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方法文章

探索两种草药组合策略治疗受损PC12细胞

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⸱

DOI：

10.3791/64721

⸱

2022年11月18日

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Chengdu Medical College

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案提供了一种联合使用两种草药治疗受损PC12细胞的方法，为优化中药的最佳应用模式提供了参考。

摘要

鉴于中药复方在治疗脑缺血方面的优势，本研究旨在探讨复方配伍与成分配伍在治疗受损PC12细胞时的疗效及作用机制差异，以探索两种草药的配伍策略。氯化钴（CoCl₂）2) 结合并使用无葡萄糖培养基以诱导PC12细胞的氧化损伤。随后，确定最佳组合方案 膜荚黄芪 （星形胶质细胞）和 短葶飞蓬 （益气）注射剂经筛选后，采用均匀设计方法确定其在PC12细胞上安全且有效的浓度并进行组合。进一步筛选出的成分组合包含来源于两种药材的10 µM黄芪甲苷A、40 µM灯盏花素和75 µM绿原酸。随后采用MTT法、Annexin V-FITC/PI染色、免疫荧光及Western blot分析，评估制剂组合与成分组合对损伤PC12细胞的保护作用及其作用机制。结果显示，促进细胞存活的最佳制剂组合为黄芪注射液与益气胶囊，浓度比为6:1.8（µM）。成分组合（10 µM黄芪甲苷A、40 µM灯盏花素和75 µM绿原酸）的效果优于制剂组合。两种组合均显著降低细胞凋亡率、caspase-3荧光强度及细胞内活性氧（ROS）水平，同时上调p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax及Nrf2的表达水平，且成分组合的作用更为显著。综上所述，两种组合均可抑制CoCl₂诱导的PC12细胞损伤，其机制可能与激活Akt/Nrf2信号通路有关。2 在无葡萄糖培养基中对PC12细胞联合使用该成分组合，从而促进细胞存活。然而，相较于制备物组合，成分组合可能因其对与氧化应激和凋亡相关的PI3K/Akt/Nrf2信号通路具有更强的调控作用，因而效率更高。

引言

由脑低灌注引起的慢性脑缺血是中老年人群中的常见疾病1。作为一种长期隐匿性缺血性疾病，可导致进行性或持续性的神经功能障碍。其主要病理机制包括细胞凋亡和氧化损伤，进而引发进行性或持续性神经功能障碍；这也是阿尔茨海默病、血管性痴呆等疾病的病理基础，严重影响患者的生活质量。然而，现代医学目前仍缺乏治疗慢性脑缺血的理想药物2。同时，黄芪（Astragalus mongholicus，Ast）与灯盏花（Erigeron breviscapus，Eri）的配伍在中医临床实践中已被广泛应用4。该配伍策略在促进脑缺血后神经功能恢复方面效果显著，优于单药治疗；但两者配伍的剂量比例存在较大差异4。其有效成分及作用机制尚不明确，这是制约其临床应用的关键问题。

既往研究表明，黄芪注射液与红花注射液配伍在治疗大鼠脑缺血方面具有协同作用。该配伍可上调p-Akt蛋白的表达，同时下调Bcl-2相关死亡促进蛋白（BAD）的表达5,6，后者属于B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）家族蛋白，具有促进细胞凋亡的作用。然而，其协同作用的物质基础和作用机制尚不明确。进一步研究通过采用CoCl2联合无糖培养基建立PC12细胞损伤模型，已筛选并确定了黄芪与红花中的最佳组分组合7。

本研究采用损伤的PC12细胞模型筛选虾青素（Ast）和埃里克林（Eri）的有效剂量，并结合均匀设计法筛选两种药物的最佳配伍组合。利用该细胞模型进一步评价制剂组合与成分组合在损伤PC12细胞中作用效果及机制的差异。该策略旨在通过PI3K/Akt/Nrf2信号通路，探讨两类组合对损伤PC12细胞的保护作用及其调控机制，以确定最佳配伍方式。本研究为优化中药最佳应用模式提供了参考依据。

