我们介绍四种利用纳米颗粒和纳米结构表面评估其抗菌活性的方法 体外 这些方法可被调整用于研究不同纳米颗粒和纳米结构表面与多种微生物物种之间的相互作用。
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摘要
摘要
纳米颗粒和纳米结构表面（如银、氧化锌、二氧化钛和氧化镁）的抗菌活性此前已在临床、环境以及可食用食品产品中得到研究。然而，由于实验方法和所用材料缺乏一致性，即使针对相同类型的纳米结构和细菌物种的研究，也得出了相互矛盾的结果。对于希望在产品设计中将纳米结构作为添加剂或涂层的研究人员而言，这些不一致的数据限制了其在临床环境中的应用。
为应对这一难题，本文介绍了四种不同的方法来测定纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性，并讨论了这些方法在不同场景下的适用性。采用一致的方法有望获得可重复的数据，从而能够在不同研究之间进行比较，并适用于不同类型的纳米结构和微生物种类。我们介绍了两种测定纳米颗粒抗菌活性的方法，以及两种测定纳米结构表面抗菌活性的方法。
对于纳米颗粒，可采用直接共培养法测定其最低抑菌浓度和最低杀菌浓度，而通过直接暴露培养法可评估纳米颗粒暴露后对细菌的实时抑菌与杀菌活性。对于纳米结构表面，可采用直接培养法检测与纳米结构表面间接或直接接触的细菌存活率，并利用聚焦接触暴露法考察纳米结构表面特定区域的抗菌活性。我们讨论了需考虑的关键实验变量 体外 在确定纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌特性时的研究设计。所有这些方法成本相对较低，采用的技术相对易于掌握且可重复以保证一致性，适用于多种类型的纳米结构和微生物种类。
引言
仅在美国，每年就有170万人发生医院获得性感染（HAI），其中每17例感染中就有1例导致死亡1。此外，据估计，HAI的治疗费用每年在280亿至450亿美元之间1,2。这些医院获得性感染主要由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）3,4和铜绿假单胞菌4引起，这些病原体常从慢性伤口感染中分离得到，通常需要长期且复杂的治疗才能获得理想的患者预后。
在过去的几十年中，已开发出多种抗生素类别，用于治疗与这些及其他病原菌相关的感染。例如，利福霉素类似物已被用于治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、其他革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌感染，以及Mycobacterium spp. 感染5。在20世纪90年代，为了更有效地治疗日益增多的M. tuberculosis感染病例，研究人员将利福霉素类似物与其他药物联合使用，以提高其疗效。然而，约有5%的M. tuberculosis病例对利福平（rifampicin）仍具有耐药性5,6，且目前对多重耐药菌的担忧日益增加7。 目前，单独使用抗生素可能不足以有效治疗医院获得性感染（HAIs），这促使人们持续寻找替代性的抗菌治疗策略1。
重金属，例如银（Ag）8,9,10 和金（Au）11，以及陶瓷材料，例如二氧化钛（TiO2)12 和氧化锌（ZnO）13，以纳米颗粒（NP）形式存在（AgNP、AuNP、TiO₂）2NP 和 ZnONP）的抗菌活性已被研究，并被确认为潜在的抗生素替代物。此外，可生物降解材料如镁合金（Mg 合金）14,15,16，氧化镁纳米颗粒17,18,19,20,21，以及氢氧化镁纳米颗粒 [nMgO 和 nMg(OH)2，分别22,23,24，也已得到研究。然而，以往关于纳米颗粒的抗菌研究采用了不一致的材料和研究方法，导致所得数据难以甚至无法比较，且有时存在相互矛盾的情况18,19例如，不同研究中银纳米颗粒的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）存在显著差异。Ipe 等人25 评估了平均粒径约为26 nm的AgNPs的抗菌活性，以确定其对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的最小抑菌浓度（MIC）。所测定的MIC值为 P. aeruginosa, E. coli, S. aureus, 且MRSA分别为2 µg/mL、5 µg/mL、10 µg/mL和10 µg/mL。相比之下，Parvekar等26 评估了平均粒径为5 nm的AgNPs。