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方法文章

优化的胶原蛋白表面固定化方法及胶原结合实验方案

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DOI：

10.3791/64720

⸱

2023年3月24日

 ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering and Imaging Sciences, King’s College London, 2Dipartimento di Scienze e Innovazione Tecnologica, Università del Piemonte Orientale, 3Centre de Biophysique Moléculaire, CNRS UPR 4301, Université d'Orléans, 4BHF Centre of Research Excellence, Cardiovascular Division, King’s College London, 5Escuela de Ingeniería, Pontificia Universidad Católica de Chile, 6Instituto de Ingeniería Biológica y Médica, Pontificia Universidad Católica de Chile

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究提供了一种优化的实验方案，可重复性地将I型和III型胶原固定于微孔板上并进行定量，随后采用改进的方法 体外 使用时间分辨荧光法研究胶原-化合物相互作用的结合实验方案。提供了后续逐步数据分析与数据解释方法。

摘要

纤维化是多种组织对损伤或损害产生的一种修复性反应。然而，若纤维化过度，则可导致组织瘢痕形成和器官功能衰竭，与高发病率和高死亡率相关。胶原蛋白是驱动纤维化过程的关键因子，其中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白是多种纤维化疾病中主要参与的类型。与用于固定其他蛋白质（如弹性蛋白、白蛋白、纤连蛋白等）的传统方案不同，目前尚无易于获取的、可重复地固定不同类型胶原蛋白以形成稳定包被的综合性实验方案。胶原蛋白的固定具有出乎意料的挑战性，因为多种实验条件可能影响其固定效率，包括胶原蛋白类型、pH值、温度以及所用微孔板的类型。本文提供了一种详细的实验方案，用于可重复地固定并定量Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白，从而实现 稳定且可重复的凝胶/薄膜的制备方法。此外，本研究还展示了如何进行、分析和解读 体外 时间分辨荧光结合研究用于探究胶原蛋白与候选胶原结合化合物（例如，与携带铕[Eu(III)]的金属螯合物偶联的肽）之间的相互作用。该方法可广泛应用于多种生物医学领域，包括 分子成像领域的靶向成像探针开发、药物研发、细胞毒性研究、细胞增殖研究以及免疫分析。

引言

纤维性结缔组织在组织损伤后自然愈合过程中积聚的现象被称为纤维化。然而，如果纤维组织的沉积未能及时终止，并持续超出组织修复所需的程度，则会导致过度纤维化1,2。过度纤维化会损害器官的生理功能，可能导致器官损伤甚至器官衰竭3,4,5。纤维化的两个主要驱动因素是细胞外基质（ECM）蛋白I型和III型胶原6。胶原是一种存在于多种器官中的结构蛋白，约占人体总蛋白含量的三分之一1。通过人类基因组测序已鉴定出28种不同类型的胶原，其中最丰富的是纤维状胶原7。主要的纤维状胶原为I型胶原，它赋予细胞外基质抗张强度和抗变形能力8。III型胶原是一种提供弹性的结构成分，通常与I型胶原共定位。它在胚胎发生期间表达，在成人的皮肤、肌肉和血管中天然存在，但含量较少9。

在体 胶原蛋白的合成始于细胞内过程，其中mRNA在细胞核中转录，随后转移至细胞质中进行翻译。翻译完成后，所形成的肽链在内质网中经历翻译后修饰，形成前胶原（胶原蛋白的前体）。前胶原随后转运至高尔基体进行最终修饰，然后被分泌到细胞外空间。10通过蛋白水解切割，前胶原转化为胶原蛋白单体。随后，该单体通过交联反应进行连接，交联方式为 通过 由赖氨酰氧化酶（LOX）催化的酶介导交联途径或 通过 一种非酶促介导的交联途径，涉及美拉德反应11. 体外 固定胶原蛋白的方案主要依赖于胶原蛋白的自组装能力。胶原蛋白根据其溶解度从组织中提取，而溶解度在很大程度上取决于单个胶原原纤维交联的程度。7纤维状胶原可溶于乙酸，当调节pH值和温度时，纤维可重新形成12. 体外，胶原蛋白的纤维形成可视为一个两阶段过程7第一阶段为成核期，此阶段胶原纤维先形成二聚体和三聚体原纤维，随后重排形成三重螺旋结构。第二阶段为生长期，此阶段 原纤维开始侧向生长，形成特征性的D带结构，这一过程通常可通过浊度变化观察到7原子力显微镜（AFM）研究还表明，I型和III型胶原蛋白具有不同的特性（表1)13.

