本文介绍了一种在水培条件下利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS-MS）测定吡虫啉在小麦中吸收、转运和分布的实验方案。结果表明，小麦能够吸收吡虫啉，且在小麦的根和叶片中均检测到了吡虫啉的存在。
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本文内容
摘要
摘要
新烟碱类杀虫剂因其新颖的作用机制、高效的杀虫活性以及较强的根部吸收能力而被广泛使用。吡虫啉是全球使用最广泛的杀虫剂，属于典型的第一代新烟碱类杀虫剂，常用于农作物、蔬菜和果树的害虫防治。由于吡虫啉应用范围广泛，其在农作物中的残留问题日益受到关注。本研究将15株小麦幼苗置于含有0.5 mg/L或5 mg/L吡虫啉的培养液中进行水培。通过测定水培1天、2天和3天后小麦根部和叶片中吡虫啉的含量，探究吡虫啉在小麦体内的迁移与分布规律。结果表明，小麦的根部和叶片中均检测到吡虫啉残留，且根部的吡虫啉含量高于叶片。此外，随着暴露时间的延长，小麦体内吡虫啉的浓度逐渐升高。暴露3天后，0.5 mg/L处理组的小麦根部和叶片中吡虫啉含量分别为4.55 mg/kg ± 1.45 mg/kg和1.30 mg/kg ± 0.08 mg/kg；而5 mg/L处理组的根部和叶片中吡虫啉含量分别为42.5 mg/kg ± 0.62 mg/kg和8.71 mg/kg ± 0.14 mg/kg。本研究结果有助于更深入理解农作物中农药残留的迁移行为，为农药的环境风险评估提供了数据参考。
引言
在现代农业中，农药的使用对于提高作物产量至关重要。新烟碱类杀虫剂通过作用于昆虫神经系统的烟碱型乙酰胆碱受体，改变膜电位平衡，从而抑制昆虫中枢神经系统的正常传导，导致昆虫麻痹并死亡1。与传统杀虫剂相比，新烟碱类杀虫剂具有作用机制新颖、杀虫活性高、根部吸收能力强等优势，因而在农药市场中取得了巨大成功2,3。据报道，2014年新烟碱类杀虫剂的销售额占全球农药市场的27%。2005年至2010年间，其年均增长率达11.4%，其中约7%的登记产品来自中国4,5,6。从2016年底至2017年上半年，中国农药销售在经历下滑后开始回升，农药价格持续上涨，其中新烟碱类杀虫剂价格上涨尤为显著7。迄今为止，已研发出三代新烟碱类杀虫剂，分别含有吡啶氯、噻唑基和四氢呋喃基等尼古丁衍生物结构8。
吡虫啉是第一代新烟碱类杀虫剂，其分子式为 C9H10ClN5O2，呈无色晶体。吡虫啉主要用于防治蚜虫、飞虱、黄粉虫和蓟马等害虫9，可应用于水稻、小麦、玉米、棉花以及马铃薯等蔬菜和果树作物。由于长期、大量且持续地使用农药，有益昆虫及害虫天敌数量迅速减少，部分农业害虫已对农药产生抗性，导致农药使用量不断加大并形成恶性循环10。此外，农药的广泛使用还导致土壤质量退化、农产品中农药残留持久存在等一系列生态问题，不仅对农业生态环境造成严重破坏11，也对人类健康构成严重威胁12。农药喷洒显著影响土壤微生物和土壤动物的生长与质量13。农药不合理或过度使用已对土壤和水环境、动植物乃至人类生命安全带来重大风险14。近年来，随着农药的广泛施用，农作物中农药残留超标问题日益严重。在使用吡虫啉提高蔬菜产量时，蔬菜对吡虫啉的吸收率随施用量及残留量的增加而升高15。小麦作为主要粮食作物，其产量与安全性均至关重要。因此，亟需明确用于小麦的农药残留及其分布规律。
近年来，已开发出多种方法用于从水、土壤和植物中提取吡虫啉残留。QuEChERS 方法（快速、简便、廉价、高效、耐用且安全）是一种结合了固相微萃取技术和分散固相萃取技术的新型方法，该方法以乙腈作为萃取溶剂，并分别利用 NaCl 和无水 MgSO4 去除样品中的混合杂质和水分16。QuEChERS 方法所需玻璃器皿极少，实验步骤简单，已成为最受欢迎的农药提取方法之一17。在吡虫啉检测方面，液相色谱（LC）已实现低至 1 × 10−9 g 的检测限18，气相色谱（GC）则达到 1 × 10−11 g 的检测限19。由于具有高分辨率和高灵敏度，液相色谱-质谱联用（LC-MS）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）的吡虫啉检测限更低，可达 1 × 10-13 至 1 × 10-14 g20,21；因此，这些技术非常适用于痕量吡虫啉残留的分析。