在此情况下，AgNPs对目标物的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）均为0.625 mg/mL。 S. aureus此外，Loo 等人27 评估了尺寸为4.06 nm的AgNPs。当 E. coli 暴露于这些纳米颗粒后，其最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）分别为 7.8 µg/mL。最后，Ali 等人28 研究了平均尺寸为18 nm的球形AgNPs的抗菌特性。当 P. aeruginosa, 大肠杆菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）暴露于这些纳米颗粒后，其最低抑菌浓度（MIC）分别为27 µg/mL、36 µg/mL、27 µg/mL和36 µg/mL，最低杀菌浓度（MBC）分别为36 µg/mL、42 µg/mL和30 µg/mL。
尽管近年来纳米颗粒的抗菌活性已被广泛研究和报道，但目前尚无统一的标准来规范所使用的材料和研究方法，从而难以在不同研究之间进行直接比较。为此，我们提出两种方法：直接共培养法（方法A）和直接暴露法（方法B），以 在保持材料与方法一致的前提下，表征并比较纳米颗粒的抗菌活性。
除了纳米颗粒外，纳米结构表面也被研究用于抗菌活性。这些材料包括基于碳的材料，如石墨烯纳米片、碳纳米管和石墨29，以及纯镁（Mg）和镁合金。这些材料中的每一种都表现出至少一种抗菌机制，例如基于碳的材料对细胞膜造成的物理损伤，以及镁降解时通过释放活性氧（ROS）对代谢过程或DNA造成的损伤。此外，当锌（Zn）和钙（Ca）被用于形成镁合金时，可进一步细化镁基体的晶粒尺寸，从而与纯镁样品相比，显著减少细菌在基底表面的黏附14。为了验证抗菌活性，本文介绍了直接培养法（方法C），该方法通过定量直接和间接表面接触的细菌菌落形成单位（CFUs），随时间测定细菌在纳米结构材料表面及其周围区域的黏附情况。
表面纳米结构的几何形貌，包括尺寸、形状和取向，可能影响材料的杀菌活性。例如，Lin 等人16 通过阳极氧化和电泳沉积（EPD）在镁基底表面制备了不同纳米结构的MgO层。经过一段时间暴露于纳米结构表面后 体外，生长的 S. aureus 与未经处理的镁相比，经纳米结构表面处理的镁的细菌黏附显著减少。这表明，相较于未经处理的金属镁表面，纳米结构表面在抑制细菌黏附方面具有更强的效力。为了揭示不同纳米结构表面抗菌特性的差异机制，本文讨论了一种聚焦接触暴露方法（方法D），该方法可测定特定区域内细胞与表面之间的相互作用。
本文旨在介绍四种适用于不同纳米颗粒、纳米结构表面和微生物种类的体外实验方法。我们讨论了每种方法的关键注意事项，以获得一致且可重复的数据，便于比较分析。具体而言，直接共培养法17和直接暴露法用于评估纳米颗粒的抗菌性能。通过直接共培养法，可测定单一菌种的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度（分别为 MIC 和 MBC90-99.99） ，并可确定多种菌种的最有效浓度（MPC）。通过直接暴露法，可通过随时间变化的实时光密度读数，表征纳米颗粒在最低抑菌浓度下的抑菌或杀菌效果。直接培养法14适用于检测细菌与纳米结构表面直接或间接接触时的反应。最后，本文介绍了聚焦接触暴露法16，该方法通过将细菌直接接种于纳米结构表面的特定区域，并表征细胞-纳米结构界面处的细菌生长情况，以评估该区域的抗菌活性。该方法改进自日本工业标准 JIS Z 2801:200016，旨在聚焦于微生物-表面相互作用，排除样品整体降解对微生物培养中抗菌活性评价的干扰。
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方案
为了展示直接共培养和直接暴露方法，我们采用氧化镁纳米颗粒（nMgO）作为模型材料，以演示细菌相互作用。为了展示直接培养和局部接触暴露方法，我们以具有纳米结构表面的镁合金为例。
1. 纳米材料的灭菌
注意：所有纳米材料在用于微生物培养前必须经过灭菌或消毒。可采用的方法包括加热、加压、辐射和化学消毒剂，但必须事先明确材料对每种方法的耐受性。 体外 实验。
- 纳米颗粒
注意：样品可保存在乙醇等有机溶剂中，或置于培养皿或容器中，随后以适当方法进行灭菌或消毒。为演示直接共培养方法，纳米颗粒采用以下方法进行灭菌。17 直接暴露法- 在200 °C的对流烘箱中对氧化镁纳米颗粒进行灭菌30 每次前60分钟 体外 实验
注意：选择该方法是因为水蒸气和紫外光可能影响氧化镁纳米颗粒（nMgO）的结构17.