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方案

1. 试剂的制备

  1. 在125 mL无菌培养瓶中加入90 mL DMEM高糖培养基、10 mL胎牛血清（FBS）和1 mL青霉素-链霉素溶液，配制完全培养基。混匀后，在密闭条件下4 °C保存。
  2. 配制 CoCl2 通过加入 0.02 g CoCl 配制溶液2 将粉末（准确称量）溶于10 mL无糖DMEM培养基中（完全溶解），配制8.4 mM的储备液。用0.22 µm细菌滤器过滤溶液，密封后避光保存于4 °C。
    注意：CoCl2 不稳定，应保存在密闭容器中，避光；CoCl的保质期2 溶液的有效期为7天。
  3. 配制 Tris-HCl 缓冲盐溶液（TBST）。
    1. 准确称取8 g氯化钠、0.2 g氯化钾和3 g Tris-base，加入1 L烧杯中，再加入1,000 mL反渗透水（RO水）溶解混合物。
    2. 调节pH至7.4，加入1 mL Tween 20，充分混匀以制备TBST溶液。
      注意：Tween 20 作为表面活性剂可减少抗体与抗原之间的非特异性结合，在 0.1% 浓度下效果最佳。
  4. 称取0.1 g MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）粉末溶于20 mL PBS溶液中，配制浓度为5 mg/mL的储备液。使用0.22 µm细菌滤器过滤溶液，密封后避光保存于4 °C，备用。
    注意：MTT 粉末不稳定，易吸潮，应避光保存于密闭干燥处。MTT 溶液有效期为 7 天。MTT 具有致癌作用，避免与皮肤直接接触。
  5. 通过去除Eri胶囊外壳，准确称取0.18 g内容物溶于10 mL无糖DMEM培养基中，配制100 µM的储备液（以灯盏花素浓度计）。用0.2 µm细菌滤器过滤溶液，密封后置于4 °C避光密闭保存。
    注意：灯盏花素是短葶飞蓬（Erigeron breviscapus）中的主要活性成分。通过HPLC-UV测定，胶囊中灯盏花素的浓度为2.56 mg/g，即5.54 µmol/g。8根据野黄芩苷的浓度计算制剂的浓度。这有利于评价制剂及其组分的药理活性。
  6. 通过在15 mL无菌离心管中加入5 mL注射液和5 mL无糖DMEM培养基，配制Ast注射液溶液，得到60 µM的储备液（基于黄芪甲苷A的浓度）。使用0.2 µm细菌滤器过滤该溶液，并将其储存在4 °C的密闭容器中。
    注意：每次注射体积为10 mL，注射液中黄芪甲苷A的浓度经HPLC-ELSD测定为0.094 mg/mL（即120 µM）9应在生物安全柜中进行配制，并全程避光操作。应准确量取注射液和无糖培养基的体积，并充分混匀。
  7. 准确称取7.85 mg黄芪甲苷A标准品，溶于2 mL二甲基亚砜（DMSO）中，充分溶解，配制成5,000 µM的储备液。使用0.22 µm细菌滤器过滤，密封后于4 °C保存。
    注意：黄芪甲苷A粉末在无糖培养基中不溶解。配制溶液时，需用适量DMSO溶解，使DMSO的最终实验浓度低于0.1%，以确保无细胞毒性。
  8. 准确称取11.56 mg野黄芩素标准品，用5 mL无糖DMEM培养基完全溶解，配制成5,000 µM的储备液。使用0.22 µm细菌滤器过滤，密封后于4 ˚C保存。
  9. 准确称取8.86 mg绿原酸标准品，用5 mL无糖DMEM培养基完全溶解，配制5,000 µM的储备液。使用0.22 µm细菌滤器过滤，密封后于4 ˚C保存。
    ​注意：绿原酸粉末不稳定，易吸水，应密封避光保存于 4 °C；称量时应尽量减少暴露时间。