本研究选择吡虫啉作为目标污染物，小麦作为受试作物，研究吡虫啉残留物在小麦中的分布情况。本方案详细阐述了一种在水培条件下，通过探究小麦植株不同部位对吡虫啉的吸收与蓄积，从而全面分析该农药在小麦中富集与转移的方法。本研究旨在为小麦中农药残留的风险评估提供理论依据，指导农业生产活动中农药的合理施用，以减少农药残留，提高作物生产的安全性。
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方案
1. 小麦种子的萌发
- 选取1,000粒小麦种子（济麦20），要求籽粒完整、胚部健全且大小均匀（长度：6 mm ± 0.5 mm）。
- 将333.3 mL的30% H2O2溶液转移至1 L容量瓶中，用去离子水定容至1 L，配制成10% H2O2溶液。将小麦种子浸入10% H2O2溶液中消毒15分钟（图1）。
- 用流动的无菌水冲洗小麦种子5次，每次10秒。
- 将小麦种子均匀铺放在含有湿润无菌滤纸的玻璃培养皿中，胚部朝上（图2）。将培养皿置于人工气候培养箱中，在30 °C、80%相对湿度条件下暗培养3天，直至种子萌发并生根。
图1：小麦种子的表面消毒。 将小麦种子置于烧杯中的10% H2O2 溶液中浸泡15分钟，以消毒种子表面。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：小麦种子的萌发。 将小麦种子均匀铺展在含有湿润无菌滤纸的玻璃培养皿中。将培养皿置于人工气候培养箱中以促进小麦种子萌发。 请点击此处查看该图的放大版本。
2. 小麦幼苗的培养
- 将551 mg霍格兰基本盐混合物溶解于1 L去离子水中，配制1/2霍格兰营养液（含0.75 mmol/L K2SO4、0.1 mmol/L KCl、0.6 mmol/L MgSO4、4.0 × 10−2 mmol/L FeEDTA、1.0 × 10−3 mmol/L H3BO3、1.0 × 10−3 mmol/L MnSO4、1.0 × 10−3 mmol/L ZnSO4、1.0 × 10−4 mmol/L CuSO4和5.0 × 10−6 mmol/L Na2MoO4）。
- 待小麦种子（步骤1.4）萌发后，将15株小麦幼苗置于含有100 mL 1/2霍格兰营养液的水培装置（见材料表）中进行水培（图3）。将整个水培装置放入人工气候培养箱（见材料表）中，在25 °C、80%相对湿度、16小时光照/8小时黑暗光周期条件下培养7天。
图3：小麦幼苗的水培培养。 小麦幼苗在100 mL的1/2 Hoagland营养液中分别进行0天、3天和7天的水培培养。 请点击此处查看该图的放大版本。
3. 将小麦植株暴露于吡虫啉溶液的实验
- 经过7天的水培期后，将小麦植株移栽至含有0.5 mg/L或5 mg/L吡虫啉的1/2霍格兰营养液中，开展吡虫啉暴露实验。每个水培装置中种植15株小麦植株。每种吡虫啉浓度组设置15个水培装置，以确保采样期间获得足够的样本量。
- 将整个水培装置置于人工气候培养箱中，在25 °C、80%相对湿度、16小时光照/8小时黑暗光周期条件下培养3天。
- 在暴露期间，每日采集小麦根部（每株小麦0.2 g）和叶片（每株小麦0.5 g）。将每第5个水培装置中的小麦样品合并为一个平行组，测定样品中吡虫啉的含量。
4. 从小麦中提取吡虫啉的步骤
- 从小麦根中提取吡虫啉
- 为避免实验误差，用流动的无菌水清洗小麦根，每次10秒，共清洗4次，以去除吸附在根表面的吡虫啉。
- 用剪刀将小麦根剪成约1 cm长的小段（图4）。称取10.00 g剪碎后的小麦根，放入50 mL离心管中。
- 向离心管中加入10 mL乙腈，用涡旋振荡器涡旋1分钟。然后立即向离心管中加入4 g无水MgSO4和1.5 g NaCl，再立即涡旋30秒。在6,000 × g条件下离心5分钟。
- 用一次性注射器吸取上清液，并通过针头过滤器（0.22 µm孔径）过滤，得到待测样品。
- 从小麦叶片中提取吡虫啉（图5）
- 用剪刀将新鲜小麦叶片剪成约1 cm长的小段（图4）。称取10.00 g剪碎后的小麦叶片，放入50 mL离心管中。