- 在200 °C的对流烘箱中对氧化镁纳米颗粒进行灭菌30 每次前60分钟 体外 实验
- 块体材料
注意：为演示直接培养法，以下方法用于对纳米结构材料进行灭菌。- 直接培养法14，使用紫外线（UV）照射对制备好的ZC21、Mg和T64样品进行消毒处理，持续4小时，然后开始后续操作 体外 研究。
- 对于聚焦接触暴露法16，所有样品在开始前需用紫外线照射消毒2小时 体外 研究。
- 或者，可使用环氧乙烷（EtO）对热敏感材料进行灭菌。
2. 直接共培养法（方法 A）
注意：在方法A中，将处于迟缓期的种子培养物中的细菌直接与特定浓度的纳米颗粒混合。为了检测纳米颗粒的抗菌活性，我们采用Nguyen等人17所述的实验方案。
- 纳米颗粒与纳米结构的表征
注意：使用X射线粉末衍射确认纳米结构的组成和形貌。- 纳米颗粒的测量
- 称取纳米颗粒的质量为每毫升所需质量的9倍，以满足3 mL样品的三份重复实验。例如，若需配制0.2 mg/mL的nMgO，则称取1.8 mg/mL。
注意：这可确保纳米颗粒在细菌培养物和肉汤中的均匀分布。 - 使用分析天平预先称重并去皮的5.0 mL微量离心管，测量所有纳米颗粒。
- 称取纳米颗粒的质量为每毫升所需质量的9倍，以满足3 mL样品的三份重复实验。例如，若需配制0.2 mg/mL的nMgO，则称取1.8 mg/mL。
- 纳米颗粒的测量
- 制备与培养细菌菌种
- 对于每一个 体外 实验，从-80 °C保存条件下取出细菌菌种。将每种细菌菌种各10 µL接种于5 mL适宜的培养基中。
- 将接种后的培养基置于37 °C、250 rpm的摇床培养箱中培养约16小时，过夜。
- 如果 金黄色葡萄球菌 物种培养后，通过加入400 µL每种过夜培养物进行传代培养 将培养物转入20 mL新鲜生长培养基中（每5 mL培养基加入100 µL），在37 °C、250 rpm条件下振荡培养额外4–6小时。
- 洗涤并计数细菌细胞以确定接种密度
注意：所需的接种密度为 7.8 × 106 CFU/mL 被确定为超过确诊尿路感染所需细胞数量的数值。- 将过夜培养的菌液按每份1 mL分装至1.5 mL微量离心管中，收集培养的细菌。根据需要制备足够数量的过夜细菌培养物分装样品，于1,956 × g离心10分钟 g 以达到所需的接种密度。
- 离心后，用移液器吸除细胞沉淀上方的上清液，并将上清液转移至收集容器中。用0.5 mL新鲜培养基重悬细胞沉淀。将两份0.5 mL的悬液合并，制成1 mL悬液，以将重悬细胞的1 mL等分试样减少至六份。再次以1,956 × g离心10分钟 g.
- 使用新鲜培养基进行第二次洗涤，步骤同2.3.2，以将重悬洗涤后细胞的1 mL等分试样减少至三份。
- 完成第三个循环，步骤同2.3.2，但将细胞沉淀重悬于0.33 mL三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris缓冲液，pH 8.5）中。将三份体积均为0.33 mL的悬浮液合并至一个1.5 mL微量离心管中。在1,956 × g条件下重复离心10分钟 g.
注意：Tris 缓冲液不含 Mg2+ 或 Ca2+ 离子31这对于使用电感耦合等离子体-原子发射光谱法（ICP-OES）测定镁含量至关重要2+ 和 Ca2+ 培养后上清液中的离子。相比之下，磷酸盐缓冲盐水（PBS）中存在的磷酸盐32，例如，螯合 Mg2+ 或 Ca2+ 离子33,34,35 并导致ICP-OES数据解读中的混淆。 - 去除细胞沉淀中的上清液。用1 mL新鲜Tris缓冲液重悬细胞沉淀，此为细胞悬液——对数生长期的细菌接种培养物。
- 使用血细胞计数板测定细胞悬液浓度（细胞/毫升）。
- 接种细菌培养物的制备
注意：样品总体积为 3 mL，设三个重复组（共 9 mL）。- 确定所需细菌接种培养物的总体积。制备接种培养物时，使用 C1V1 = C2V2 用于计算制备 7.8 × 10⁶ 个细胞接种培养所需细胞悬液的体积6 细胞/mL。加入计算所得体积的细胞悬液（V1) 加至所需体积的培养基（V2).