2. 细胞活力检测

  1. 获取PC12细胞，并在添加有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM培养基中进行培养。
    注意：本研究中使用的细胞来自中国科学院。PC12细胞是具有神经内分泌细胞一般特性的贴壁细胞，广泛应用于神经生理学和神经药理学研究。
  2. 在37 °C、5% CO₂的培养箱中培养细胞2 每2-3天传代一次，所有实验均使用第4至第8代的细胞。
  3. 细胞培养
    1. 对处于对数生长期（细胞融合度70%-80%）的PC12细胞，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化，并在显微镜下观察细胞状态。当细胞变圆时，加入3 mL完全培养基终止胰蛋白酶消化。
    2. 将细胞转移至无菌的15 mL离心管中，在840 x g条件下离心细胞 g 5分钟。弃去上清液，用完全培养基重悬细胞，将细胞悬液转移至1.5 mL微量离心管中。随后使用流式细胞仪对细胞数量进行计数。
      1. 启动流式细胞术软件，在计数设置中选择细胞溶液相应的稀释倍数，然后点击 密度图 从1.5 mL 微离心管中加载细胞样品后。
      2. 圈选远离X轴和Y轴的细胞群，右键点击图表下方的数据表，然后选择 X，Y，计数，以及 绝对计数. 数据在以下 绝对计数 数据表中的结果给出了细胞计数。
    3. 将细胞浓度调整至 1 x 105 细胞/mL，每孔接种100 µL至96孔板中，在37 °C、5% CO₂条件下培养2 在培养箱中孵育24小时。
  4. 两种药物对正常PC12细胞安全浓度的筛选
    1. 按照步骤2.1–2.2所述培养细胞。弃去上清液，用不同终浓度的Ast注射液（4、8、12、16、20和24 µM）和Eri胶囊（0.625、1.25、2.5、5、10和20 µM）处理正常细胞。每组设六个复孔，处理24小时。
      注意：将药物加入培养基中以达到药物的终浓度（见步骤2.4.1），然后向每孔中加入等体积的培养基。吸取上清液时，移液枪头应轻轻靠在孔壁上，避免接触孔底的细胞。加入不同溶液时，应沿孔壁轻柔且快速地加入；更换移液枪头时需注意操作，以免影响实验结果。
    2. 弃去上清液，每孔加入120 µL MTT溶液（1 mg/mL），于37 °C孵育4小时。
    3. 孵育结束后，再次弃去上清液，向每孔中加入 150 µL DMSO。使用涡旋振荡器以每分钟 240 次（每分钟水平振动次数）的速度振荡培养板 10 分钟。
    4. 使用酶标仪在490 nm处测定每个样品的吸光度。计算细胞活力（%），即处理组吸光度/正常组（对照组）吸光度 × 100。
      注意：确保 MTT 溶液在有效期内；若溶液颜色发生改变（变为深绿色），则不可使用。检测细胞吸光度时，应设置空白孔（培养基和 MTT，不含细胞或药物），以消除其他试剂的干扰。每孔加入 150 µL DMSO，振荡 10 分钟，以充分溶解蓝紫色结晶。应尽快检测吸光度，以保证结果的准确性。
  5. 筛选两种药物对受损PC12细胞的有效浓度
    1. 将细胞按照步骤2.1–2.2所述培养24 h，弃去上清液，然后每孔加入20 µL CoCl₂进行处理2 (0.4 mM) 与无糖培养基结合使用。
    2. 同时向细胞中加入2, 6, 8, 10 和 12 µM 终浓度的Ast注射液（每孔100 µL）或1, 2, 3, 4 和 5 µM 终浓度的Eri胶囊溶液（每孔100 µL），在37 °C继续孵育24 h。对照组每孔加入120 µL完全培养基。
      注意：CoCl2 诱导细胞产生缺氧条件。
    3. 采用MTT法测定每个样品的吸光度，并按照之前2.4.2和2.4.3步骤所述计算细胞活力。
  6. 基于均匀设计法的两种药物最佳组合筛选
    注意：在获得有效浓度范围后 黄芪 注射用灯盏花素与 breviscapus 胶囊，均匀设计法 U7 (74) 表用于获得两种药物的六种不同组合。Ast 注射剂：Eri 胶囊：1) 2:2.6 µM，2) 4:5 µM，3) 6:1.8 µM，4) 8:4.2 µM，5) 10:1 µM，和 6) 12:3.4 µM。
    1. 按照上述第2.3.1步所述培养细胞，并用上述提及的六个比例浓度的阿司注射液：依瑞胶囊处理受损的PC12细胞。
    2. 处理细胞24小时，并按照之前2.4.2和2.4.3步骤中所述计算细胞活力。
  7. 两种最佳组合对损伤PC12细胞保护作用的评价
    注意：在获得最佳制备组合（Ast注射液与Eri胶囊比例为6:1.8 µM）及最佳组分组合后7 （10 µM 黄芪甲苷A、40 µM 灯盏花素和75 µM 绿原酸），进一步评估其对损伤PC12细胞的保护作用。
    1. 按照步骤2.3.1中所述培养细胞，并根据上述注释中讨论的两种药物组合方式处理受损的PC12细胞。
    2. 处理细胞24小时，并按照之前2.4.2和2.4.3步骤中所述计算细胞活力。