为了研究胶原蛋白与其他化合物之间的结合相互作用，需要将胶原蛋白可重复地固定在微孔板的孔中。目前已有多种用于固定可溶性胶原蛋白的实验方案14,15,16。市面上有售的预包被胶原蛋白的微孔板通常用于细胞培养。然而，这些预包被的微孔板在孔壁上所包被的胶原蛋白层非常薄，且胶原蛋白的含量未知，因此不适合用于体外（in vitro）结合实验。将胶原蛋白固定在微孔板孔壁上时存在多个挑战。其中一个关键挑战是选择合适类型的微孔板，因为不同类型的胶原蛋白（例如I型和III型）具有不同的化学性质，其在不同材质微孔板上的固定稳定性与效率也各不相同。另一个挑战在于固定化实验条件的优化，因为胶原蛋白纤维形成（fibrillogenesis）过程受多种因素影响，包括温度、pH值、胶原蛋白的储备浓度以及缓冲液的离子浓度7。

为了研究胶原蛋白（靶标）与其他化合物（例如靶向肽）之间的相互作用，还需要建立一种可靠的筛选检测方法，通过测定解离常数 Kd 来评估该化合物对靶标的特异性和选择性。蛋白质（胶原蛋白）与配体形成双分子复合物的平衡位置通常用结合常数 Ka 表示，其数值大小与结合亲和力成正比。然而，生物化学家更常使用双分子 复合物的平衡解离常数 Kd 来描述亲和力关系，Kd 定义为 Ka 的倒数（即 Kd = 1/Ka）。Kd 值越低，表明蛋白质与配体之间的结合强度越强。使用 Kd 比较不同配体对同一蛋白质（或反之）的结合亲和力的优势在于，双分子复合物的 Kd 单位为 mol/L（即浓度单位）。在大多数实验条件下，Kd 值对应于达到平衡时使靶标上 50% 可用结合位点被占据所需的配体浓度17,18。解离常数通常通过分析受体的结合位点占有率（FO）来获得，FO 定义为被占据的结合位点数与总的可利用结合位点数之比，其值随配体浓度变化而变化。实现这一分析的前提是具备一种能够区分并定量检测结合态配体量的分析方法。

体外配体结合实验可采用多种生物分析方法进行，包括光学光度法、放射性配体法、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）以及表面等离子共振（SPR）。在光度法中，基于荧光发射的方法通常需要将配体或蛋白质标记荧光团，以提高检测灵敏度并改善实验的检测限。某些镧系三价离子（如 Eu(III)）的螯合物作为荧光团极具吸引力，因其具有较大的斯托克斯位移、窄发射带（可提供良好的信噪比）、较低的光漂白性以及长的荧光发射寿命。尤为重要的是，后一特性使得利用 Eu(III) 荧光团的时间分辨荧光（TRF）技术成为可能，从而消除背景自发荧光的干扰19。在基于 Eu(III) 的时间分辨荧光实验的解离增强镧系荧光免疫分析法（DELFIA）中，将用非发光 Eu(III)-螯合物标记的配体与固定在微孔板上的受体共同孵育。标记的配体-受体复合物与未结合的配体分离后，在酸性 pH 条件下使 Eu(III) 螯合物解离，随后 Eu(III) 与可增强荧光的螯合剂重新结合，形成嵌入胶束中的高荧光 Eu(III) 复合物20。