- 确定实际的细菌接种密度（CFU/mL）。进行10倍系列稀释至10-4. 涂布平板法接种10-4 稀释后涂布于适当的生长琼脂平板上，过夜培养。培养结束后，计数菌落数量，并计算每毫升的菌落形成单位（CFU/mL）。
- 细菌与纳米颗粒培养物的制备
- 在12孔非组织培养处理的聚苯乙烯板中，根据所需孔数，每孔分装2 mL细菌接种培养物。
- 在每个含有预先称重的nMgO的5 mL微量离心管中，加入3 mL细菌接种培养液。短暂涡旋振荡以使nMgO与细菌充分混匀。将混合液每1 mL分装至三个独立的孔中，为每种预设质量的nMgO制备三个重复样本。每次分装1 mL前，用移液器将细菌/nMgO混合液吹打2–3次，以保持nMgO处于悬浮状态。
注意：对照样品将包括仅含3 mL细胞的样品、仅含3 mL培养基的样品，以及含有所用纳米颗粒最低和最高浓度的3 mL样品。这些样品的制备方法同步骤2.5.2。所有对照样品均设置三个重复。 - 将所有12孔板在37 °C、120 rpm条件下孵育24 h。
- 测定暴露于纳米氧化镁（nMgO）后细菌细胞的生长情况
- 在细菌培养物过夜培养后，用移液器将每份3 mL样品收集到单独的15 mL锥形管中。
- 使用96孔板进行1:10倍比稀释。确定用于对所有含菌样品进行连续稀释所需的列数。在相应列的B至G行各孔中加入180 µL Tris缓冲液。
- 轻轻涡旋每支含有细菌样品的15 mL圆锥形离心管，然后取50 µL加入A行的各个独立孔中。
- 对于A行的每个孔，将20 µL转移至B行对应的孔（例如，A1转移至B1），并通过移液操作短暂混匀，使总体积达到200 µL。使用无菌移液枪头，从B行各孔中取20 µL转移至C行对应孔。依此模式继续操作，直至G行各孔体积均为200 µL，完成从10倍系列稀释−1 在B行至10−6 在 G 行。
- 将每孔中的100 µL菌液移至合适的选择性培养基平板上，用涂布棒均匀涂布以分散菌液。将平板置于37 °C摇床中过夜培养。随后于37 °C恒温培养箱中继续培养24 h。
- 检查平板，计数含有约25-300个菌落的平板。若可能，选择相同稀释度的平板。根据每块平板上的菌落数计算CFU/mL。
- 孵育后pH值的评估
注意：请遵循每种pH计型号的制造商说明书。- 使用 pH 4、pH 7 和 pH 10 的标准缓冲溶液预先校准 pH 计。将 pH 探头插入 15 mL 锥形管中，测定每个细菌样品的 pH 值。
- 样品制备用于ICP-OES
注意：ICP-OES 用于测定 Mg 的浓度2+ 和 Ca2+ 离子。这些 阳离子被认为具有重要作用，因为每种阳离子都参与细胞代谢。- 将步骤 2.6.1 中准备的每个 15 mL 离心管在 5,724 × g 条件下离心 5 分钟 g 离心以沉淀细胞和纳米颗粒碎片。
- 使用15 mL离心管，将30 µL上清液加入2.97 mL的18.2 Ω纯化水中，配制成1:100的稀释液。
注意：稀释倍数可根据预估的离子浓度和光谱仪的检测限进行调整。 - 使用 ICP-OES 检测样品。
3. 直接暴露法（方法B）
注意：如果所选细菌的生长速率未知，则在实施本方法之前必须完成生长曲线的标准化。
- 测定目标纳米颗粒暴露后对细菌的实时抑菌和杀菌活性。
- 按照步骤2.1-2.1.2.2中所述方法制备所需浓度的纳米颗粒。每种质量的纳米颗粒需准备两份：一份加入含3 mL处于对数生长期细菌培养物的样本中，另一份加入不含细菌的3 mL培养基中作为对照组。
- 确定待测细菌种类适用的抑菌性和杀菌性抗生素。
注意：必须了解每种抗生素的最低抑菌浓度。
- 计算所有纳米颗粒、抗生素及对照样品进行3 mL三重复实验所需的细菌培养物体积总量。
注意：需要加入等体积的无菌培养基。如果计划使用分光光度法，则需调整总体积，以容纳比色皿所需的0.5 mL至1.0 mL体积。 - 第1天：针对每一份 在 体外实验，按照步骤 2.2.1-2.2.2 制备过夜培养物。