3. 细胞凋亡率的Annexin V-FITC/PI检测

  1. 将PC12细胞以1.3 × 105 个细胞/孔的浓度接种于12孔板中，在37 °C培养24小时。
  2. 分组处理细胞：对照组、模型组及两种药物联合组。向对照组每孔加入1.2 mL完全培养基，向模型组每孔加入含0.4 mM CoCl2的培养基1.2 mL，向两种药物联合组每孔分别加入含0.4 mM CoCl2的两种药物组合培养基各1.2 mL。继续在37 °C培养24小时。
  3. 药物处理后，每孔加入250 µL胰蛋白酶消化细胞，将细胞转移至15 mL离心管中，在室温（RT）下以840 xg离心5分钟。弃去上清液，将沉淀用500 µL结合缓冲液重悬。
    1. 在避光条件下，于室温用5 µL Annexin V-FITC和10 µL碘化丙啶（PI）染色细胞15分钟，随后通过流式细胞术检测细胞凋亡。每组设置三个重复孔。
      注意：本实验所用胰蛋白酶不能含有EDTA，因为EDTA是一种金属离子螯合剂，会与Annexin V竞争结合钙离子，影响Annexin V与PI的亲和力。当细胞发生凋亡时，原本位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻至细胞膜表面，Annexin V-FITC可选择性地与膜外侧的磷脂酰丝氨酸结合，产生绿色荧光。
    2. 在开始菜单中点击自动补偿，在选择通道中选中FITC、PE、PerCP和APC，并选择补偿于：高度。在统计项目：中位数中点击确定。采用步骤2.3.2中所述相同的细胞计数方法收集细胞样本，点击密度图，圈选有效细胞群体。
    3. 以FITC荧光作为X轴参数，其他荧光参数作为Y轴参数，生成密度图。在开始菜单中点击补偿矩阵，并在溢出矩阵中选择系数。显示密度图信息，用于分析细胞凋亡率。

4. 半胱天冬酶-3 生成的免疫荧光检测

  1. 以每张盖玻片 8 × 104 个细胞的密度将 PC12 细胞接种于盖玻片上，置于 24 孔板中，在 37 °C 培养 24 小时。按照上述第 3.2 步所述分组，每组设置三个重复的盖玻片。
  2. 药物处理后，用 PBS（37 °C）洗涤盖玻片两次，每次 5 分钟，随后用 4% 多聚甲醛固定 15 分钟，并在室温下用 0.5% Triton X-100 透化 20 分钟。
  3. 再次洗涤细胞，并用 10% 山羊血清在室温下封闭 1 小时。
  4. 每张盖玻片加入 200 µL 用 1×TBST 稀释至 1:250 浓度的一抗 caspase-3（凋亡的关键执行蛋白），在 4 °C 下孵育过夜。用 1×TBST 洗涤（每次 3 分钟，共三次），然后在避光条件下于室温孵育 200 µL 用 1×TBST 稀释至 1:300 的二抗 1 小时。
    NOTE: 荧光易被淬灭；因此，二抗孵育后应将载玻片避光保存。一抗和二抗均应于 4 °C 避光保存。
  5. 向盖玻片加入 300 µL DAPI（0.5 µg/mL）染核，孵育 10 分钟，随后用 1×TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  6. 在荧光显微镜下观察盖玻片并采集图像10。使用成像软件对荧光强度进行统计分析。
    ​NOTE: 所使用的载玻片和盖玻片应保持清洁且无菌。染色时应注意染色液的 pH、浓度和温度，避免荧光淬灭。荧光显微镜应提前至少 15 分钟开启以预热汞灯，关闭后需等待 30 分钟方可再次启动。图像采集时，同一批实验中同一染料的曝光参数应保持一致，以确保结果的准确性。