脱络合步骤可使用具有快速脱络合动力学特性的螯合剂（如二乙烯三胺五乙酸，DTPA）合理实现。然而，Eu(III) 与某些大环螯合剂（如 DOTA（1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸）及其单酰胺衍生物（DO3AAm））形成的配合物具有很高的热力学稳定性和极强的动力学惰性。在此情况下，必须精确优化脱络合步骤，以实现基于 Eu(III) 的时间分辨荧光（TRF）信号的充分且可重复的活化。21值得注意的是，镧系元素（Ln(III)）-DOTA 和 Ln(III)-DO3AAm 配合物是目前最常被用作对比剂的类型 体内 利用磁共振成像（MRI）技术进行分子成像22因此，基于镧系元素（Ln(III)）的时间分辨荧光（TRF）分析是研究 体外 MRI分子探针与其预定生物靶标结合亲和力。目前，尚缺乏用于固定I型和III型胶原以及可重复地进行相关实验的全面且可重复的操作方案。 体外 缺乏结合 Eu(III) TRF 的实验。为克服这些局限性，需要建立可重复的方法，以实现 I 型和 III 型胶原蛋白的自组装并将其固定，分别形成稳定的凝胶和薄膜，并达到结合 Eu(III) TRF 实验所需的足够胶原蛋白浓度 体外 结合实验，开发了铕(III)时间分辨荧光（Eu(III) TRF）检测方法。本文提出了一种针对高惰性铕(III)-DO3Aam类配合物的优化检测方案。最后，一种优化的 体外 使用微孔板Eu(III)时间分辨荧光法测定Kd Eu(III)标记配体对固定化的I型和III型胶原的结合性得到证实（图1).

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方案

注意：本工作中使用的所有产品信息均列于材料表中。

1. 胶原蛋白固定化

注意：确保结合测定中使用的微孔板的每个孔周围均有相邻的空孔，以避免荧光串扰。此部分操作需在冰上进行，因为胶原蛋白在温度与 pH 值升高时会自组装。请在组织培养超净工作台内于无菌条件下进行此操作，因为微孔板随后将在组织培养（TC）培养箱中孵育。

  1. I 型胶原在 96 孔微孔板上的固定（图 2）
    ​第 1 天
    1. 准备一个装有冰块的硅胶托盘。将装有 I 型胶原的瓶子、预冷的 10x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 以及微孔板置于冰上，并用 70% 乙醇喷洒所有物品。将材料置于组织培养通风橱下。
    2. 使用等体积的 I 型胶原和 10x PBS (pH 7.4) 中和胶原。
    3. 将溶液颠倒混匀数次，确保不产生气泡。
    4. 向微孔板的每隔一孔和每隔一行加入 100 µL 中和后的胶原，并于 37 °C 孵育 18-20 小时，使胶原蒸发至干燥。
      第 2 天
    5. 用 100 µL 1x PBS (pH 7.4) 洗涤微孔板两次，以去除任何未结合的胶原。
    6. 将微孔板转移至 37 °C 培养箱中再干燥 2 小时，然后用于后续结合实验。
  2. III 型胶原在 96 孔微孔板上的固定（图 3）
    第 1 天
    1. 准备一个装有冰块的硅胶托盘。将装有 III 型胶原的瓶子、预冷的 10x PBS 以及微孔板置于冰上，并用 70% 乙醇喷洒所有物品。将材料置于组织培养通风橱下。
    2. 使用等体积的 III 型胶原和 10x PBS (pH 7.4) 中和胶原。
    3. 向微孔板的每隔一孔和每隔一行加入 70 µL 中和后的胶原，并将微孔板置于组织培养通风橱下，于 37 °C 孵育 2 小时，使胶原蒸发至干燥。
      第 2 天
    4. 用 70 µL 1x PBS (pH 7.4) 洗涤微孔板两次，以去除任何未结合的胶原。
    5. 将微孔板转移至 37 °C 培养箱中干燥 1 小时，然后将其转移至实验台，再干燥 1 小时，然后用于后续结合实验。

