孵育结束后，加入 100 µL 流式细胞术缓冲液，于 380 × g 离心 3 分钟以洗涤样品。
    6. 弃去上清液，保留细胞沉淀。
    7. 将细胞沉淀重悬于 200 µL 流式细胞术缓冲液中，并进行流式细胞术分析30。
  2. 成纤维细胞集落形成单位检测（CFU-F）
    1. 将细胞悬液用完全培养基稀释至浓度为 1,000 个活细胞/mL。
    2. 在 6 孔组织培养板中，每孔接种约 500 个细胞，使用完全培养基。
    3. 于 37 °C、5% 湿润 CO2 条件下孵育 10–14 天，用 PBS 洗涤，并在室温下用甲醇配制的 0.5% 结晶紫溶液染色 30 分钟。
    4. 计数每孔中的集落数量。
    5. 计算 CFU-F 效率：将形成的集落数除以初始接种细胞数，得到集落形成的百分比效率，并以百分比表示。
  3. 三系分化潜能
    1. 按照制造商说明书，将 5 × 103 个细胞/cm2 接种至 12 孔板中的成骨和成脂分化培养基中。对于成软骨分化，制备浓度为 1.6 × 107 个活细胞/mL 的细胞悬液，并按照制造商说明书，在 96 孔板孔中央接种 5 µL 细胞悬液液滴，形成微团培养物。
    2. 分化过程中，每隔 3–4 天完全更换一次培养基。
    3. 培养 14 天（成脂分化）或 21 天（成骨和成软骨分化）后，按照制造商说明书使用谱系特异性生物染色剂检测分化情况。对于成脂分化，使用 0.5% 油红 O 溶液染色；对于成骨分化，使用 2% 茜素红 S 溶液染色；对于成软骨分化，使用 1% 阿利新蓝对微团沉淀进行染色。
  4. 细胞因子分泌谱
    1. 解冻通过手动或逆流离心系统收获的冻存细胞，并在 T-175 培养瓶中以 SFM XF 培养基按 5,000 个细胞/cm2 的密度接种。
    2. 培养 4 天后，收集用过的培养基，并于 −80 °C 保存直至分析。
    3. 使用多重读板仪配合 19 重细胞因子表达谱检测试剂盒定量检测细胞因子的表达水平。
    4. 按照制造商推荐的方法进行多重免疫检测。

结果

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脐带间充质干细胞（WJ-hMSC）主细胞库（MCB）在复苏后使用含经典血清的培养基连续传代三次（p1-p4），以制备足够的工作细胞库（WCB）用于实验。将p4代的WCB细胞复苏后，在含血清培养基和无血清无异源成分培养基（SFM XF）中分别于T-175培养瓶中继续扩增三个传代（p4-p7）。WJ-MSC在SFM XF培养基中扩增时适应良好，其增殖稳定性与含血清培养基中相当（图2A）。然而，在SFM XF培养基中扩增的细胞呈现出稍长的成纤维细胞样纺锤形形态，导致细胞尺寸略大，平均约为17 µm，而含血清培养基中的细胞平均约为15 µm（图2B）。在连续三个传代过程中，两种培养条件下的WJ-hMSC均稳定达到最大细胞密度约2.3 × 104 个细胞/cm2，群体倍增时间约为34 h（图2C、D）。

为了在封闭系统中大规模扩增华通氏胶间充质干细胞（WJ-hMSC），我们首先在4层培养瓶中进行种子扩增，随后在10层多层培养瓶中进一步扩增。培养约4天后，当细胞融合度达到80%–90%时，分别从4层和10层培养瓶中收获了9.6 × 107 ± 0.9 × 107 和 2.3 × 108 ± 0.2 × 108 个细胞。与T-175培养瓶相比，多层培养瓶中达到了更高的细胞密度，为3.6 × 104–3.8 × 104 个细胞/cm2，表明其细胞扩增能力最多可提高七倍。