- 第2天：确认酶标仪设置可兼容在600 nm波长下测量96孔板的光密度。使用96孔板，以200 µL等分试样测量样品。
- 测定初始细菌培养物的OD值600 在0.01的密度下开始初始孵育期，此密度用于在添加纳米颗粒和抗生素之前的初始孵育阶段。
- 从摇床培养箱中收集过夜培养的细菌菌液。
- 对于每种待测材料（例如，预称量的纳米颗粒或抗生素），分别制备一个细菌培养物，其OD600 0.01。使用足够大的容器以容纳所需体积的细胞培养液（例如，灭菌的锥形瓶或50 mL离心管）。
- 将过夜培养的细菌样品用生长培养基稀释，取三份200 µL生长培养基加入三个孔中，再取三份200 µL细菌培养物加入另外三个孔中（例如A1至A6）。
- 将96孔板放入酶标仪中并进行扫描。
注意：每个扫描孔的读数取平均值，以获得均值。 - 计算悬浮液中细菌密度时，取每个含有三份样本的孔的平均值。
- 为测定细菌的光密度，需从细菌样品的平均值中减去肉汤空白对照的平均值。
- 如果需要进一步调整细菌悬液，可根据需要继续添加肉汤或过夜培养的细菌，并在酶标仪中重复扫描，直至达到所需的OD值600 达到约 0.01 时。
- 37 °C、150 rpm 振荡培养至对数生长期。
- 从摇床培养箱中取出细菌培养物。
- 分装3 mL的OD600 将0.01的菌液分别加入已标记的15 mL锥形管中，用于实验组和对照组样品，每组设三个重复。
- 将200 µL细菌培养物分装至96孔板的三个孔中，使用酶标仪测定样品。
- 按照之前步骤 3.4.2.2 和步骤 3.4.2.6 中所述计算读数—— "-0.5 小时阅读".
- 细菌/纳米颗粒混合物的制备与测量
- 将无菌培养基按与细菌培养物等量分装，每份3 mL，分装至已标记的15 mL锥形管中，作为对照样品（设三个重复）。
- 为制备细菌/纳米颗粒悬浮液和无菌培养基/纳米颗粒悬浮液，从每组三个15 mL锥形管中各取出1 mL细菌培养物或培养基。
- 将1 mL等分试样加入含有预定量纳米颗粒的5 mL离心管中，短暂涡旋混匀。
- 从5 mL离心管中，将1 mL等分的细菌/纳米颗粒或培养基/纳米游戏副本转移回15 mL锥形管，以使纳米颗粒均匀分布。
注意：每次吸取1 mL等分试样前，需将细菌/纳米颗粒混合液吹打2至3次，以保持纳米颗粒悬浮。
- 细菌/抗生素混合物的制备与测定
- 将孵育后的细菌培养物各3 mL分装至已相应标记的15 mL锥形管中，用于制备细菌/抗生素培养物。
- 所有样品制备完成后，将每种样品各200 µL分装至96孔板的各个孔中。
- 将板放入板式读数仪中，并开始扫描—— "0 h" 读数
- 将含有样品的15 mL离心管放入37 °C、150 rpm的恒温振荡培养箱中。按照步骤3.4.2.2和步骤3.4.2.6中所述方法记录所有数据。
- 完成0 h读数后约15分钟，重复步骤3.7.2–3.7.3中所述操作。 "0.5 小时" 读数
- 在确定的0 h后，每90分钟重复步骤3.7.2至步骤3.7.3的操作，共进行六个循环；全程耗时9 h。
- 第六个循环结束后，将样品置于37 °C、150 rpm的振荡培养箱中继续孵育15小时。重复步骤3.7.2至3.7.3中所述操作，获取24小时读数。按照步骤3.4.2.2和步骤3.4.2.6中所述方法记录所有数据。
4. 直接培养法（方法C）
注意：在方法C中，将处于迟缓期的细菌接种培养物直接放置于目标纳米结构表面。为检测纳米结构的抗菌活性，我们采用Zhang等人14描述的方案。为演示该直接培养方法，使用ZC21（Mg-Zn-Ca合金）和Mg针作为样品。
- 制备与培养细菌菌种
- 对于每一个 在 体外实验，按照步骤 2.2.1-2.2.2 制备过夜培养物。
- 洗涤并计数细菌以确定接种密度
