体外评估纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性

Summary

我们介绍了四种使用 体外 技术评估纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性的方法。这些方法可以适用于研究不同纳米颗粒和纳米结构表面与各种微生物物种的相互作用。

Abstract

纳米颗粒和纳米结构表面（如银、氧化锌、二氧化钛和氧化镁）的抗菌活性以前已在临床和环境环境以及消费品中探索过。然而，所使用的实验方法和材料缺乏一致性，最终导致了相互矛盾的结果，即使在相同纳米结构类型和细菌种类的研究中也是如此。对于希望在产品设计中使用纳米结构作为添加剂或涂层的研究人员来说，这些相互矛盾的数据限制了它们在临床环境中的使用。

为了应对这一困境，在本文中，我们提出了四种不同的方法来确定纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性，并讨论了它们在不同场景中的适用性。调整一致的方法有望产生可重复的数据，这些数据可以在研究中进行比较，并针对不同的纳米结构类型和微生物物种实施。我们介绍了两种确定纳米颗粒抗菌活性的方法和两种纳米结构表面抗菌活性的方法。

对于纳米颗粒，直接共培养方法可用于确定纳米颗粒的最小抑制和最小杀菌浓度，直接暴露培养方法可用于评估纳米颗粒暴露引起的实时抑菌与杀菌活性。对于纳米结构表面，直接培养方法用于确定与纳米结构表面间接和直接接触的细菌的活力，并且聚焦接触暴露方法用于检查纳米结构表面特定区域的抗菌活性。我们讨论了在确定纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌特性时要考虑的 体外 研究设计的关键实验变量。所有这些方法的成本都相对较低，采用相对容易掌握和可重复的技术以实现一致性，并且适用于广泛的纳米结构类型和微生物物种。

Introduction

仅在美国，每年就有 170 万人发生医院获得性感染 （HAI），其中每 17 例感染中就有 1 例导致死亡¹。此外，据估计，HAI的治疗费用每年从280亿美元到450亿美元不等^1，2。这些 HAI 主要由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 （MRSA）³，4 和铜绿假单胞菌 ⁴ 为主，它们通常从慢性伤口感染中分离出来^，通常需要广泛的治疗和时间才能产生良好的患者预后。

在过去的几十年中，已经开发了多种抗生素类别来治疗与这些和其他致病菌相关的感染。例如，利福霉素类似物已被用于治疗MRSA，其他革兰氏阳性和革兰氏阴性菌感染以及分枝杆菌属感染⁵。在1990年代，为了有效治疗越来越多的结核分枝杆菌感染，额外的药物与利福霉素类似物联合使用以提高其有效性。然而，大约 5% 的结核分枝杆菌病例仍然对利福平⁵，⁶ 耐药^，....

Protocol

为了介绍直接共培养和直接暴露方法，我们使用氧化镁纳米颗粒（nMgO）作为模型材料来证明细菌相互作用。为了介绍直接培养和聚焦接触暴露方法，我们以具有纳米结构表面的镁合金为例。

1. 纳米材料的灭菌

注意:在微生物培养之前，所有纳米材料必须经过灭菌或消毒。可以使用的方法包括热、压力、辐射和消毒剂，但必须在 体外 实验之前确定每种方法的材料耐受性。

1. 纳米粒子
   注意:样品可以储存在乙醇等有机溶剂中，也可以包装到培养皿或盒子中，然后以适当的方式进行灭菌或消毒。使用以下方法对纳米颗粒进行灭菌，以演示直接共培养方法¹⁷ 和直接暴露方法。
   1. 在每次体外实验之前，在200°C对流炉³⁰中对MgO纳米颗粒灭菌60分钟。
      注意:选择这种方法是因为水蒸气和紫外线可能会影响MgO纳米颗粒（nMgO）的结构¹⁷。
2. 散装物料
   注意:纳米结构材料通过以下方法灭菌，以演示直接培养方法。
   1. 对于直接培养方法¹⁴，在开始 体外 研究之前，使用紫外线（UV）辐射对制备好的ZC21，....