此外，使用逆流离心法直接收获在10层培养容器中扩增的WJ-hMSCs。通过仪器的蠕动泵，以最高165 mL/min的流速将一次性套件无菌连接，可轻松实现液体的直接转移。半自动化的细胞收获过程首先通过酶解法解离细胞，随后将细胞加载至逆流离心室进行体积缩减和浓缩，接着用洗涤缓冲液洗涤，洗涤液体积约为逆流离心室体积的3倍。随后，将洗涤后的细胞进一步浓缩，并收集至预设的目标收获体积。该半自动化细胞处理流程的设计旨在模拟手动收获的操作步骤。我们实现了10倍的体积缩减，最终获得的细胞浓度高达530万细胞/mL。在三次独立实验中，该方案 consistently 实现了约98%的高细胞回收率和约99%的高细胞活力（图3A-C）。

我们进行了广泛的细胞表征检测，以确定采用逆流离心法与手动离心法收获细胞时细胞产品的关键质量属性。为检测WJ-hMSCs的细胞身份，通过流式细胞术分析了细胞表面标志物。如图4A所示，两种方法收获的WJ-hMSCs均表现出符合国际细胞治疗学会（ISCT）规定的特征性表面标志物谱型，即CD73、CD90和CD105呈阳性表达，而CD34和CD45呈阴性表达。接下来，为评估WJ-hMSCs的克隆形成潜能，我们进行了CFU-F实验。如图4B所示，通过逆流离心法收获的细胞与手动离心法收获的细胞具有相似的CFU-F形成能力（分别为21% ± 1% 与 20% ± 1%）。此外，如图4C所示，经逆流离心法收获的细胞仍保留了向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化的潜能，其分化能力与手动离心法获得的细胞相似。最后，我们采用多重免疫分析法检测了细胞分泌的18种不同细胞因子的谱型。如图4D所示，经逆流离心法洗涤和浓缩后的细胞仍维持了细胞因子的分泌谱型，且该谱型与洗涤/浓缩前（即逆流离心前）采集的样本相比具有可比性。

总体而言，我们证明了在无血清无异源培养体系中可高效扩增人骨髓间充质干细胞，且使用封闭式自动逆流离心系统进行洗涤和浓缩后，细胞在洗涤后表现出高的回收率和存活率，并能维持其表型和功能特性。本研究开发的封闭式半自动化工艺在最终脐带华通胶间充质干细胞回收率方面可提供稳定的产品质量一致性，这一点已通过三次独立实验得到验证。

Cell processing setup diagram and images; custom tubing, multi-layered flasks, fluidized bed in MSCs study.
图1高流量一次性套件的配置与组装，用于hMSCs的收获、洗涤和浓缩。 (A试剂盒示意图，显示各袋子已与相应管路串联连接。B10层多层培养瓶与定制管路组件连接的一次性高流量套装。C反流室中形成的稳定流化细胞床的可视化 通过 计数流式离心软件图形用户界面中启用的相机功能 请点击此处以查看此图的放大版本。

含血清培养基与无血清培养基（SFM XF）中细胞培养的显微图像及WJ-MSCs的生长分析图表。
图2：hMSCs在含血清培养基与无血清培养基（SFM XF）中的细胞形态与扩增能力比较。（A）hMSCs在传统含血清培养基与SFM XF培养基中的代表性细胞形态。SFM XF培养基中扩增的细胞呈现更长的纺锤形、典型的成纤维细胞样形态，而在含血清培养基中生长的细胞则呈现更扁平的形态。（B）通过自动细胞计数仪测量的不同传代次数下，含血清培养基与SFM XF培养基中MSC的平均细胞大小（n = 3）。可以看出，在不同传代过程中，SFM XF培养基扩增的细胞通常比含血清培养基扩增的细胞更大。不同传代次数下的总细胞产量（n = 3）（C）以每单位培养表面积的细胞数表示，以及（D）群体倍增水平。在不同传代过程中，SFM XF培养基与含血清培养基获得的细胞产量水平相似。数据以均值 ± 标准差表示。请点击此处查看该图的放大版本。