注意：所需的接种密度为 7.5 × 105 每毫升菌落形成单位（CFU/mL）被确定为导致骨科感染的报告细胞浓度14.- 从摇床培养箱中取出过夜培养的细菌培养物。
- 按照步骤 2.3.2–2.3.2.3 洗涤并收集细菌，但在每次洗涤步骤中，将新鲜培养基替换为改良模拟体液（rSBF）。
注意：rSBF 是一种缓冲溶液，其离子浓度模拟了人血浆。然而，rSBF 仅含有无机化合物，不含任何生物有机化合物（如蛋白质）。为解决这一问题，将胎牛血清（FBS）与 rSBF 混合，以模拟人血的组成，从而在实验条件下更真实地模拟磷灰石在钙化组织中的自然形成过程36. - 去除细胞沉淀的上清液。用1 mL添加了10% FBS的rSBF重悬细胞沉淀，制成细胞悬液。
- 使用血细胞计数板测定细胞悬液浓度（细胞/毫升）。将细胞悬液稀释至浓度为 7.5 × 105 细胞/mL，加入10% FBS的rSBF中。按照步骤2.4.1制备接种培养物。
- 在步骤 2.4.2 之后确定实际的接种密度。
- 将细菌细胞悬液分配至培养孔中的样品上。
- 将样品和对照样品分别加入48孔非组织培养处理的聚苯乙烯板的各个孔中。
- 将0.75 mL细胞悬液分装至含有样品和对照的每孔中。将48孔板放入37 °C、120 rpm振荡培养箱中孵育24 h。
- 细菌浓度的表征
- 孵育24小时后，收集样品并分别放入已标记的收集管中。
- 从每组中采集两个样品，分别放入已标记的5.0 mL 微量离心管中。每管加入2 mL rSBF。
- 将4.4.2步骤中收集的样品放入超声水浴中，超声处理10分钟。每超声5分钟后，将每个样品涡旋振荡5秒。
- 收集含有新脱离细菌细胞的rSBF，并将悬液转移至已标记的洁净微量离心管中。
- 系列稀释与细菌涂布平板
- 按照步骤 2.6.2–2.6.6 对细菌悬液进行系列稀释并涂布平板。
- 按照步骤 2.7 评估培养基孵育后的 pH 值。
- 按照第2.8步所述方法制备用于ICP-OES的培养后培养基。
5. 聚焦接触暴露法（方法 D）
注意：在方法D中，将硝酸纤维素滤膜上的细菌直接接触纳米结构表面的感兴趣区域。该方法可最大限度地减少细菌培养物中整体样品降解对细菌活性的干扰。为检测纳米表面的抗菌活性，我们采用Lin等16所述的实验方案。
- 按照步骤 2.2.1–2.2.2.1 的操作流程制备细菌接种培养物。在完成步骤 2.4.2 后确认实际接种密度。
- 将样品裁剪为 1 × 1 cm2 的正方形尺寸。每种样品类型均需准备三个重复样本。如有需要，将样品置于直径 15 mm、高 10 mm 的三维（3D）支架上。将样品及其支架放入未经组织培养处理的聚苯乙烯孔板中的一个孔内。
- 将硝酸纤维素膜剪裁至直径 1 cm，进行灭菌处理。将制备好的硝酸纤维素膜放置于含有适当培养基的琼脂平板上。
- 用移液器将 50 µL 稀释后的细菌培养液滴加到滤膜表面。
- 用移液器将 50 µL 适当的培养基滴加至每个样品表面的中心位置。
- 使用灭菌镊子从琼脂平板表面取出硝酸纤维素膜。小心翻转硝酸纤维素膜，并将其放置于样品表面，使细菌与 50 µL 培养基以及目标纳米结构表面充分接触。
- 向每个含有样品的孔中加入 1 mL Tris 缓冲液以维持湿度。将含有所有样品的聚苯乙烯孔板在 37 °C 下孵育 24 小时。
- 从各样品表面回收硝酸纤维素膜，分别放入 5 mL Tris 缓冲液中。将收集的滤膜及具有纳米结构的材料样品涡旋振荡 5 秒。
- 对每个样品进行 10 分钟超声处理，在 5 分钟和 10 分钟时分别再次涡旋振荡 5 秒。
- 收集所有样品中的 Tris 缓冲液悬浮液，并将每份液体转移至独立的新的收集管中。
- 按照步骤 2.6.2–2.6.6 对样品进行系列稀释并涂布平板。
6. 细菌与纳米材料的培养后表征
- 使用扫描电子显微镜（SEM）检测细菌黏附性与形态
- 过夜孵育后，向48孔非组织培养处理的聚苯乙烯板的每孔中加入10%戊二醛，直至完全覆盖样品。孵育1小时以固定细菌细胞。