- 向离心管中加入10 mL乙腈，用涡旋振荡器涡旋1分钟。
- 向离心管中加入4 g无水MgSO4和1.5 g NaCl，立即涡旋30秒。
- 在6,000 × g条件下离心5分钟。
- 离心后，取2 mL上清液加入含有50 mg石墨化炭黑（GCB）和150 mg无水MgSO4的5 mL离心管中（用于去除样品中的色素和水分），涡旋30秒（图6）。在6,000 × g条件下离心5分钟。
- 用一次性注射器吸取上清液，并通过针头过滤器（0.22 µm孔径）过滤，得到待测样品。
图 4：粉碎后的小麦根部与叶片。 将新鲜的小麦根部和叶片用剪刀剪碎成约 1 cm 的小段。 请点击此处查看该图的高清版本。
图 5：小麦叶片中吡虫啉的提取。 样品中的吡虫啉采用 QuEChERS 方法进行提取（实验方案步骤 4.2.1-4.2.4）。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：小麦叶片中吡虫啉的纯化。 去除污染物所用试剂为50 mg GCB + 150 mg MgSO4。 请点击此处查看该图的放大版本。
5. 啊咪克洛普的定量分析
- 采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS-MS），根据0.2–250 µg/L浓度范围内吡虫啉绘制的标准曲线（y = 696.61x + 56.411，R=1）对样品中吡虫啉进行定量（图7）。质谱仪配备C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm，3 µm）和电喷雾离子化源（ESI+）。洗脱程序及离子源参数见表1。
图7：小麦叶片中吡虫啉的色谱图与质谱图。 上图显示吡虫啉的色谱图（保留时间 = 0.93 min）。下图显示在0.93 min时吡虫啉的质谱图，展示吡虫啉产物离子（m/z = 208.8）的响应强度。请点击此处查看此图的放大版本。
| 柱温 | 40 °C |
| 溶剂 A | 99.9% 水/0.1% 甲酸 (v/v) |
| 溶剂 B | 乙腈 |
| 洗脱程序 | 0–0.5 min, A = 20% |
| 0.5–2 min, A = 20%–50% | |
| 2–3 min, A = 50% | |
| 3–3.1 min, A = 50%–20% | |
| 3.1–5 min, A=20% | |
| 流速 (mL/min) | 0.3 |
| 进样体积 (μL) | 5 |
| 毛细管温度 (°C) | 330 |
| 汽化器温度 (°C) | 350 |
| 鞘气流速 (Arb) | 40 |
| 辅助气流速 (Arb) | 20 |
| 喷雾电压 (V) | 3900 |
| 碰撞气压力 (mTorr) | 1.5 |
| 前体离子 | 256.1 |
| 产物离子/碰撞能量 (eV) | 208.8/16 |
表1：液相色谱-质谱法的洗脱程序和离子源参数。
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结果
吡虫啉的仪器检出限（LOD）为 5.76 × 10−14 g，该方法在小麦根或叶中吡虫啉的检出限为 0.01 µg/kg；未观察到基质效应。表 2 显示了小麦中吡虫啉的回收率。在暴露于 0.5 mg/L 和 5 mg/L 吡虫啉浓度下，小麦根中吡虫啉的回收率分别为 94.0%–97.6% 和 98.8%–99.2%；变异系数分别为 1.92% 和 0.20%。在暴露于 0.5 mg/L 和 5 mg/L 吡虫啉浓度下，小麦叶中吡虫啉的回收率分别为 88.2%–91.4% 和 92.5%–93.4%；变异系数分别为 1.85% 和 0.53%。
小麦根部和叶片中的吡虫啉浓度如表3所示。在小麦的根部和叶片中均检测到吡虫啉，且根部含量高于叶片。随着暴露时间的延长，吡虫啉含量逐渐增加。在0.5 mg/L处理组中，暴露3天后，小麦根部和叶片中吡虫啉的含量分别为4.55 mg/kg ± 1.45 mg/kg和1.30 mg/kg ± 0.08 mg/kg；在5 mg/L处理组中，相应含量分别为42.5 m...
