优化的胶原蛋白表面固定化方法及胶原结合实验方案

摘要

本研究提供了一种优化的实验方案，可重复性地将I型和III型胶原固定于微孔板上并进行定量，随后采用改进的方法 体外 使用时间分辨荧光法研究胶原-化合物相互作用的结合实验方案。提供了后续逐步数据分析与数据解释方法。

摘要

纤维化是多种组织对损伤或损害产生的一种修复性反应。然而，若纤维化过度，则可导致组织瘢痕形成和器官功能衰竭，与高发病率和高死亡率相关。胶原蛋白是驱动纤维化过程的关键因子，其中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白是多种纤维化疾病中主要参与的类型。与用于固定其他蛋白质（如弹性蛋白、白蛋白、纤连蛋白等）的传统方案不同，目前尚无易于获取的、可重复地固定不同类型胶原蛋白以形成稳定包被的综合性实验方案。胶原蛋白的固定具有出乎意料的挑战性，因为多种实验条件可能影响其固定效率，包括胶原蛋白类型、pH值、温度以及所用微孔板的类型。本文提供了一种详细的实验方案，用于可重复地固定并定量Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白，从而实现 稳定且可重复的凝胶/薄膜的制备方法。此外，本研究还展示了如何进行、分析和解读 体外 时间分辨荧光结合研究用于探究胶原蛋白与候选胶原结合化合物（例如，与携带铕[Eu(III)]的金属螯合物偶联的肽）之间的相互作用。该方法可广泛应用于多种生物医学领域，包括 分子成像领域的靶向成像探针开发、药物研发、细胞毒性研究、细胞增殖研究以及免疫分析。

引言

纤维性结缔组织在组织损伤后自然愈合过程中积聚的现象被称为纤维化。然而，如果纤维组织的沉积未能及时终止，并持续超出组织修复所需的程度，则会导致过度纤维化^1,2。过度纤维化会损害器官的生理功能，可能导致器官损伤甚至器官衰竭^3,4,5。纤维化的两个主要驱动因素是细胞外基质（ECM）蛋白I型和III型胶原⁶。胶原是一种存在于多种器官中的结构蛋白，约占人体总蛋白含量的三分之一¹。通过人类基因组测序已鉴定出28种不同类型的胶原，其中最丰富的是纤维状胶原⁷。主要的纤维状胶原为I型胶原，它赋予细胞外基质抗张强度和抗变形能力⁸。III型胶原是一种提供弹性的结构成分，通常与I型胶原共定位。它在胚胎发生期间表达，在成人的皮肤、肌肉和血管中天然存在，但含量较少⁹。

在体 胶原蛋白的合成始于细胞内过程，其中mRNA在细胞核中转录，随后转移至细胞质中....

方案

注意：本工作中使用的所有产品信息均列于材料表中。

1. 胶原蛋白固定化

注意：确保结合测定中使用的微孔板的每个孔周围均有相邻的空孔，以避免荧光串扰。此部分操作需在冰上进行，因为胶原蛋白在温度与 pH 值升高时会自组装。请在组织培养超净工作台内于无菌条件下进行此操作，因为微孔板随后将在组织培养（TC）培养箱中孵育。

1. I 型胶原在 96 孔微孔板上的固定（图 2）
   ​第 1 天
   1. 准备一个装有冰块的硅胶托盘。将装有 I 型胶原的瓶子、预冷的 10x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 以及微孔板置于冰上，并用 70% 乙醇喷洒所有物品。将材料置于组织培养通风橱下。
   2. 使用等体积的 I 型胶原和 10x PBS (pH 7.4) 中和胶原。
   3. 将溶液颠倒混匀数次，确保不产生气泡。
   4. 向微孔板的每隔一孔和每隔一行加入 100 µL 中和后的胶原，并于 37 °C 孵育 18-20 小时，使胶原蒸发至干燥。
      第 2 天
   5. 用 100 µL 1x PBS (pH 7.4) 洗涤微孔板....