2. 固定化胶原凝胶/薄膜的稳定性评估

  1. 在磷酸盐缓冲盐水中孵育1小时
    注意：在结合实验中，将固定化的胶原蛋白与目标化合物共同孵育。必须评估所得胶原凝胶或薄膜的稳定性。为此，需测量三种条件下的稳定性： 免洗 = 在孵育后直接测量固定化的胶原蛋白； 清洗 = 在清洗培养板两次后测量固定的胶原蛋白 100 µL 磷酸盐缓冲盐水；以及 1 小时 PBS 模拟 &；清洗 在 PBS 中孵育 1 小时后，经两次洗涤，测量固定化的胶原蛋白。 用 PBS 洗涤。下文将阐述 PBS 孵育方法。
    1. 添加 70 µL 向每个涂有胶原蛋白的孔中加入200微升PBS（1x），并在室温下将微孔板孵育1小时。
    2. 使用移液器吸除各孔中多余液体，并用PBS（1×）洗涤两次，随后进行下述蛋白质定量分析。
  2. 使用二喹啉甲酸法（BCA）定量固定化胶原的量
    ​注意：使用 Pierce BCA 蛋白检测试剂盒（材料列表) 按照制造商说明书操作。为本检测制备相应的胶原蛋白标准品。I型胶原蛋白的浓度范围为0-3,000 µg/mL 胶原蛋白 III 的浓度范围为 0-750 µg/mL. 每种胶原蛋白共需制备 11 个标准品。
    1. 根据制造商说明书，配制所需工作试剂（WR）的总体积。
    2. 添加 25 µL 将各胶原蛋白标准品溶液（一式两份）加入微孔板孔中。这些溶液用于绘制标准曲线。
    3. 添加 200 µL 向含有标准品的各孔以及包被有未知浓度胶原蛋白的各孔中加入工作试剂溶液。
    4. 将微孔板置于平板振荡器上振荡 30 秒。覆盖微孔板，并在 37 °C 30 分钟。
    5. 取出微孔板，置于室温下冷却。使用酶标仪在560 nm波长处测量吸光度。
    6. 绘制校准曲线时，以吸光度值 A560 (AU) 与浓度 (µg/mL) 的11种标准溶液，并使用校准曲线计算胶原蛋白含量。

3. 铕(III) TRF 配体结合实验（图 1）

注意：所用化合物是一种候选胶原结合肽（CBP），标记有单个 Eu(III)-DO3AAm 复合物，称为 Eu(III)-DO3AAm-CBP（图 4）。

  1. 胶原包被板与 Eu(III)-DO3AAm-CBP 化合物的孵育
    1. 在 1x PBS 中制备浓度范围为 0.1-15 µM（0.1 µM、0.5 µM、1 µM、3 µM、5 µM、7 µM、10 µM 和 15 µM）的 Eu(III)-DO3AAm-CBP 化合物溶液。
    2. 将每种浓度的化合物各 75 µL 加入胶原包被孔中（板 A）。实验进行三次重复，以计算与胶原结合的化合物量。
    3. 使用第二块未包被板（板 B），将每种化合物各 75 µL 加入空孔中，以计算化合物与板的非特异性结合。每种浓度进行三次重复。
    4. 将微孔板在室温下孵育 1 小时。
    5. 使用移液器吸出并弃去每个孔中多余的溶液，并用 1x PBS 洗涤孔两次以去除多余、未结合的化合物。此步骤对胶原包被和未包被的微孔板均需执行。
    6. 向第三块未包被板（板 C）中，加入 10 µL 相同浓度范围的 Eu(III)-DO3AAm-CBP 溶液（双份重复）。使用溶液中 Eu(III)-DO3AAm-CBP 的荧光读数制作校准曲线。
      注意：请勿洗涤或吸出此板中的溶液。
  2. 铕(III)的酸提取与时间分辨荧光读数
    注意：请参阅补充信息中关于酸性溶液和缓冲溶液体积的制备与校准说明。在本工作中，为可重复地达到最佳 pH 值，所需的酸性溶液和缓冲溶液体积分别为 54 µL 和 46 µL。在板 A、板 B 和板 C 上执行以下操作。
    1. 向每个孔中加入 54 µL 酸性溶液，并将板置于 37 °C 培养箱中孵育 90 分钟，用锡箔纸覆盖微孔板以避免蒸发。必须严格控制温度和孵育时间，以实现可重复的解络合。
    2. 向每个孔中加入 46 µL 缓冲溶液，并轻轻摇动板 30 秒。
    3. 加入 100 µL 增强溶液，并摇动板 30 秒。
    4. 等待 30 分钟后，使用时间分辨荧光酶标仪读取板。使用表 2中列出的参数。