Results

氧化镁纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性鉴定已使用适用于不同材料类型和微生物物种的四种 体外 方法提出。

方法A和方法B在滞后期（方法A）和对数期（方法B）暴露于纳米颗粒时检查细菌活性24小时或更长时间。方法A提供了有关MIC和MBC的结果，而方法B确定了纳米颗粒的抑制作用与杀菌效果。方法C检查与纳米结构表面直接和间接接触的细菌活性，方法D检查细胞 - 纳米结构界面选定区域上的细菌活性，持续时间为24小时或更长时间。

使用的方法如图1和图2所示，其结果如图3、图4、图5、图6、图7和图8所示。

Discussion

我们提出了四种体外方法（A-D）来表征纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性。虽然这些方法中的每一种都量化了细菌随时间推移对纳米材料的生长和活力，但用于测量初始细菌接种密度、生长和活力随时间变化的方法存在一些差异。其中三种方法，直接共培养方法（A）¹⁷，直接培养方法（C）14和聚焦接触暴露方法（D）¹⁶，通过计算每单位体积的CFU来量化暴露于纳米材料一段时间后的细菌生长和活力。相比之下，直接曝光方法（B）通过离散实时光密度（OD₆₀₀）测量来量化细菌生长。如果量化CFU有时间限制，和/或动力学研究需要实时细菌密度读数，该方法也可以应用于直接共培养、直接培养和聚焦接触暴露方法。如果对直接暴露方法中要测试的细菌种类没有有效的抗生素，则必须进行文献检索以确定正确的抗生素及其MIC值，以作为纳米材料基团的参考。可以通过完成标准化曲线来确认MIC值，该曲线绘制了分光光度法数据与特定时间点菌落形成单位的定量之间的关系。该过程将特定点培养物中存在的细胞数量与.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL 微量离心管	Milipore Sigma	Z336777
80 L NTRL 认证对流干燥箱	MTI Corporation	BPG-7082	https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
（羟甲基）氨基甲烷缓冲液 pH 8.5;Tris 缓冲液	Sigma-Aldrich	42457
AnaSpec 硫黄素 T 超纯级	Fisher Scientific	50-850-291
电子倍增电荷耦合器件数码相机	Hamamatsu	C9100-13
Falcon 15 mL 锥形管	Fisher Scientific	14-959-49B
戊二醛	Sigma-Aldrich	G5882
血球计数器	Brightline， Hausser Scientific	1492
电感耦合等离子体 - 直读光谱法 （ICP-OES）	PerkinElmer	8000
反相显微镜	Nikon	Eclipse Ti-S
Luria Bertani 肉汤	Sigma 生命科学	L3022
Luria Bertani 肉汤 + 琼脂	Sigma 生命科学	L2897
MacroTube 5.0 大管	Benchmark Scientific	C1005-T5-ST
氧化镁纳米颗粒	美国研究纳米材料公司	库存 #： US3310   M	MgO， 99+%， 20 nm
MS 半微量天平	梅特勒-托利多	MS105D
硝酸纤维素纸	Fisherbrand	09-801A
非组织处理的 12 孔聚苯乙烯板	Falcon Corning 品牌
非组织处理的 48 孔聚苯乙烯板	Falcon Corning 品牌
非组织处理的 96 孔聚苯乙烯板	Falcon Corning 品牌
培养皿 100 mm	VWR	470210-568
培养皿，15 mm	Fisherbrand	FB0875713A
pH 计	VWR	SP70P
扫描电子显微镜 （SEM）	TESCAN	Vega3 SBH
超声波仪	VWR	97043-936
台式离心机	Fisher Scientific	accuSpin Micro 17
台式离心机	Eppendorf	Centrifuge 5430
胰蛋白酶大豆琼脂	MP	1010617
胰蛋白酶大豆肉汤	Sigma-Aldrich	22092-500G
紫外-可见分光光度计	Tecan	Infinite 200 PRO	https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10L	VWR	N/A
X射线功率折射	Panalytical	N/A	PANalytical Empyrean 系列 2