结果

评估固定于凝胶/薄膜中的 I 型和 III 型胶原蛋白的稳定性与浓度
使用三种不同条件对每孔固定的胶原蛋白浓度进行定量：a) 固定蛋白质后未用 PBS 洗涤的孔（未洗涤）；b) 固定后经过洗涤步骤（用 PBS 洗涤两次）以去除任何未包被蛋白质的孔；c) 与 PBS 孵育 1 小时后的孔（PBS 模拟实验）。进行 PBS 孵育模拟步骤是为了了解在实际结合实验中，胶原蛋白凝胶/薄膜与含有候选化合物的溶液孵育后的稳定性。准确计算和比较化合物对不同靶标的结合分数和解离常数（K_d）时，量化每孔固定的胶原蛋白量至关重要，尤其是当这些靶标具有不同的包被效率时。图 7 展示了一个 III 型胶原蛋白的代表性稳定性测定结果，从中可以明显看出，当包含洗涤和/或孵育步骤时，孔中保持固定的胶原蛋白量会减少。结果表明，在洗涤步骤中凝胶/薄膜损失的胶原蛋白更多，而在孵育步骤中损失较少。然而，在体外结合实验中，洗涤是确保去除未结合化合物的关键步骤。因此，重要的是计算并用于体外结合实验结果归一化的，应是孔内.......

讨论

本研究提供了一种可重复的I型和III型胶原固定化方法，并展示了获取、分析和解释相关数据的实验方案。 体外 Eu(III) TRF结合数据用于表征候选配体对I型和III型胶原的结合特性。本文所述的I型和III型胶原固定化方案是在参考既往关于I型和III型胶原纤维形成的文献基础上开发并优化的 体外^13,16具体而言，通过优化微孔板类型、缓冲液的pH值、温度和离子浓度等关键条件，实现了I型和III型胶原的可重复性包被。鉴于胶原在pH值和温度升高时会发生自组装，因此为固定胶原而进行的中和与加样步骤必须在冰上完成。这可确保胶原的成核速率（纤维形成的第一步）不会在胶原接触孔板前启动，而是在孵育过程中温度升高后于孔内发生。通过定量各孔中的蛋白含量发现，使用具有非离子亲水表面的非特异性结合微孔板，可实现I型胶原稳定且可重复的包被。相比之下，III型胶原则在经等离子气体处理、亲水性增强的组织培养级聚苯乙烯微孔板上表现出可重复且稳定的包被效果。相较于I型胶原，针对III型胶原的固定化方案研究较少，因此本方.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x PBS	Gibco	14200075	用蒸馏水稀释（1:10）配制1x PBS
10x PBS	Gibco	14200075	用蒸馏水稀释（1:10）配制1x PBS
2M HCL			自行配制，详细信息见支持性文件
2M HCL			自行配制，详细信息见支持性文件
2M 氢氧化钠 + 2M 甘氨酸			自行配制，详细信息见支持性文件
2M 氢氧化钠 + 2M 甘氨酸			自行配制，详细信息见支持性文件
Cell-star 96孔 微孔板	Greiner Bio-One	655 160
Cell-star 96孔 微孔板	Greiner Bio-One	655 160
DELFIA 增强溶液	Perkin Elmer	1244-104
DELFIA 增强溶液	Perkin Elmer	1244-104
冰
冰
Infinite 200 PRO NanoQuant 微孔板读板仪	TECAN
Infinite 200 PRO NanoQuant 微孔板读板仪	TECAN
非结合（NBS）96孔微孔板	Corning	3641
非结合（NBS）96孔微孔板	Corning	3641
pH电极 Inlab Routine	Mettler Toledo	51343050
pH电极 Inlab Routine	Mettler Toledo	51343050
pH计（sevenCompact）	Mettler Toledo
pH计（sevenCompact）	Mettler Toledo
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	Thermofisher	23227
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	Thermofisher	23227
组织培养孵育箱（37 °C，5% CO2）
I型牛胶原蛋白，3 mg/mL	Corning	354231
III型人胎盘胶原蛋白，0.99 mg/mL	Advanced Biomatrix	5021