本文介绍一种简化的果蝇内源基因标记方法，该方法利用基于PCR的技术对成功的基因修饰进行无标记鉴定，从而促进稳定敲入品系的建立。
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本文内容
摘要
摘要
活细胞中蛋白质亚细胞定位、动态行为及调控的研究，因能够对内源基因进行标记以产生荧光融合蛋白的技术出现而发生了深刻变革。这些方法使研究人员能够实时观察蛋白质的行为，从而深入了解其在细胞环境中的功能与相互作用。目前许多基因标记研究采用两步法：第一步利用可见标记（如眼色变化）识别基因改造的生物体，第二步则切除该可见标记。本文介绍一种在Drosophila melanogaster中实现精确且快速内源基因单步标记的实验方案，该方法无需依赖可见的眼部标记即可筛选工程品系，相较于以往方法具有显著优势。为筛选成功的基因标记事件，我们采用基于PCR的技术，通过分析个体果蝇中足的一小段组织进行基因型鉴定。通过筛选标准的果蝇将用于建立稳定的品系。本文详细阐述了CRISPR编辑质粒的设计与构建，以及工程品系的筛选与验证方法。该方案整体显著提高了在Drosophila中进行内源基因标记的效率，并推动了对活体细胞过程的研究。
引言
荧光蛋白已成为在活体生物的细胞内可视化蛋白质定位、动态行为以及蛋白质-蛋白质相互作用的有力工具1,2。利用荧光蛋白标记内源性基因，可实现对细胞过程进行长期的活体成像，并达到亚细胞分辨率。此外，与蛋白质过表达和免疫染色方法相比，这类内源性基因标记技术具有多种优势。例如，蛋白质过表达可能导致蛋白质错误折叠、非特异性的蛋白质-蛋白质相互作用以及异常定位3。迄今为止，研究人员已为少数模式生物（如能够高效进行同源重组的芽殖酵母）构建了大量将内源性基因与荧光蛋白融合的文库4。对于黑腹果蝇（Drosophila melanogaster），研究人员已开发出多种工具用于基因的荧光标记，包括MiMIC元件5、基于转座子的增强子捕获系统6以及fosmid文库7。
CRISPR-Cas9 技术工具的开发使得在多种模式生物中高效地进行基因组编辑成为可能，包括对内源性蛋白质进行标记8,9。Cas9 是一种由 RNA ....
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方案
1. 基因编辑试剂的设计与构建
注意：进行内源性标记时，必须确定目标基因的各种同工型。根据实验的具体目标，可将荧光标签插入所选蛋白质同工型的内部，或位于其N端或C端。为了实现最佳的CRISPR介导编辑，必须将两个sgRNA定位在预期敲入位点附近合适的位置。随后，为通过同源重组实现编辑，应制备包含与目标基因同源序列以及荧光标签的供体质粒。以下是这些步骤的详细指南（图1）。
- 按照以下说明设计sgRNA。
- 使用以下网站为Drosophila设计sgRNA： http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/ 或 http://www.flyrnai.org/crispr2/。
- 在flycrispr网站中，输入目标敲入位点（N端、C端或任何感兴趣的基因组位点）上下游±100 bp范围内的序列。如果使用nos-Cas9 attP2作为显微注射背景，请选择基因组选项Drosophila melanogaster (nos-Cas9 III, BDSC #78782)。Nos-Cas9系统可确保Cas9在生殖系中特异性表达。
- 为提高sgRNA的表达效率，请选择CRISPR targets with ....
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结果
在我们的实验中，针对所有染色体（X、II、III）上的各种内源性标记基因进行筛选时，成功率通常约为 20%–30%。该过程的效率可能因多种因素而异，例如 gRNA 的选择、基因本身的特性以及显微注射的质量。在此，我们展示了利用 mNeonGreen 荧光蛋白对内源性period基因进行标记的策略所获得的结果13。period基因位于D. melanogaster的 X 染色体上，在昼夜节律钟中发挥关键作用。Drosophila具有一个特征明确的生物钟网络，由大约 150 个表达时钟蛋白的时钟神经元组成17。
我们在Period蛋白的C末端通过双甘氨酸连接子连接绿色荧光蛋白mNeonGreen进行标记13。质粒注射后，我们将G0代果蝇与FM7.......
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讨论
实验结果表明，本研究建立了一种高效、简便的一步法CRISPR策略，用于在Drosophila中对内源性基因进行标记。在本实验方案中，我们使用两个gRNA以更高效地诱导DNA双链断裂和同源重组。将gRNA与供体质粒共同注射到在其生殖系中表达Cas9酶的果蝇胚胎中。这些胚胎随后在标准条件下培养至成虫阶段，然后与平衡染色体果蝇杂交，以获得第一代（F1）子代。对每只F1个体的中足进行PCR基因型鉴定，以筛选出基因修饰成功的果蝇。该方法相较于目前常用的两步筛选法具有显著优势：现有方法的第一步依赖于眼色等可见标记来识别目标基因型，第二步则需去除眼色标记10。本文介绍的方法通过从单只果蝇中足的一小段组织提取DNA并进行PCR检测，实现了对个体果蝇的非致死性基因型分析，提供了一种更为高效且经济的替代方案。该方法可对候选个体逐一或批量筛选，直至获得目标基因型。在获得合适品系前所需筛选的个体数量因实验而异，受多种因素影响，包括所选sgRNA的效率、显微注射效率以及可能影响存活率的脱靶插入事件。此外，也可采用单个果蝇翅膀组织提取的DNA进行基因型鉴定18
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
我们感谢 George Watase 和 Josie Clowney 在本实验方案开发初期阶段的讨论。本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金（资助号 R35GM133737，授予 S.Y.）、阿尔弗雷德·P·斯隆研究员项目（授予 S.Y.）以及麦Knight学者奖（授予 S.Y.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5M EDTA pH8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 5-alpha 感受态 E. coli （高效） | NEB | C2987H | |
| 96孔深孔板 | BRAND | 701354 | |
| 琼脂 | 赛默飞世尔科技 | BP1423-500 | |
| BbsI-HF | NEB | R3539S | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | 赛默飞世尔科技 | K1081 | |
| D-蔗糖 | 赛默飞世尔科技 | BP220-1 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101S | |
| 盐酸 | 赛默飞世尔科技 | A142-212 | |
| Prolong Glass 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36982 | |
| 蛋白酶K | QIAGEN | 19131 | |
| Schneider's Drosophila 培养基 | Gibco | 21720001 | |
| 氯化钠 | 赛默飞世尔科技 | S271-500 | |
| T4 DNA连接酶 | NEB | M0202S | |
| Tris碱 | 赛默飞世尔科技 | BP152-500 | |
| XbaI | NEB | R0145S |
参考文献
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for d....
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