5. 活性氧水平的免疫荧光检测

  1. 按照步骤4.1所述培养和处理细胞。
  2. 药物处理后，用PBS洗涤每个盖玻片三次，每次3分钟，并在37 °C下加入400 µL DCFH-DA（10 µM）孵育20分钟。
    注意：DCFH-DA是氧化应激的通用指示剂，具有细胞膜通透性且本身无荧光。一旦进入细胞，会被酯酶水解生成2',7'-二氯二氢荧光素（DCFH），随后迅速被氧化生成强荧光产物。
  3. 再次用无血清DMEM洗涤细胞（每次3分钟，共两次），加入荧光淬灭剂后立即在荧光显微镜下观察盖玻片，并通过成像软件计算相对荧光强度。
    ​注意：加载DCFH-DA探针后，务必清除未进入细胞的残余探针，否则会导致背景信号升高。

6. 蛋白质Nrf2、p-Akt、Akt、Bcl-2和Bax表达的Western印迹检测11,12

  1. 将PC12细胞以每孔1 × 106个细胞的浓度接种于6孔板中，在37 °C培养24 h。按照步骤4.1所述分组并处理细胞，每组设置三个重复孔。
  2. 药物处理24 h后，用PBS洗涤细胞3次，每次5 min，随后在预冷的裂解缓冲液中冰上孵育30 min。裂解完成后，在4 °C、16,000 × g条件下离心20 min，收集上清液。
  3. 采用Bradford法检测蛋白浓度，并根据说明书进行调整。将样品稀释后于100 °C变性10 min。
    注：裂解缓冲液由磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和RIPA裂解液按体积比1:1:50配制而成。对照组每孔需加入200 µL裂解缓冲液，其余各组每孔需100 µL。通常情况下，对照组、模型组及两种联合用药组的蛋白浓度分别为0.45 mg/mL、0.25 mg/mL和0.32–0.39 mg/mL；经上样缓冲液稀释后，其蛋白浓度分别为0.36 mg/mL、0.2 mg/mL和0.256–0.312 mg/mL。
  4. 为检测不同分子量的蛋白质，每孔上样25 µg蛋白，进行12% SDS-PAGE电泳，然后将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上。
    注：配制SDS凝胶时必须充分混匀，避免产生气泡或不溶性颗粒，否则可能导致条带不均或异常。转膜时应确保PVDF膜与凝胶之间无气泡，否则条带上会出现白点。此外，该步骤需在低温条件下进行，冰袋应每30 min更换一次。
  5. 用5%脱脂奶粉在室温下封闭膜1.5 h，随后加入5 mL相应的一抗（Nrf2 1:1,000，Akt 1:2,000，p-Akt 1:2,000，Bcl-2 1:5,000，Bax 1:1,000），在4 °C孵育24 h。以β-actin抗体（1:5,000）作为内参对照。
  6. 用TBST洗涤膜3次，每次10 min，然后在室温下加入5 mL辣根过氧化物酶（HPR）标记的二抗（1:5,000），孵育2 h。
    注：抗体稀释比例不得随意更改，必须严格按照要求充分使用TBST洗涤膜，以避免条带背景过深。
  7. 最后再次用TBST洗涤膜，按照试剂盒说明书使用化学发光HRP底物进行蛋白条带检测。利用化学发光成像系统采集图像，并使用成像软件对蛋白条带灰度值进行定量分析，以β-actin作为内参对照进行比较。

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结果

Ast 注射液与 Eri 胶囊最佳组合的筛选结果如下 图 1. Ast 注射剂与 Eri 胶囊对正常 PC12 细胞存活率的影响如图所示 图 1A细胞活力在 Ast 注射浓度大于 12 时低于 95%。 µM图 1A) 以及浓度高于5的Eri胶囊 µM图 1A），表明最大无毒浓度为12 µM 和 5 µM，分别。其细胞毒性大于单独使用的黄芪甲苷和野黄芩苷。黄芪注射液和益心胶囊对 CoCl 诱导损伤的 PC12 细胞活力的影响2 如图所示 图 1B,与模型组相比，在6-12浓度范围内，黄芪甲苷注射可提高受损PC12细胞的存活率。 µMp < 0.05 或 p < 0.01），以及...