4. 数据分析

  1. 孔中固定化胶原蛋白浓度的定量
    1. 获取 11 种标准溶液的 A560 (AU) 与浓度 (µg/mL) 校准曲线方程。
      1. 使用从含有胶原蛋白标准品的孔中获取的吸光度读数。
      2. 将复孔的平均值制成表格，并将平均吸光度对已知蛋白质（胶原蛋白）浓度 (µg/mL) 作图，以获得标准曲线方程。
    2. 使用吸光度值计算固定化胶原蛋白的质量 (µg) 和浓度 (M)。
      1. 计算三个含有固定化胶原蛋白的孔的平均吸光度值，并记录标准偏差。
      2. 使用从胶原蛋白标准曲线（步骤 2.2.6）获得的标准曲线方程，将胶原蛋白包被孔测得的吸光度转换为浓度。据此，计算实验孔中固定化胶原蛋白的浓度，单位为 µg/mL。
      3. 将步骤 4.1.2.2 中计算出的浓度 (µg/mL) 首先转换为克/升，然后根据胶原蛋白的分子量转换为摩尔浓度 (M)。
      4. 最后，通过将浓度除以加入孔中的胶原蛋白体积（I 型胶原蛋白为 100 µL，III 型胶原蛋白为 70 µL），计算每个孔中固定化胶原蛋白的质量。
  2. 解离常数 (Kd) 的计算 (图 4)
    1. 提取荧光读数。
      1. 将酶标仪的荧光读数导出到电子表格。
        注：在结合实验中，必须考虑化合物与板子塑料表面潜在的非特异性结合。
      2. 计算三种不同板中每个化合物浓度三次重复测量的平均值：包被孔的特异性结合读数（板 A）、未包被孔的非特异性结合读数（板 B）以及未包被孔中溶液中 Eu(III)-DO3AAm-CBP 的总量（板 C）。
      3. 通过从包被孔（板 A）的荧光读数中减去未包被孔（板 B）的荧光读数，确定结合化合物的荧光值。
        方程 1：确定结合荧光17：
        结合荧光 = 特异性（包被孔） - 非特异性（未包被孔）
      4. 使用溶液中 Eu(III) 标记化合物的读数（板 C）生成校准曲线。将获得的荧光读数对 Eu(III) 标记化合物的浓度作图。进行线性回归拟合。
    2. 将荧光读数转换为浓度。
      1. 使用从溶液中化合物浓度数据（步骤 4.2.1.4）生成的标准荧光曲线，将结合荧光读数（步骤 4.2.3）转换为浓度。
        注：当比较一种化合物对不同固定化浓度的靶蛋白的结合特性时，在计算结合到靶标上的化合物量（即结合化合物/蛋白质）时，需要考虑后者的浓度。
      2. 将结合化合物的浓度除以孔中固定化蛋白质的浓度。
        注：此计算应使用孔在 PBS 中孵育 1 小时后（即所谓的 PBS 模拟实验；上文第 2.1 节）计算出的固定化胶原蛋白浓度。这是为了考虑孵育步骤和洗涤步骤中胶原蛋白的潜在损失，这些损失 不会对最终的荧光信号有贡献。
      3. 使用散点图绘制数据，x 轴为化合物浓度 (µM)，y 轴为结合化合物/蛋白质。
    3. 获取 Kd 值。
      1. 使用两种可能的结合动力学模型拟合步骤 4.2.2.3 中获得的数据：单位点结合模型和带 Hill 斜率的单位点结合模型。每种模型的方程如图 6所示。
      2. 选择在拟合数据时能提供明确拟合且 R 平方值最高的模型。
      3. 排除每个板、每个浓度下每组荧光读数中的离群值。
      4. 计算最终的 Kd 值，并将数据呈现为独立实验的平均值 ± 标准偏差。
        注：为获得稳健结果，应在每个板内进行三次重复测量，并使用不同的微孔板进行至少三次独立实验。
    4. 计算占有率 (FO)。
      注：根据方程 2，靶标浓度未知，因此，通过使用代数运算和方程 3 中的 Kd，可推导出计算占有率的实用方程，即方程 4 的形式。
      方程 2：占有率的定义17：
      figure-protocol-1
      方程 3：解离常数 Kd，即平衡时化合物占据 50% 靶标时的浓度17：
      figure-protocol-2
      方程 4：用于计算 FO 的重排方程17：
      figure-protocol-3
      1. 使用为每个独立板获得的 Kd 值计算 FO。将 FO 的结果、平均值和标准偏差对化合物浓度作图。
      2. 以 0 到 1 之间的值或以百分比（0%-100%）的形式报告 FO。

