纳米颗粒与纳米结构表面抗菌活性的评估 体外

摘要

我们介绍四种利用纳米颗粒和纳米结构表面评估其抗菌活性的方法 体外 这些方法可被调整用于研究不同纳米颗粒和纳米结构表面与多种微生物物种之间的相互作用。

摘要

纳米颗粒和纳米结构表面（如银、氧化锌、二氧化钛和氧化镁）的抗菌活性此前已在临床、环境以及可食用食品产品中得到研究。然而，由于实验方法和所用材料缺乏一致性，即使针对相同类型的纳米结构和细菌物种的研究，也得出了相互矛盾的结果。对于希望在产品设计中将纳米结构作为添加剂或涂层的研究人员而言，这些不一致的数据限制了其在临床环境中的应用。

为应对这一难题，本文介绍了四种不同的方法来测定纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性，并讨论了这些方法在不同场景下的适用性。采用一致的方法有望获得可重复的数据，从而能够在不同研究之间进行比较，并适用于不同类型的纳米结构和微生物种类。我们介绍了两种测定纳米颗粒抗菌活性的方法，以及两种测定纳米结构表面抗菌活性的方法。

对于纳米颗粒，可采用直接共培养法测定其最低抑菌浓度和最低杀菌浓度，而通过直接暴露培养法可评估纳米颗粒暴露后对细菌的实时抑菌与杀菌活性。对于纳米结构表面，可采用直接培养法检测与纳米结构表面间接或直接接触的细菌存活率，并利用聚焦接触暴露法考察纳米结构表面特定区域的抗菌活性。我们讨论了需考虑的关键实验变量 体外 在确定纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌特性时的研究设计。所有这些方法成本相对较低，采用的技术相对易于掌握且可重复以保证一致性，适用于多种类型的纳米结构和微生物种类。

引言

仅在美国，每年就有170万人发生医院获得性感染（HAI），其中每17例感染中就有1例导致死亡¹。此外，据估计，HAI的治疗费用每年在280亿至450亿美元之间^1,2。这些医院获得性感染主要由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）^3,4和铜绿假单胞菌⁴引起，这些病原体常从慢性伤口感染中分离得到，通常需要长期且复杂的治疗才能获得理想的患者预后。

在过去的几十年中，已开发出多种抗生素类别，用于治疗与这些及其他病原菌相关的感染。例如，利福霉素类似物已被用于治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、其他革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌感染，以及Mycobacterium spp. 感染⁵。在20世纪90年代，为了更有效地治疗日益增多的M. tuberculosis感染病例，研究人员将利福霉素类似物与其他药物联合使用，以提高其疗效。然而，约有5%的M. tuberculosis病例对利福平（rifampicin）仍具....

方案

为了展示直接共培养和直接暴露方法，我们采用氧化镁纳米颗粒（nMgO）作为模型材料，以演示细菌相互作用。为了展示直接培养和局部接触暴露方法，我们以具有纳米结构表面的镁合金为例。

1. 纳米材料的灭菌

注意：所有纳米材料在用于微生物培养前必须经过灭菌或消毒。可采用的方法包括加热、加压、辐射和化学消毒剂，但必须事先明确材料对每种方法的耐受性。 体外 实验。

1. 纳米颗粒
   注意：样品可保存在乙醇等有机溶剂中，或置于培养皿或容器中，随后以适当方法进行灭菌或消毒。为演示直接共培养方法，纳米颗粒采用以下方法进行灭菌。¹⁷ 直接暴露法
   1. 在200 °C的对流烘箱中对氧化镁纳米颗粒进行灭菌³⁰ 每次前60分钟 体外 实验
      ​注意：选择该方法是因为水蒸气和紫外光可能影响氧化镁纳米颗粒（nMgO）的结构¹⁷.
2. 块体材料
   注意：为演示直接培养法，以下方法用于对纳米结构材料进行灭菌。
   1. 直接培养法¹⁴，使用紫外线（UV）照射....