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讨论

在现代临床实践中，治疗脑缺血仍缺乏理想的药物2。在益气活血法的指导下，黄芪甲苷（Ast）、银杏叶提取物（Eri）等制剂已在中医临床实践中联合应用，并展现出良好的综合优势13,14,15。大量研究表明，Ast 能够改善血脑屏障通透性，增加脑血流量，提高神经细胞对缺氧的耐受能力以及抵抗氧自由基损伤的能力，可显著改善神经功能障碍16,17，尤其适用于老年缺血性脑血管病16,17。Eri 具有扩张血管、增加脑部供血、清除活性氧（ROS）、降低脂质过氧化的作用18,19

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由重点研发计划资助 &四川省科学技术厅 #38; D 项目（2020YFS0325）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1300系列II级生物安全柜赛默飞世尔科技仪器公司1374
3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐广州赛国生物科技有限公司1334GR001MTT
ACEA NovoExpress 1.4.0ACEA生物科学公司-
Akt中国武汉三鹰蛋白科技集团有限公司10176-2-AP
分析流式细胞术赛默飞世尔科技仪器公司62-2-1810-1027-0
Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒碧云天生物技术有限公司C1062L
黄芪注射液黑龙江珍宝岛药业有限公司A03190612144Ast注射
黄芪甲苷A重庆高仁生物科技有限公司84687-43-4
Bax中国武汉三鹰蛋白科技集团有限公司60267-1-Ig
BCA蛋白定量试剂盒碧云天生物技术公司P0012
Bcl-2中国武汉三鹰蛋白科技集团有限公司26593-1-AP
二氧化碳培养箱赛默飞世尔科技仪器公司0816-2014
Caspase-3中国武汉三鹰蛋白科技集团有限公司19677-1-AP
绿原酸重庆高仁生物科技有限公司327-97-9
六水合氯化钴默克生物技术公司7791-13-1CoCl2
二甲基亚砜广州赛国生物科技有限公司2020112701DMSO
十二水合磷酸氢二钠成都科隆化学品有限公司2020090101
DMEM高糖培养基赛默飞世尔科技 Hyclone2110050
无糖DMEM培养基北京索莱宝科技有限公司2029548
ECL 发光液联硕生物公司WBKLS0500
电子天平中国上海恒平科学仪器有限公司FA1204
电泳仪伯乐生命科学（上海）有限公司1658026
短葶飞蓬胶囊云南贝克制药有限公司Z53021671Eri 胶囊
胎牛血清四季生物工程研究所20210402FBS
荧光显微镜Olympms CorporationIX71-F32PH
凝胶成像仪伯乐生命科学（上海）有限公司1708265
山羊抗小鼠二抗武汉三鹰普罗蒂恩泰克集团有限公司SA00001-1
山羊抗兔二抗中国武汉三鹰蛋白科技集团有限公司SA00001- 2
IBM SPSS Statistics 版本 26.0国际商业机器公司，美国-
ImageJ 1.8.0美国国立卫生研究院-成像软件
免疫学 荧光 染色试剂盒碧云天生物技术有限公司P0196
KCl成都科隆化学品有限公司2021070901
标记物赛默飞世尔科技仪器公司26616
酶标仪珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司HH35L2018296
Motic 倒置显微镜Nanda Scientific Instruments Co.AE2000LED
NaCl成都科隆化学品有限公司2014081301
脱脂牛奶碧云天生物技术有限公司P0216
Nrf2中国武汉三鹰蛋白科技集团有限公司16396-1-AP
P-Akt武汉三鹰普罗蒂恩泰克集团有限公司66444-1-Ig
PC12细胞中国科学院CBP60430
青霉素-链霉素溶液赛默飞世尔科技 HycloneSV30010
磷酸酶-蛋白酶抑制剂混合物碧云天生物技术有限公司P1045
磷酸二氢钾成都科隆化学品有限公司2015082901
活性氧检测试剂盒碧云天生物技术有限公司S0033S
RI-PA 裂解液碧云天生物技术有限公司P0013B
灯盏花素重庆高仁生物科技有限公司27740-01-8
5× SDS-PAGE上样缓冲液碧云天生物技术有限公司P0015L
无菌滤芯吸头（0.22 µm)默克生物技术公司SLGP033RB
Tris碱广州赛国生物科技有限公司1115GR500 TBS
胰蛋白酶赛默飞世尔科技 HycloneJ190013
Tween-20成都科隆化学品有限公司2021051301
涡旋振荡器奥豪斯国际有限公司，中国上海VXMNAL
β-肌动蛋白中国武汉三鹰蛋白科技集团有限公司66009-1-Ig

参考文献

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