方法文章

体外评估纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性

DOI：

10.3791/64712

⸱

2023年4月21日

 ,  , 
1Microbiology Graduate Program, University of California, Riverside, 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside, 3Materials Science & Engineering Program, University of California, Riverside

本文内容

摘要

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我们介绍了四种使用 体外 技术评估纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性的方法。这些方法可以适用于研究不同纳米颗粒和纳米结构表面与各种微生物物种的相互作用。

摘要

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纳米颗粒和纳米结构表面（如银、氧化锌、二氧化钛和氧化镁）的抗菌活性以前已在临床和环境环境以及消费品中探索过。然而，所使用的实验方法和材料缺乏一致性，最终导致了相互矛盾的结果，即使在相同纳米结构类型和细菌种类的研究中也是如此。对于希望在产品设计中使用纳米结构作为添加剂或涂层的研究人员来说，这些相互矛盾的数据限制了它们在临床环境中的使用。

为了应对这一困境，在本文中，我们提出了四种不同的方法来确定纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性，并讨论了它们在不同场景中的适用性。调整一致的方法有望产生可重复的数据，这些数据可以在研究中进行比较，并针对不同的纳米结构类型和微生物物种实施。我们介绍了两种确定纳米颗粒抗菌活性的方法和两种纳米结构表面抗菌活性的方法。

对于纳米颗粒，直接共培养方法可用于确定纳米颗粒的最小抑制和最小杀菌浓度，直接暴露培养方法可用于评估纳米颗粒暴露引起的实时抑菌与杀菌活性。对于纳米结构表面，直接培养方法用于确定与纳米结构表面间接和直接接触的细菌的活力，并且聚焦接触暴露方法用于检查纳米结构表面特定区域的抗菌活性。我们讨论了在确定纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌特性时要考虑的 体外 研究设计的关键实验变量。所有这些方法的成本都相对较低，采用相对容易掌握和可重复的技术以实现一致性，并且适用于广泛的纳米结构类型和微生物物种。

引言

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仅在美国，每年就有 170 万人发生医院获得性感染 （HAI），其中每 17 例感染中就有 1 例导致死亡1。此外，据估计，HAI的治疗费用每年从280亿美元到450亿美元不等1，2。这些 HAI 主要由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 （MRSA）3，4 和铜绿假单胞菌 4 为主，它们通常从慢性伤口感染中分离出来，通常需要广泛的治疗和时间才能产生良好的患者预后。

在过去的几十年中，已经开发了多种抗生素类别来治疗与这些和其他致病菌相关的感染。例如，利福霉素类似物已被用于治疗MRSA，其他革兰氏阳性和革兰氏阴性菌感染以及分枝杆菌属感染5。在1990年代，为了有效治疗越来越多的结核分枝杆菌感染，额外的药物与利福霉素类似物联合使用以提高其有效性。然而，大约 5% 的结核分枝杆菌病例仍然对利福平5，6 耐药，....

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方案

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为了介绍直接共培养和直接暴露方法，我们使用氧化镁纳米颗粒（nMgO）作为模型材料来证明细菌相互作用。为了介绍直接培养和聚焦接触暴露方法，我们以具有纳米结构表面的镁合金为例。

1. 纳米材料的灭菌

注意:在微生物培养之前，所有纳米材料必须经过灭菌或消毒。可以使用的方法包括热、压力、辐射和消毒剂，但必须在 体外 实验之前确定每种方法的材料耐受性。

  1. 纳米粒子
    注意:样品可以储存在乙醇等有机溶剂中，也可以包装到培养皿或盒子中，然后以适当的方式进行灭菌或消毒。使用以下方法对纳米颗粒进行灭菌，以演示直接共培养方法17 和直接暴露方法。
    1. 在每次体外实验之前，在200°C对流炉30中对MgO纳米颗粒灭菌60分钟。
      注意:选择这种方法是因为水蒸气和紫外线可能会影响MgO纳米颗粒（nMgO）的结构17。
  2. 散装物料
    注意:纳米结构材料通过以下方法灭菌，以演示直接培养方法。
    1. 对于直接培养方法14，在开始 体外 研究之前，使用紫外线（UV）辐射对制备好的ZC21，....

