吡虫啉在小麦中吸收、易位和分布的测定

摘要

这里介绍的是使用液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）测定水培条件下小麦中吡虫啉的吸收，易位和分布的方案。结果表明:吡虫啉可被小麦吸收，在小麦根系和叶片均检测到吡虫啉。

摘要

新烟碱类杀虫剂是一类杀虫剂，因其新颖的作用方式、高杀虫活性和强大的根系吸收而被广泛使用。吡虫啉是全球使用最广泛的杀虫剂，是具有代表性的第一代新烟碱类杀虫剂，用于农作物、蔬菜和果树的害虫防治。随着吡虫啉的广泛应用，其在作物中的残留物引起了越来越多的关注。本研究将15株小麦幼苗置于含有0.5 mg/L或5 mg/L吡虫啉的培养基中水生培养。在水培1 d、2 d和3 d后测定小麦根叶中吡虫啉的含量，探讨吡虫啉在小麦中的迁移和分布。结果表明:小麦植株根叶均检出吡虫啉，根系吡虫啉含量高于叶片;此外，小麦中吡虫啉浓度随着暴露时间的增加而增加。暴露3 d后，0.5 mg/L处理组小麦根叶分别含有4.55 mg/kg±1.45 mg/kg和1.30 mg/kg±0.08 mg/kg吡虫啉，5 mg/L处理组根叶分别含有42.5 mg/kg±0.62 mg/kg和8.71 mg/kg±0.14 mg/kg吡虫啉， 分别。本研究结果有助于更好地了解作物中的农药残留情况，为农药环境风险评估提供数据参考。

引言

在当今的农学中，使用杀虫剂对于提高作物产量至关重要。新烟碱类杀虫剂通过控制昆虫神经系统中的烟碱乙酰胆碱受体来改变膜电位平衡，从而抑制昆虫中枢神经系统的正常传导，导致昆虫瘫痪和^死亡1。与传统杀虫剂相比，新烟碱类具有作用方式新颖、杀虫活性高、根系吸收强等优点，使其在^{农药市场上大}获成功2^，3。据报道，2014年新烟碱类药物的销量占世界农药市场的27%。2005—2010年，新烟碱类的年均增长率为11.4%，其中约7%在中国注册4，^5，6。2016年底至2017年上半年，我国农药销量在回落后开始反弹，农药价格持续上涨，其中新烟碱类杀虫剂价格呈现大幅涨^幅7。到目前为止，已经开发了三代新烟碱类杀虫剂，每代含有吡啶氯、噻唑基和四氢呋喃基团的尼古丁，分别为⁸.

吡虫啉是第一代新烟碱类杀虫剂，分子式为C₉H₁₀ClN₅O₂，为无色结晶。吡虫啉主要用于防治害虫，如蚜虫、飞虱、黄粉虫和蓟马⁹ ，可应用于水稻、小麦、玉米、棉花等作物和马铃薯等蔬菜以及果树。由于农药的长期、大量、持续施用，既有益虫，也有害虫的天敌迅速减少，一些农业害虫对农药产生抗药性，造成农药持续施用量不断增加的恶性循环¹⁰.此外，农药的广泛使用导致土壤质量恶化，农产品中农药残留持久性等生态问题，不仅对农业生态环境造成重大破坏¹¹ ，而且对人类健康构成严重威胁¹²。农药喷洒严重影响土壤微生物和土壤动物的生长和质量¹³.农药的不合理或过量使用，给水土环境、动植物甚至人类生命造成了重大安全隐患¹⁴。近年来，随着农药的广泛应用，农作物农药残留超标问题愈发严重。当吡虫啉用于提高蔬菜产量时，吡虫啉在蔬菜中的吸收率随着吡虫啉的量和残留量的增加而增加¹⁵。作为主要粮食作物，小麦的生产和安全都至关重要。因此，小麦用农药的残留和分配政策需要明确。