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结果

评估固定于凝胶/薄膜中的 I 型和 III 型胶原蛋白的稳定性与浓度
使用三种不同条件对每孔固定的胶原蛋白浓度进行定量：a) 固定蛋白质后未用 PBS 洗涤的孔（未洗涤）；b) 固定后经过洗涤步骤（用 PBS 洗涤两次）以去除任何未包被蛋白质的孔；c) 与 PBS 孵育 1 小时后的孔（PBS 模拟实验）。进行 PBS 孵育模拟步骤是为了了解在实际结合实验中，胶原蛋白凝胶/薄膜与含有候选化合物的溶液孵育后的稳定性。准确计算和比较化合物对不同靶标的结合分数和解离常数（Kd）时，量化每孔固定的胶原蛋白量至关重要，尤其是当这些靶标具有不同的包被效率时。图 7 展示了一个 III 型胶原蛋白的代表性稳定性测定结果，从中可以明显看出，当包含洗涤和/或孵育步骤时，孔中保持固定的胶原蛋白量会减少。结果表明，在洗涤步骤中凝胶/薄膜损失的胶原蛋白更多，而在孵育步骤中损失较少。然而，在体外结合实验中，洗涤是确保去除未结合化合物的关键步骤。因此，重要的是计算并用于体外结合实验结果归一化的，应是孔内...

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讨论

本研究提供了一种可重复的I型和III型胶原固定化方法，并展示了获取、分析和解释相关数据的实验方案。 体外 Eu(III) TRF结合数据用于表征候选配体对I型和III型胶原的结合特性。本文所述的I型和III型胶原固定化方案是在参考既往关于I型和III型胶原纤维形成的文献基础上开发并优化的 体外13,16具体而言，通过优化微孔板类型、缓冲液的pH值、温度和离子浓度等关键条件，实现了I型和III型胶原的可重复性包被。鉴于胶原在pH值和温度升高时会发生自组装，因此为固定胶原而进行的中和与加样步骤必须在冰上完成。这可确保胶原的成核速率（纤维形成的第一步）不会在胶原接触孔板前启动，而是在孵育过程中温度升高后于孔内发生。通过定量各孔中的蛋白含量发现，使用具有非离子亲水表面的非特异性结合微孔板，可实现I型胶原稳定且可重复的包被。相比之下，III型胶原则在经等离子气体处理、亲水性增强的组织培养级聚苯乙烯微孔板上表现出可重复且稳定的包被效果。相较于I型胶原，针对III型胶原的固定化方案研究较少，因此本方...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢以下资助机构对本工作的支持：（1）英国医学研究理事会（MR/N013700/1）以及伦敦国王学院作为医学研究理事会生物医学科学博士培训合作项目的成员；（2）英国心脏基金会项目资助 RG/20/1/34802；（3）英国心脏基金会项目拨款 PG/2019/34897；（4）伦敦国王学院英国心脏基金会卓越研究中心拨款 RE/18/2/34213；（5）智利国家研究发展署千年科学计划项目 - ICN2021_004；以及（6）智利国家研究发展署基础资助 FB210024。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10x PBSGibco14200075用蒸馏水稀释（1:10）配制1x PBS
10x PBSGibco14200075用蒸馏水稀释（1:10）配制1x PBS
2M HCL自行配制，详细信息见支持性文件 
2M HCL自行配制，详细信息见支持性文件 
2M 氢氧化钠 + 2M 甘氨酸自行配制，详细信息见支持性文件 
2M 氢氧化钠 + 2M 甘氨酸自行配制，详细信息见支持性文件 
Cell-star 96孔 微孔板Greiner Bio-One655 160
Cell-star 96孔 微孔板Greiner Bio-One655 160
DELFIA 增强溶液Perkin Elmer1244-104
DELFIA 增强溶液Perkin Elmer1244-104
冰 
冰 
Infinite 200 PRO NanoQuant 微孔板读板仪 TECAN
Infinite 200 PRO NanoQuant 微孔板读板仪 TECAN
非结合（NBS）96孔微孔板 Corning3641
非结合（NBS）96孔微孔板 Corning3641
pH电极 Inlab Routine Mettler Toledo 51343050
pH电极 Inlab Routine Mettler Toledo 51343050
pH计（sevenCompact）Mettler Toledo 
pH计（sevenCompact）Mettler Toledo 
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 Thermofisher23227
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 Thermofisher23227
组织培养孵育箱（37 °C，5% CO2）
I型牛胶原蛋白，3 mg/mL Corning354231
III型人胎盘胶原蛋白，0.99 mg/mLAdvanced Biomatrix5021

参考文献

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