由于ALDH1A1是干性的重要生物标志物，因此在活细胞中检测其活性的方法在癌症研究中至关重要。在本研究中，我们采用了一种亚型选择性荧光探针，用于测定五种卵巢癌细胞系中ALDH1A1活性的相对水平。
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方法文章
基于醛脱氢酶1A1活性应用AlDeSense对卵巢癌细胞进行分层
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
癌症治疗后的复发通常归因于一类被称为癌症干细胞（CSCs）的肿瘤细胞亚群的持续存在，这类细胞具有极强的肿瘤起始能力和自我更新能力。根据肿瘤来源的不同（例如卵巢），CSC的表面生物标志物谱可能存在显著差异，这使得通过免疫组织化学染色来鉴定这些细胞成为一项具有挑战性的工作。相反，醛脱氢酶1A1（ALDH1A1）因其在几乎所有前体细胞（包括CSCs）中保守的表达模式，已成为识别CSCs的优良标志物。ALDH1A1同工酶属于一个包含19种酶的超家族，负责将多种内源性和外源性醛类氧化为相应的羧酸产物。Chan等人近期开发了AlDeSense，这是一种针对ALDH1A1活性的同工酶选择性“开启型”探针，同时还合成了非反应性的匹配对照试剂（Ctrl-AlDeSense），以排除脱靶染色的干扰。该同工酶选择性工具已通过检测K562骨髓性白血病细胞、乳腺球及黑色素瘤来源的CSC异种移植模型中的ALDH1A1活性，被证明是一种多功能的化学工具。本文通过额外的荧光测定、共聚焦显微镜和流式细胞术实验，展示了该探针的应用价值，并测定了五种卵巢癌细胞系中ALDH1A1活性的相对水平。
引言
肿瘤干细胞（CSCs）是一类具有类似干细胞特性的肿瘤细胞亚群1。与非癌变的干细胞类似，CSCs 具有自我更新和增殖的非凡能力。此外，由于其内在机制（如 ATP 结合盒转运蛋白的上调），CSCs 常能逃避免疫清除，在初始手术减瘤以及后续辅助治疗中得以存活2。由于 CSCs 在治疗耐药3、复发4和转移5中起着关键作用，已成为癌症研究的重点。尽管存在多种可用于识别 CSCs 的细胞表面抗原（例如 CD133）6，但利用细胞质中醛脱氢酶（ALDHs）的酶活性已成为一种有吸引力的替代方法7。ALDHs 是由 19 种酶组成的超家族，负责催化内源性和外源性活性醛类氧化为相应的羧酸产物8。
一般来说，醛类解毒对于保护细胞免受不利的交联反应和氧化应激至关重要，这些损伤可能破坏干细胞的完整性9此外，1A1 亚型调控视黄酸代谢，进而影响细胞干性 通过 视黄醛信号传导10. AlDeSense
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方案
1. 测定卵巢癌细胞匀浆中总ALDH1A1活性 通过 荧光测定法
- 解冻 1 × 106 T25 细胞培养瓶中的细胞，加入 5 mL 下述细胞培养基：
- IGROV-1 和 PEO4：含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素（P/S）的 Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640 培养基。
- BG-1 和 Caov-3：含 10% FBS 和 1% P/S 的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。
- OVCAR-3：RPMI 1640 培养基，含 20% FBS、1% P/S 和 0.01 mg/mL 胰岛素。
- 将细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养2 传代2到3次。传代前确保细胞融合度不超过80%–90%。
- 用0.25%胰蛋白酶消化细胞10分钟，使用自动细胞计数仪计数，并将1 × 10⁶个细胞离心成细胞沉淀7 细胞 通过 25 °C下离心（180 × g）5分钟。
- 小心移除上清液 通过 吸取，加入1 mL 1×PBS重悬细胞以洗涤沉淀，再次离心收集细胞沉淀 通过 离心，条件与步骤4中所述相同。
- 将细胞重悬于含....