近年来，已经开发出许多从水、土壤和植物中提取吡虫啉残留物的方法。QuEChERS方法（快速、简单、廉价、有效、坚固、安全）是一种结合了固相微萃取技术和分散固相萃取技术的新方法，涉及使用乙腈作为萃取溶剂，分别使用NaCl和无水MgSO₄去除样品中的混合杂质和水¹⁶.QuEChERS方法需要最少的玻璃器皿，并且具有简单的实验步骤，使其成为最受欢迎的农药提取方法之一¹⁷。对于吡虫啉的检测，液相色谱（LC）的检测限低至1×10−9 g¹⁸，气相色谱（GC）的检测限低至1 × 10⁻¹¹ g ¹⁹。由于其高分辨率和灵敏度，LC-MS和GC-MS显示出更低的吡虫啉检测限，为1×^10-13至1×^{10-14g 20，21};因此，这些技术非常适合分析痕量吡虫啉残留物。

本研究以吡虫啉为目标污染物，以小麦为试验作物，研究吡虫啉残留在小麦中的分布情况。该协议详细介绍了一种通过探索吡虫啉在水培条件下生长的小麦植物不同部分的吸收和储存来全面分析小麦中农药吡虫啉富集和转移的方法。本研究旨在为小麦农药残留风险评估提供理论依据，指导农业生产活动中合理施用农药，减少农药残留，提高作物生产安全性。

方案

1. 小麦种子的发芽

1. 选择1，000粒小麦种子（Jimai 20），具有完整的颗粒，完整的胚胎和均匀的大小（长度:6毫米±0.5毫米）。
2. 将 333.3 mL 30% H 2 O 2 溶液转移到 1 L 容量瓶中，并用去离子水稀释以制备 1 L 10% H 2 O₂溶液。将小麦种子浸入10%H₂O₂溶液中15分钟以消毒种子表面（图1）。
3. 用流动的无菌水冲洗小麦种子5次，每次10秒。
4. 均匀地散布小麦种子，胚胎指向装有潮湿无菌滤纸的玻璃培养皿中（图2）。将培养皿置于30°C和80%相对湿度的人工气候培养箱中。将小麦种子在黑暗中培养3天，直到它们发芽并生根。

图1:小麦种子的消毒。 将小麦种子浸泡在10%H₂O₂ 溶液（烧杯中）中15分钟以消毒种子表面。 请点击此处查看此图的大图。

图2:小麦种子发芽。 将小麦种子均匀地散布在含有潮湿无菌滤纸的玻璃培养皿中。将培养皿置于人工气候培养箱中以使小麦种子发芽。 请点击此处查看此图的大图。

二、小麦苗的栽培

1. 将 551 mg Hoagland 的基础盐混合物溶解在 1 L 去离子水中，制备 1/2 Hoagland 营养液（含有 0.75 mmol/L K₂SO 4、0.1 mmol/L KCl、0.6 mmol/L MgSO 4、4.0 × 10⁻² mmol/L FeEDTA、1.0 × 10−3 mmol/L H 3 BO₃、1.0 × 10⁻³ mmol/L MnSO ₄， 1.0 × 10⁻³ 毫摩尔/升 氧化锌₄、1.0 × 10⁻⁴ 毫摩尔/升铜酸₄ 和 5.0 × 10⁻⁶ 毫摩尔/升_{Na 2} MoO₄）。
2. 小麦种子（步骤1.4）发芽后，将15棵小麦幼苗放入含有100mL水培1/2 Hoagland营养液的水培设备（见 材料表）中（图3）。将整个水培装置置于人工气候培养箱（见 材料表）中，并在25°C和80%相对湿度下以16小时光照/ 8小时黑暗光周期孵育7天。

图3:小麦幼苗的水培栽培。 小麦幼苗在100 mL 1/2 Hoagland营养液中水培0 d、3 d和7 d。 请点击此处查看此图的大图。

3.将小麦植株暴露于吡虫啉溶液中的实验

1. 经过7 d的水培期后，将小麦植株移植到含有0.5 mg/L或5 mg/L吡虫啉的1/2 Hoagland营养液中进行吡虫啉暴露实验。在每个水培装置中种植15株小麦植物。为每个吡虫啉浓度组设置15个水培装置，以确保在取样过程中采集足够的样品。
2. 将整个水培设备置于人工气候培养箱中，在25°C和80%相对湿度下以16小时光照/ 8小时黑暗光周期放置3天。
3. 在整个暴露期间，每天收集小麦根（每株小麦0.2克）和叶子（每株小麦0.5克）。将来自每五个水培装置的小麦样品整合为平行组，并确定样品的吡虫啉含量。