对流离心实验前后细胞活力和浓度的柱状图。
图3：使用对流离心系统处理的细胞的表征。（A）洗涤和浓缩前后有活力的总细胞数。（B）对流离心处理后实现了10倍的体积浓缩。（C）细胞的总回收率和活力。数据来自三次生物学重复实验（n = 3）的平均值，以均值 ± 标准差表示。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞分离过程；流式细胞术图谱；离心比较；干细胞分化。
图 4：关键质量属性分析。（A）流式细胞术的代表性数据。（B）显示总菌落形成单位（CFU）的代表性图像。（C）三系分化过程的代表性显微图像。（D）在逆流离心系统处理细胞前后细胞因子表达分析结果（n = 3）。数据以均值 ± 标准差表示。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：在逆流离心系统上进行hMSC消化收获、洗涤和浓缩的操作流程，包括初始引管步骤。 请点击此处下载该表格。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在本研究中，我们展示了利用逆流离心仪器在实验台上实现hMSC解离、洗涤和收获的封闭化及半自动化操作能力。整个工作流程中的一个关键步骤是确保管路连接符合逆流离心系统协议构建器中预设的程序。该系统的设置和操作简便，从试剂盒组装到细胞收获，处理一个10层培养瓶约2 L培养液所需时间约为60分钟。此工作流程中的一个限制步骤是将液体从多层培养瓶转移至连接逆流离心仪器的转运袋。高流速一次性使用试剂盒的最大流速仅为165 mL/min，这在处理例如40层培养瓶时可能面临挑战。为加快液体转移过程，可使用外部高流速泵先将胰酶消化后的细胞内容物转移至转运袋，随后利用逆流离心系统对转运袋中的细胞进行洗涤/浓缩及收获。此外，该方案也可用于将细胞从4层培养瓶传代至10层多层培养瓶。在更上游的应用中，逆流离心系统还可进一步优化，用于冻存hMSC的洗涤，以及直接将细胞收获并配制培养基至多层培养瓶中以启动种子扩增流程。需要注意的是，逆流离心室中形成流化床所需的最少细胞数量约为3000万个，每批次处理的最大推荐体积为20 L。

目前，在生物安全柜中将定制管路组件连接到多层培养瓶，以及对组件各部分进行高压灭菌的操作，在cGMP环境下并不理想。作为替代方案，可将定制的伽马射线灭菌管路组件外包给供应商。提供多层培养瓶的供应商通常也可提供预装所需管路组件（包括0.2 µm滤器）并完成整套装置伽马射线灭菌的服务。这将确保多层培养瓶及其连接管路系统真正处于封闭状态，从而可在C级洁净室环境中的操作台面上完成整个操作过程。

利用逆流离心系统进行的这一过程不仅限于多层培养容器中贴壁培养的细胞，还可适用于动态（搅拌罐式或波浪式生物反应器）和静态（透气性）悬浮培养细胞扩增平台。特别是对于在三维微载体培养体系中扩增的人间充质干细胞（hMSCs），可在逆流离心系统上优化相关方案，以收获、洗涤并制备从微载体上解离下来的hMSCs。

总体而言，随着人们对开发具有更高工艺稳健性和可靠性的转化性细胞治疗产品的兴趣日益增加，封闭式自动化细胞处理平台应运而生。这些系统至关重要，因为它们减少了操作步骤，通过无菌连接防止潜在污染，并通过降低人力成本、提高洁净室空间的有效利用率来减少生产成本21。与此趋势一致，许多正在寻求监管批准以推进其疗法转化的细胞治疗产品开发者，已意识到在工艺开发早期即实现工艺封闭并实施全自动化或半自动化的重要性14,31,32。

