探索两种草药组合策略治疗受损PC12细胞

摘要

本方案提供了一种联合使用两种草药治疗受损PC12细胞的方法，为优化中药的最佳应用模式提供了参考。

摘要

鉴于中药复方在治疗脑缺血方面的优势，本研究旨在探讨复方配伍与成分配伍在治疗受损PC12细胞时的疗效及作用机制差异，以探索两种草药的配伍策略。氯化钴（CoCl₂）₂) 结合并使用无葡萄糖培养基以诱导PC12细胞的氧化损伤。随后，确定最佳组合方案 膜荚黄芪 （星形胶质细胞）和 短葶飞蓬 （益气）注射剂经筛选后，采用均匀设计方法确定其在PC12细胞上安全且有效的浓度并进行组合。进一步筛选出的成分组合包含来源于两种药材的10 µM黄芪甲苷A、40 µM灯盏花素和75 µM绿原酸。随后采用MTT法、Annexin V-FITC/PI染色、免疫荧光及Western blot分析，评估制剂组合与成分组合对损伤PC12细胞的保护作用及其作用机制。结果显示，促进细胞存活的最佳制剂组合为黄芪注射液与益气胶囊，浓度比为6:1.8（µM）。成分组合（10 µM黄芪甲苷A、40 µM灯盏花素和75 µM绿原酸）的效果优于制剂组合。两种组合均显著降低细胞凋亡率、caspase-3荧光强度及细胞内活性氧（ROS）水平，同时上调p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax及Nrf2的表达水平，且成分组合的作用更为显著。综上所述，两种组合均可抑制CoCl₂诱导的PC12细胞损伤，其机制可能与激活Akt/Nrf2信号通路有关。₂ 在无葡萄糖培养基中对PC12细胞联合使用该成分组合，从而促进细胞存活。然而，相较于制备物组合，成分组合可能因其对与氧化应激和凋亡相关的PI3K/Akt/Nrf2信号通路具有更强的调控作用，因而效率更高。

引言

由脑低灌注引起的慢性脑缺血是中老年人群中的常见疾病¹。作为一种长期隐匿性缺血性疾病，可导致进行性或持续性的神经功能障碍。其主要病理机制包括细胞凋亡和氧化损伤，进而引发进行性或持续性神经功能障碍；这也是阿尔茨海默病、血管性痴呆等疾病的病理基础，严重影响患者的生活质量。然而，现代医学目前仍缺乏治疗慢性脑缺血的理想药物²。同时，黄芪（Astragalus mongholicus，Ast）与灯盏花（Erigeron breviscapus，Eri）的配伍在中医临床实践中已被广泛应用⁴。该配伍策略在促进脑缺血后神经功能恢复方面效果显著，优于单药治疗；但两者配伍的剂量比例存在较大差异⁴。其有效成分及作用机制尚不明确，这是制约其临床应用的关键问题。

既往研究表明，黄芪注射液与红花注射液配伍在治疗大鼠脑缺血方面具有协同作用。该配伍可上调p-Akt蛋白的表达，同时下调Bcl-2相关死亡促进蛋白（BAD）的表达^5,6，后者属于B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）家族蛋白，具有促进细胞凋亡的作用。然而，其协同作用的物质基础和作用机制尚不明确。进一步研究通过采用CoC....

方案

1. 试剂的制备

1. 在125 mL无菌培养瓶中加入90 mL DMEM高糖培养基、10 mL胎牛血清（FBS）和1 mL青霉素-链霉素溶液，配制完全培养基。混匀后，在密闭条件下4 °C保存。
2. 配制 CoCl₂ 通过加入 0.02 g CoCl 配制溶液₂ 将粉末（准确称量）溶于10 mL无糖DMEM培养基中（完全溶解），配制8.4 mM的储备液。用0.22 µm细菌滤器过滤溶液，密封后避光保存于4 °C。
   注意：CoCl₂ 不稳定，应保存在密闭容器中，避光；CoCl的保质期₂ 溶液的有效期为7天。
3. 配制 Tris-HCl 缓冲盐溶液（TBST）。
   1. 准确称取8 g氯化钠、0.2 g氯化钾和3 g Tris-base，加入1 L烧杯中，再加入1,000 mL反渗透水（RO水）溶解混合物。
   2. 调节pH至7.4，加入1 mL Tween 20，充分混匀以制备TBST溶液。
      注意：Tween 20 作为表面活性剂可减少抗体与抗原之间的非特异性结合，在 0.1% 浓度下效果最佳。
4. 称取0.1 g MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）粉末溶于20 mL PBS溶液中，配制浓度为5 mg/mL的储备液。使用0.22 ....

结果

Ast 注射液与 Eri 胶囊最佳组合的筛选结果如下 图 1. Ast 注射剂与 Eri 胶囊对正常 PC12 细胞存活率的影响如图所示 图 1A细胞活力在 Ast 注射浓度大于 12 时低于 95%。 µM图 1A) 以及浓度高于5的Eri胶囊 µM图 1A），表明最大无毒浓度为12 µM 和 5 µM，分别。其细胞毒性大于单独使用的黄芪甲苷和野黄芩苷。黄芪注射液和益心胶囊对 CoCl 诱导损伤的 PC12 细胞活力的影响₂ 如图所示 图 1B,与模型组相比，在6-12浓度范围内，黄芪甲苷注射可提高受损PC12细胞的存活率。 µMp < 0.05 或 p < 0.01），以及.......