结果

已采用四种适用于不同材料类型和微生物种类的体外方法，展示了氧化镁纳米颗粒及纳米结构表面的抗菌活性鉴定结果。

方法A和方法B分别在细菌处于迟缓期（方法A）和对数期（方法B）时，检测其暴露于纳米颗粒24小时或更长时间后的细菌活性。方法A可提供最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的结果，而方法B用于确定纳米颗粒的抑制作用与杀菌作用。方法C检测细菌与纳米结构表面直接接触和间接接触情况下的细菌活性，方法D则检测在细胞-纳米结构界面特定区域上细菌活性，持续时间为24小时或更长。

所使用的方法见图1和图2，其结果展示在图3、图4、图5、图6、

讨论

我们已经展示了四个 体外 用于表征纳米颗粒和纳米结构表面抗菌活性的方法（A-D）。尽管这些方法均可随时间定量检测纳米材料对细菌生长和活性的影响，但在测定初始细菌接种密度、生长及随时间变化的活性时，所采用的具体方法存在一定差异。其中三种方法为直接共培养法（A）¹⁷直接培养法（C）¹⁴以及聚焦接触暴露法（D）¹⁶，通过计数单位体积内的菌落形成单位（CFU）来量化细菌在纳米材料暴露一段时间后的生长情况和存活率。相比之下，直接暴露法（B）用于量化细菌生长 通过 离散实时光密度（OD₆₀₀）测量。如果在定量菌落形成单位（CFUs）时存在时间限制，和/或动力学研究需要实时获取细菌密度读数，该方法也可应用于直接共培养、直接培养和聚焦接触暴露方法。若在直接暴露方法中所测试的细菌种类尚无已知的有效抗生素，则必须通过文献检索确定合适的抗生素及其最小抑菌浓度（MIC）值，作为纳米材料组的参考依据。可通过绘制标准化曲线来验证MIC值，该曲线反映特定时间点分光光度.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Milipore Sigma	Z336777
80 L NTRL 认证对流干燥烘箱	MTI Corporation	BPG-7082	https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
pH 8.5 的（羟甲基）氨基甲烷缓冲液；Tris 缓冲液	Sigma-Aldrich	42457
AnaSpec 高纯度硫黄素 T	Fisher Scientific	50-850-291
电子倍增电荷耦合器件数码相机	Hamamatsu	C9100-13
Falcon 15 mL 锥形管	Fisher Scientific	14-959-49B
戊二醛	Sigma-Aldrich	G5882
血细胞计数板	Brightline, Hausser Scientific	1492
电感耦合等离子体-原子发射光谱法（ICP-OES）	PerkinElmer	8000
倒置显微镜	Nikon	Eclipse Ti-S
LB 肉汤培养基	Sigma Life Science	L3022
LB 肉汤培养基 + 琼脂	Sigma Life Science	L2897
MacroTube 5.0	Benchmark Scientific	C1005-T5-ST
氧化镁纳米颗粒	US Research Nanomaterials, Inc	货号： US3310   M	MgO，纯度 ≥99%，粒径 20 nm
MS 半微量电子天平	Mettler Toledo	MS105D
硝酸纤维素膜	Fisherbrand	09-801A
非组织培养处理的 12 孔聚苯乙烯板	Falcon Corning Brand	351143
非组织培养处理的 48 孔聚苯乙烯板	Falcon Corning Brand	351178
非组织培养处理的 96 孔聚苯乙烯板	Falcon Corning Brand	351172
100 mm 培养皿	VWR	470210-568
15 mm 培养皿	Fisherbrand	FB0875713A
pH 计	VWR	SP70P
扫描电子显微镜（SEM）	TESCAN	Vega3 SBH
超声波破碎仪	VWR	97043-936
台式离心机	Fisher Scientific	accuSpin Micro 17
台式离心机	Eppendorf	Centrifuge 5430
胰蛋白胨大豆琼脂	MP	1010617
胰蛋白胨大豆肉汤	Sigma-Aldrich	22092-500G
紫外-可见分光光度计	Tecan	Infinite 200 PRO	https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10L	VWR	N/A
X 射线粉末衍射仪	Panalytical	N/A	PANalytical Empyrean Series 2