- 将戊二醛吸入废液瓶中，用Tris缓冲液对所有样品冲洗3次，以去除未黏附的细菌。
- 使用30%、75%和100%乙醇分别脱水30分钟16.
注意：建议使用临界点干燥仪对样品进行干燥。在室温下将样品晾干24小时并非理想方法。 - 使用导电胶带（如铜胶带或碳胶带）将样品固定在扫描电镜样品台（SEM stub）上。对样品表面进行镀膜处理 通过 溅射镀膜以在成像前提供导电性（例如，在20 mA条件下对附着细菌的镁板进行铂/钯（Pt/Pd）镀膜45秒）16).
注意：涂层材料、处理时间和操作电流可能因样本类型的不同而有所变化。 - 使用扫描电子显微镜（SEM），在适当的工作距离和加速电压下，以所需的放大倍数对样品上的细菌进行成像。例如，采用配备二次电子探测器的SEM，在5 mm的工作距离和10 kV的加速电压下进行成像16.
- 使用扫描电子显微镜（SEM）观察培养后纳米材料样品的表面形貌。
- 对于纳米材料，使用Tris缓冲液洗涤样品3次，以去除未附着在样品上的游离细菌。对于纳米颗粒，必要时通过超声处理将颗粒分散于不影响样品性质的溶剂中，以实现更佳的分散效果。
- 洗涤步骤后将样品干燥。
- 使用碳或铜双面导电胶带将样品固定在扫描电镜样品台上。
- 使用溅射镀膜仪（如步骤6.1.4所述）在成像前制备Pt/Pd导电表面层。按照步骤6.1.5所述采集样品图像。
- 使用EDS在适当的加速电压下，按所需放大倍数分析表面元素组成（例如，在完成SEM分析后以10 kV进行）16).
- 细菌黏附的荧光成像
- 使用荧光显微镜观察样品前，先用 Tris 缓冲液清洗样品 3 次，在室温下空气干燥。
- 按照既定方案，用 10 µM 刚果红T 荧光染料对每个样品进行染色37.
- 使用倒置显微镜进行细菌黏附的荧光成像 并配备电子倍增电荷耦合器件数字相机。
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结果
已采用四种适用于不同材料类型和微生物种类的体外方法，展示了氧化镁纳米颗粒及纳米结构表面的抗菌活性鉴定结果。
方法A和方法B分别在细菌处于迟缓期（方法A）和对数期（方法B）时，检测其暴露于纳米颗粒24小时或更长时间后的细菌活性。方法A可提供最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的结果，而方法B用于确定纳米颗粒的抑制作用与杀菌作用。方法C检测细菌与纳米结构表面直接接触和间接接触情况下的细菌活性，方法D则检测在细胞-纳米结构界面特定区域上细菌活性，持续时间为24小时或更长。
所使用的方法见图1和图2，其结果展示在图3、图4、图5、图6、
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讨论
我们已经展示了四个 体外 用于表征纳米颗粒和纳米结构表面抗菌活性的方法（A-D）。尽管这些方法均可随时间定量检测纳米材料对细菌生长和活性的影响，但在测定初始细菌接种密度、生长及随时间变化的活性时，所采用的具体方法存在一定差异。其中三种方法为直接共培养法（A）17直接培养法（C）14以及聚焦接触暴露法（D）16，通过计数单位体积内的菌落形成单位（CFU）来量化细菌在纳米材料暴露一段时间后的生长情况和存活率。相比之下，直接暴露法（B）用于量化细菌生长 通过 离散实时光密度（OD600）测量。如果在定量菌落形成单位（CFUs）时存在时间限制，和/或动力学研究需要实时获取细菌密度读数，该方法也可应用于直接共培养、直接培养和聚焦接触暴露方法。若在直接暴露方法中所测试的细菌种类尚无已知的有效抗生素，则必须通过文献检索确定合适的抗生素及其最小抑菌浓度（MIC）值，作为纳米材料组的参考依据。可通过绘制标准化曲线来验证MIC值，该曲线反映特定时间点分光光度...