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结果

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氧化镁纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性鉴定已使用适用于不同材料类型和微生物物种的四种 体外 方法提出。

方法A和方法B在滞后期（方法A）和对数期（方法B）暴露于纳米颗粒时检查细菌活性24小时或更长时间。方法A提供了有关MIC和MBC的结果，而方法B确定了纳米颗粒的抑制作用与杀菌效果。方法C检查与纳米结构表面直接和间接接触的细菌活性，方法D检查细胞 - 纳米结构界面选定区域上的细菌活性，持续时间为24小时或更长时间。

使用的方法如图1和图2所示，其结果如图3、图4、图5、图6、图7和图8所示。

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讨论

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我们提出了四种体外方法（A-D）来表征纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性。虽然这些方法中的每一种都量化了细菌随时间推移对纳米材料的生长和活力，但用于测量初始细菌接种密度、生长和活力随时间变化的方法存在一些差异。其中三种方法，直接共培养方法（A）17，直接培养方法（C）14和聚焦接触暴露方法（D）16，通过计算每单位体积的CFU来量化暴露于纳米材料一段时间后的细菌生长和活力。相比之下，直接曝光方法（B）通过离散实时光密度（OD600）测量来量化细菌生长。如果量化CFU有时间限制，和/或动力学研究需要实时细菌密度读数，该方法也可以应用于直接共培养、直接培养和聚焦接触暴露方法。如果对直接暴露方法中要测试的细菌种类没有有效的抗生素，则必须进行文献检索以确定正确的抗生素及其MIC值，以作为纳米材料基团的参考。可以通过完成标准化曲线来确认MIC值，该曲线绘制了分光光度法数据与特定时间点菌落形成单位的定量之间的关系。该过程将特定点培养物中存在的细胞数量与.......

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致谢

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作者感谢美国国家科学基金会（NSF CPET奖1512764和NSF PIRE 1545852），美国国立卫生研究院（NIH NIDCR 1R03DE028631），加州大学（UC）摄政教师发展奖学金，研究种子资助委员会（Huinan Liu）和加州大学河滨分校研究生研究指导计划授予Patricia Holt-Torres的资助。作者感谢加州大学河滨分校高级显微镜和微量分析中央设施（CFAMM）为使用SEM / EDS和Perry Cheung博士使用XRD提供的帮助。作者还要感谢Morgan Elizabeth Nator和Samhitha Tumkur在实验和数据分析方面的帮助。本文中表达的任何意见、发现、结论或建议均为作者的观点，并不一定反映美国国家科学基金会或美国国立卫生研究院的观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管Milipore SigmaZ336777
80 L NTRL 认证对流干燥箱 MTI CorporationBPG-7082https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
（羟甲基）氨基甲烷缓冲液 pH 8.5;Tris 缓冲液 Sigma-Aldrich 42457
AnaSpec 硫黄素 T 超纯级Fisher Scientific50-850-291
电子倍增电荷耦合器件数码相机 HamamatsuC9100-13
Falcon 15 mL 锥形管Fisher Scientific14-959-49B
戊二醛Sigma-Aldrich G5882
血球计数器Brightline， Hausser Scientific1492
电感耦合等离子体 - 直读光谱法 （ICP-OES）PerkinElmer8000
反相显微镜NikonEclipse Ti-S
Luria Bertani 肉汤Sigma 生命科学 L3022
Luria Bertani 肉汤 + 琼脂Sigma 生命科学 L2897
MacroTube 5.0 大管  Benchmark ScientificC1005-T5-ST
氧化镁纳米颗粒美国研究纳米材料公司库存 #： US3310   MMgO， 99+%， 20 nm
MS 半微量天平梅特勒-托利多MS105D
硝酸纤维素纸Fisherbrand09-801A
非组织处理的 12 孔聚苯乙烯板Falcon Corning 品牌 
非组织处理的 48 孔聚苯乙烯板Falcon Corning 品牌 
非组织处理的 96 孔聚苯乙烯板Falcon Corning 品牌 
培养皿 100 mmVWR470210-568
培养皿，15 mmFisherbrandFB0875713A
pH 计VWRSP70P
扫描电子显微镜 （SEM）TESCAN Vega3 SBH
超声波仪VWR97043-936
台式离心机Fisher ScientificaccuSpin Micro 17
台式离心机 EppendorfCentrifuge 5430
胰蛋白酶大豆琼脂MP1010617
胰蛋白酶大豆肉汤Sigma-Aldrich22092-500G
紫外-可见分光光度计 TecanInfinite 200 PROhttps://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10LVWRN/A
X射线功率折射 PanalyticalN/APANalytical Empyrean 系列 2
351143351178351172

参考文献

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  1. Haque, M., Sartelli, M., McKimm, J., Abu Bakar, M. Health care-associated infections - An overview. Infection and Drug Resistance. 11, 2321-2333 (2018).
  2. O'Connell, K. M. G. Combating multidrug-resistant bacteria: Current strategies for the discov....

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