讨论

在现代临床实践中，治疗脑缺血仍缺乏理想的药物²。在益气活血法的指导下，黄芪甲苷（Ast）、银杏叶提取物（Eri）等制剂已在中医临床实践中联合应用，并展现出良好的综合优势^13,14,15。大量研究表明，Ast 能够改善血脑屏障通透性，增加脑血流量，提高神经细胞对缺氧的耐受能力以及抵抗氧自由基损伤的能力，可显著改善神经功能障碍^16,17，尤其适用于老年缺血性脑血管病^16,17。Eri 具有扩张血管、增加脑部供血、清除活性氧（ROS）、降低脂质过氧化的作用^18,19

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1300系列II级生物安全柜	赛默飞世尔科技仪器公司	1374
3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐	广州赛国生物科技有限公司	1334GR001	MTT
ACEA NovoExpress 1.4.0	ACEA生物科学公司	-
Akt	中国武汉三鹰蛋白科技集团有限公司	10176-2-AP
分析流式细胞术	赛默飞世尔科技仪器公司	62-2-1810-1027-0
Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒	碧云天生物技术有限公司	C1062L
黄芪注射液	黑龙江珍宝岛药业有限公司	A03190612144	Ast注射
黄芪甲苷A	重庆高仁生物科技有限公司	84687-43-4
Bax	中国武汉三鹰蛋白科技集团有限公司	60267-1-Ig
BCA蛋白定量试剂盒	碧云天生物技术公司	P0012
Bcl-2	中国武汉三鹰蛋白科技集团有限公司	26593-1-AP
二氧化碳培养箱	赛默飞世尔科技仪器公司	0816-2014
Caspase-3	中国武汉三鹰蛋白科技集团有限公司	19677-1-AP
绿原酸	重庆高仁生物科技有限公司	327-97-9
六水合氯化钴	默克生物技术公司	7791-13-1	CoCl2
二甲基亚砜	广州赛国生物科技有限公司	2020112701	DMSO
十二水合磷酸氢二钠	成都科隆化学品有限公司	2020090101
DMEM高糖培养基	赛默飞世尔科技 Hyclone	2110050
无糖DMEM培养基	北京索莱宝科技有限公司	2029548
ECL 发光液	联硕生物公司	WBKLS0500
电子天平	中国上海恒平科学仪器有限公司	FA1204
电泳仪	伯乐生命科学（上海）有限公司	1658026
短葶飞蓬胶囊	云南贝克制药有限公司	Z53021671	Eri 胶囊
胎牛血清	四季生物工程研究所	20210402	FBS
荧光显微镜	Olympms Corporation	IX71-F32PH
凝胶成像仪	伯乐生命科学（上海）有限公司	1708265
山羊抗小鼠二抗	武汉三鹰普罗蒂恩泰克集团有限公司	SA00001-1
山羊抗兔二抗	中国武汉三鹰蛋白科技集团有限公司	SA00001- 2
IBM SPSS Statistics 版本 26.0	国际商业机器公司，美国	-
ImageJ 1.8.0	美国国立卫生研究院	-	成像软件
免疫学 荧光 染色试剂盒	碧云天生物技术有限公司	P0196
KCl	成都科隆化学品有限公司	2021070901
标记物	赛默飞世尔科技仪器公司	26616
酶标仪	珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司	HH35L2018296
Motic 倒置显微镜	Nanda Scientific Instruments Co.	AE2000LED
NaCl	成都科隆化学品有限公司	2014081301
脱脂牛奶	碧云天生物技术有限公司	P0216
Nrf2	中国武汉三鹰蛋白科技集团有限公司	16396-1-AP
P-Akt	武汉三鹰普罗蒂恩泰克集团有限公司	66444-1-Ig
PC12细胞	中国科学院	CBP60430
青霉素-链霉素溶液	赛默飞世尔科技 Hyclone	SV30010
磷酸酶-蛋白酶抑制剂混合物	碧云天生物技术有限公司	P1045
磷酸二氢钾	成都科隆化学品有限公司	2015082901
活性氧检测试剂盒	碧云天生物技术有限公司	S0033S
RI-PA 裂解液	碧云天生物技术有限公司	P0013B
灯盏花素	重庆高仁生物科技有限公司	27740-01-8
5× SDS-PAGE上样缓冲液	碧云天生物技术有限公司	P0015L
无菌滤芯吸头（0.22 µm)	默克生物技术公司	SLGP033RB
Tris碱	广州赛国生物科技有限公司	1115GR500	TBS
胰蛋白酶	赛默飞世尔科技 Hyclone	J190013
Tween-20	成都科隆化学品有限公司	2021051301
涡旋振荡器	奥豪斯国际有限公司，中国上海	VXMNAL
β-肌动蛋白	中国武汉三鹰蛋白科技集团有限公司	66009-1-Ig