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致谢
作者感谢美国国家科学基金会（NSF CBET 项目 1512764 和 NSF PIRE 项目 1545852）、美国国立卫生研究院（NIH NIDCR 1R03DE028631）、加州大学（UC）校长教职发展奖学金、加州大学研究委员会种子基金（Huinan Liu）以及授予 Patricia Holt-Torres 的加州大学河滨分校研究生研究导师项目资助的经费支持。作者感谢加州大学河滨分校先进显微镜与微分析中心设施（CFAMM）在使用扫描电子显微镜/能谱仪（SEM/EDS）方面提供的协助，以及 Perry Cheung 博士在使用 X 射线衍射仪（XRD）方面提供的支持。作者还感谢 Morgan Elizabeth Nator 和 Samhitha Tumkur 在实验和数据分析方面提供的帮助。本文所表达的任何观点、发现、结论或建议均为作者个人观点，不一定反映美国国家科学基金会或美国国立卫生研究院的立场。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | Milipore Sigma | Z336777 | |
| 80 L NTRL 认证对流干燥烘箱 | MTI Corporation | BPG-7082 | https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx |
| pH 8.5 的（羟甲基）氨基甲烷缓冲液；Tris 缓冲液 | Sigma-Aldrich | 42457 | |
| AnaSpec 高纯度硫黄素 T | Fisher Scientific | 50-850-291 | |
| 电子倍增电荷耦合器件数码相机 | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Falcon 15 mL 锥形管 | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| 戊二醛 | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| 血细胞计数板 | Brightline, Hausser Scientific | 1492 | |
| 电感耦合等离子体-原子发射光谱法（ICP-OES） | PerkinElmer | 8000 | |
| 倒置显微镜 | Nikon | Eclipse Ti-S | |
| LB 肉汤培养基 | Sigma Life Science | L3022 | |
| LB 肉汤培养基 + 琼脂 | Sigma Life Science | L2897 | |
| MacroTube 5.0 | Benchmark Scientific | C1005-T5-ST | |
| 氧化镁纳米颗粒 | US Research Nanomaterials, Inc | 货号： US3310 M | MgO，纯度 ≥99%，粒径 20 nm |
| MS 半微量电子天平 | Mettler Toledo | MS105D | |
| 硝酸纤维素膜 | Fisherbrand | 09-801A | |
| 非组织培养处理的 12 孔聚苯乙烯板 | Falcon Corning Brand | 351143 | |
| 非组织培养处理的 48 孔聚苯乙烯板 | Falcon Corning Brand | 351178 | |
| 非组织培养处理的 96 孔聚苯乙烯板 | Falcon Corning Brand | 351172 | |
| 100 mm 培养皿 | VWR | 470210-568 | |
| 15 mm 培养皿 | Fisherbrand | FB0875713A | |
| pH 计 | VWR | SP70P | |
| 扫描电子显微镜（SEM） | TESCAN | Vega3 SBH | |
| 超声波破碎仪 | VWR | 97043-936 | |
| 台式离心机 | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| 台式离心机 | Eppendorf | Centrifuge 5430 | |
| 胰蛋白胨大豆琼脂 | MP | 1010617 | |
| 胰蛋白胨大豆肉汤 | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| 紫外-可见分光光度计 | Tecan | Infinite 200 PRO | https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro |
| VWR Benchmark Incu-shaker 10L | VWR | N/A | |
| X 射线粉末衍射仪 | Panalytical | N/A | PANalytical Empyrean Series 2 |
参考文献
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