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讨论
近年来，关于农药吡虫啉残留的前处理与检测方法的报道较为频繁。Badawy 等人23采用高效液相色谱法测定温室条件下种植的番茄果实中吡虫啉的含量，报道了吡虫啉在 0.0125–0.15 µg/mL 范围内具有良好的线性关系。Zhai 等人24采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS-MS）研究了韭菜中吡虫啉的残留情况。本研究采用 QuEChERS 方法从小麦根和叶中提取吡虫啉。作为一种快速高效的提取方法，QuEChERS 方法适用于从小麦等多种植物20,26（如辣椒、番茄、卷心菜）以及土壤25样品中提取吡虫啉，并已被广泛应用。本研究的目的是确定吡虫啉的回收率是否稳定并满足检测要求。小麦中吡虫啉的回收率和变异系数均符合残留检测的要求，表明该方法适用于从小麦中提取吡虫啉。本研究采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS-MS）测定吡虫啉含量，仪器对吡虫啉的检出限满足农药残留定量分析的要求。然而，...
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披露
作者声明不存在利益冲突。所有作者均已阅读并批准了该稿件。本研究工作此前未发表过，也未同时提交给其他任何同行评审期刊考虑发表。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（编号：42277039）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙腈 | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd. | 01-06-1995 | 适用于高效液相色谱，梯度级，>99.9% |
| 分析天平 | Sartorius Lab Instruments Co.Ltd. | GL124-1SCN | |
| 人工气候培养箱 | 上海八旦仪器设备有限公司 | HK320 | |
| 离心机 | 艾本德（中国）有限公司 | Centrifuge5804 | |
| 一次性注射器 | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd. | Z116866 | 容量 5 mL，刻度 0.2 mL，非无菌 |
| 甲酸 | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd. | Y0001970 | 欧洲药典标准品 |
| 石墨化炭黑（GCB） | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd. | V900058 | 45 μm |
| H2O2 | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. | 31642 | 30% (w/w) |
| 霍格兰氏基本盐混合物（Hoagland’s Basal Salt Mixture） | 上海宇帛生物科技有限公司 | NS1011 | 无水，试剂级 |
| 水培设备 | 江苏荣诚农业科技发展有限公司 | SDZ04BD | |
| Hypersil BDS C18 色谱柱 | 赛默飞世尔科技（中国）有限公司 | 28103-102130 | |
| 吡虫啉 | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd. | Y0002028 | 欧洲药典标准品 |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd. | 208094 | 无水，试剂级，>97% |
| NaCl | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. | S9888 | 试剂级，99% |
| pH 计 | 上海雷磁仪器厂 | PHSJ-3F | |
| 植物生长箱 | 哈尔滨东联电子技术有限公司 | HPG-280B | |
| 移液器 | 艾本德（中国）有限公司 | Research plus | |
| 注射式滤器 | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. | SLGV033N | 尼龙材质，孔径 0.22 µm，直径 33 mm，非无菌 |
| 超高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪 | 赛默飞世尔科技（中国）有限公司 | UltiMate 3000 | |
| TSQ Quantum Access MAX | |||
| 涡旋混合器 | 上海叶拓科技有限公司 | Vortex-2 | |
| 小麦种子 | 鲁科种业 | 济麦20 |
参考文献
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