通过使用符合监管要求的无血清培养基SFM XF，以及符合21 CFR GMP第11部分和国际质量指南的辅助试剂，该半自动化工艺将非常适用于临床生产。我们已证实该封闭式工艺具有良好的可重复性，并能维持WJ-MSCs的质量。提高在多层培养瓶中培养贴壁细胞的效率和安全性，不仅将有益于人源间充质干细胞（hMSC）治疗领域，也将惠及细胞系保藏和贴壁病毒生产的相关企业。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P.J.、A.B.、R.L. 和 J.N. 是赛默飞世尔科技公司的员工。A.L. 和 S.O. 不存在利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢新加坡科技研究局（A*STAR）产业对接基金前期定位项目（IAF-PP）资助（H18/01/a0/021 和 H18/AH/a0/001）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2L PVC 转移袋TerumoBCTBB*B200TM
阿辛蓝溶液，pH 2.5Merck101647
茜素红染色液MerckTMS-008-C
APC 抗人 CD73 抗体Biolegend344015
APC 小鼠 IgG1，κ 同型对照（FC）抗体Biolegend400121
Bio-Plex MAGPIX 多重检测仪Bio-Rad
逆流离心系统Thermo Fisher ScientificA47679Gibco CTS Rotea 逆流离心系统
结晶紫Sigma-aldrichC0775
CTS (L-丙氨酰-L-谷氨酰胺) GlutaMAX 添加剂Thermo Fisher ScientificA1286001
CTS 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）Thermo Fisher ScientificA1285601无钙、无镁
CTS 重组人玻璃粘连蛋白（VTN-N）Thermo Fisher ScientificA27940
CTS TrypLE Select 酶Thermo Fisher ScientificA1285901
定制管路组件Saint-Gobain 和 Colder Product Company (CPC)N/A经伽马射线灭菌的 3/32” 内径 PVC 管，一端装有无菌雄性 MPC 接头（1/8” 插管），另一端密封。将一段短 C-Flex 管在高压灭菌后，一端装上无菌细胞工厂端口连接器，另一端装上雌性 MPC 接头（3/8” 插管）。在生物安全柜中连接 PVC 管和 C-Flex 管
Emflon II 胶囊（0.2 µm 滤器）PallKM5V002P2G100
胎牛血清（FBS）Thermo Fisher Scientific12662029适用于间充质干细胞，经 USDA 批准地区来源
碱性成纤维细胞生长因子（FGF-basic）Thermo Fisher ScientificPHG0024
FITC 抗人 CD105 抗体Biolegend323203
FITC 抗人 CD45 抗体Biolegend304005
FITC 抗人 CD90（Thy1）抗体Biolegend328107
FITC 小鼠 IgG1，κ 同型对照（FC）抗体Biolegend400109
Hi-Flow 一次性使用套件Thermo Fisher ScientificA46575Gibco CTS Rotea Hi-flow 一次性使用套件，流速为 30 – 165 mL/min
多层培养系统 Thermo Fisher Scientific140360（4 层）；140410（10 层）Nunc 标准细胞工厂系统
NucleoCounter NC-3000ChemometecNC-3000
油红 O 染色液Merck102419
PDGF-BBThermo Fisher ScientificPHG0045
青霉素-链霉素Thermo Fisher Scientific15140122
PerCP 抗人 CD34 抗体Biolegend343519
PerCP 小鼠 IgG1，κ 同型对照抗体Biolegend400147
ProcartaPlex 多重免疫检测试剂盒Thermo Fisher Scientific定制 19 重检测面板：FGF-2、HGF、IDO、IL-10、IL-1RA、IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1、MCP-2、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、PDGF-BB、RANTES、SDF-1α、TGFα、TNF-α、VEGF-A 
取样口Thermo Fisher ScientificA50111经伽马射线灭菌的鲁尔取样口，附带两条 PVC 管
StemPro 脂肪生成分化试剂盒Thermo Fisher ScientificA10070-01
StemPro 软骨细胞分化试剂盒Thermo Fisher ScientificA10071-01
StemPro 定制间充质干细胞无血清无蛋白培养基试剂盒（SFM XF 培养基）Thermo Fisher ScientificME20236L1包含 StemPro MSC SFM 基础培养基和定制 MSC SF XF 添加剂（100 倍浓缩）
StemPro 成骨分化试剂盒Thermo Fisher ScientificA10072-01
T175 Nunc EasYFlask 培养瓶Thermo Fisher Scientific159910
T75 Nunc EasYFlask 培养瓶Thermo Fisher Scientific156472
TGFβ1Thermo Fisher ScientificPHG9204
WJ MSCs PromoCell(#C12971; Germany)人源间充质干细胞
αMEM 培养基Thermo Fisher Scientific12571063含核苷

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