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结果
卵巢癌细胞匀浆中总ALDH1A1活性
本实验测得各细胞系的平均诱导倍数分别为：BG-1（1.12 ± 0.01）；IGROV-1（1.30 ± 0.03）；Caov-3（1.72 ± 0.06）；PEO4（2.51 ± 0.29）；以及OVCAR-3（10.25 ± 1.46）（图2）。
图2：通过荧光测定法测量各卵巢癌细胞系匀浆中亚型选择性染料的荧光增强倍数（均值 ± 标准差）（n = 3）。
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讨论
广谱选择性是许多醛脱氢酶探针的主要局限；然而，近期已有若干种亚型选择性探针的实例被报道32,33,34,35,36,37,38,39,40,41本研究中使用的亚型选择性荧光探针是首个经过合理设计的探针，即使在存在大量竞争性酶的情况下，仍仅与ALDH1A1亚型发生反应。11,
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披露
我们披露了一项关于 AlDeSense 技术的待批准专利（US20200199092A1）。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（R35GM133581，授予 JC）和伊利诺伊州癌症中心研究生奖学金（授予 SG）资助。JC 感谢卡米尔和亨利·德雷福斯基金会提供的支持。作者感谢 Thomas E. Bearrood 博士在制备 AlDeSense 和 AlDeSense AM 储液过程中的初期贡献。感谢 Oliver D. Pichardo Peguero 先生和 Joseph A. Forzano 先生在制备多种合成前体方面的协助。感谢 Erik Nelson 教授（伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校分子与整合生理学系）提供 Caov-3、IGROV-1 和 PEO4 细胞。感谢 Paul Hergenrother 教授（伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校化学系）提供 BG-1 细胞。感谢卡尔·R·沃斯基因组生物学研究所核心设施提供蔡司 LSM 700 共聚焦显微镜及相应软件的使用权限。感谢流式细胞术设施提供 BD LSR II CMtO 分析仪的使用权限。感谢 Sandra McMasters 博士和细胞培养基设施在细胞培养基制备方面的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 不含钙、镁和碳酸氢钠的HBSS中的0.25%胰蛋白酶和0.1%EDTA | 康宁 | 25-050-CI | |
| 1×磷酸盐缓冲液 | 康宁 | 21-040-CMX12 | |
| AccuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| AlDeSense | 自行合成 | ||
| BG-1 | 由伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校 Paul Hergenrother 教授实验室提供 | ||
| BioLite 25 cm2 烧瓶 | 赛默飞世尔科技 | 130189 | |
| 生物安全柜 1300 系列 A2 | 赛默飞世尔科技 | ||
| Caov-3 | 由伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校 Erik Nelson 教授实验室提供 | ||
| 细胞匀浆器 | Fisher Scientific | ||
| Centrifuge 5180R | Eppendorf | 22627040 | |
| 对照-AlDeSense | 自行合成 | ||
| DMEM，10% FBS，1% P/S | 由伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校细胞培养基实验室制备 | ||
| Falcon 圆底聚苯乙烯试管，带细胞滤网 snap 盖，5 mL | 康宁 | 352003 | |
| FCS Express 6 | 由伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校 CMtO 提供 | ||
| 荧光显微镜 | EVOS | ||
| 荧光计 | Photon Technology International | ||
| Forma Series II 水套式 CO2 培养箱 培养箱 | Fisher Scientific | 3110 | |
| IGROV-1 | 由伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校 Erik Nelson 教授实验室提供 | ||
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 | ||
| Innova 42R 恒温摇床 | |||
| LSM 700 | Zeiss | ||
| LSR II | BD | ||
| Nunc Lab-Tek 带孔 #1.0 硼硅酸盐盖玻片培养系统 | 赛默飞世尔科技 | 155383 | |
| OVCAR-3 | ATCC | HTB-161 | |
| PEO4 | 由伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校 Erik Nelson 教授实验室提供 | ||
| Pierce蛋白酶抑制剂片剂 | 赛默飞世尔科技 | A32963 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Cultrex | 3438-100-01 | |
| 摇床 | VWR | ||
| RPMI，10% FBS，1% P/S | 由伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校细胞培养基实验室制备 | ||
| RPMI，20% 胎牛血清，1% 青霉素-链霉素，0.01 mg/mL 胰岛素 | 由伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校细胞培养基实验室制备 |
参考文献
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukaemia is organised as a heirarchy that originates from a primitive haematopoetic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC tr....
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重印与许可