4.从小麦中提取吡虫啉的程序

1. 从小麦根系中提取吡虫啉
   1. 为避免实验错误，每次用流动的无菌水洗涤小麦根部4倍，以去除吸附在根表面上的任何吡虫啉。
   2. 用剪刀将小麦根切成约1厘米的碎片（图4）。称取 10.00 g 切碎的小麦根，放入 50 mL 离心管中。
   3. 向离心管中加入10mL乙腈，并在涡旋器上涡旋管1分钟。然后，向离心管中加入4g无水MgSO₄ 和1.5gNaCl，并立即涡旋管30秒。将试管以6，000× g离心5分钟。
   4. 用一次性注射器吸出上清液并将其通过注射器过滤器（0.22μm孔径）以获得样品。
2. 从小麦叶片中提取吡虫啉（图5）
   1. 用剪刀将新鲜小麦叶切成约1厘米的碎片（图4）。称取 10.00 g 切碎的小麦叶，放入 50 mL 离心管中。
   2. 向离心管中加入10mL乙腈，并在涡旋器上涡旋管1分钟。
   3. 向离心管中加入4g无水MgSO₄ 和1.5gNaCl，并立即涡旋管30秒。
   4. 将试管以6，000× g离心5分钟。
   5. 离心后，将 2 mL 上清液加入含有 50 mg 石墨化炭黑 （GCB） 和 150 mg 无水 MgSO₄ 的 5 mL 离心管中（以去除样品中的色素和水分），并涡旋离心管 30 秒（图 6）。将试管以6，000× g离心5分钟。
   6. 用一次性注射器吸出上清液并将其通过注射器过滤器（0.22μm孔径）以获得样品。

图4:切碎的小麦根和叶。 新鲜小麦的根和叶用剪刀切成约1厘米的碎片。 请点击此处查看此图的大图。

图5:小麦叶片中吡虫啉的提取。 使用QuEChERS方法提取样品中的吡虫啉（协议的步骤4.2.1-4.2.4）。 请点击此处查看此图的大图。

图6:小麦叶片中吡虫啉的纯化。 去污剂为50毫克GCB+ 150毫克MgSO₄。 请点击此处查看此图的大图。

5.吡虫啉的定量

1. 使用液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）定量样品中的吡虫啉，基于从0.2-250μg/ L吡虫啉浓度获得的标准曲线（y = 696.61x + 56.411，R = 1）。（图7）。质谱仪配备了C₁₈ 色谱柱（100 mm x 2.1 mm，3 μm）和电喷雾电离源（ESI⁺）。洗脱程序和离子源参数如 表1所示。

图7:小麦叶片中吡虫啉的色谱图和质谱图。 上图显示了吡虫啉的色谱图（保留时间= 0.93分钟）。下图显示了吡虫啉在0.93 min时的质谱图，显示了吡虫啉生产的反应强度（m / z = 208.8）。 请点击此处查看此图的大图。

柱温	40 °C
溶剂A	99.9% 水/0.1% 甲酸 （V/V）
溶剂B	乙 腈
洗脱程序	0–0.5 分钟，A = 20%
	0.5–2 分钟，A = 20%–50%
	2–3 分钟，A = 50%
	3–3.1 分钟，A = 50%–20%
	3.1–5 分钟，A=20%
流速（毫升/分钟）	0.3
进样体积（μL）	5
毛细管温度（°C）	330
汽化器温度（°C）	350
护套气体流量（Arb）	40
辅助气体流量（套利）	20
喷雾电压（V）	3900
碰撞气体压力（mTorr）	1.5
母离子	256.1
乘积离子/碰撞能量 （eV）	208.8/16

表1:液相色谱-质谱法的洗脱程序和离子源参数。

结果

吡虫啉的检测仪器限（LOD）为5.76 × 10⁻¹⁴ g，该方法对小麦根或叶片吡虫啉的检测限为0.01 μg/kg;未观察到基质效应。吡虫啉在小麦中的回收率见 表2。吡虫啉浓度为0.5 mg/L和5 mg/L的小麦根系吡虫啉回收率分别为94.0%—97.6%和98.8%—99.2%;变异系数分别为1.92%和0.20%。吡虫啉浓度为0.5 mg/L和5 mg/L的小麦叶片吡虫啉回收率分别为88.2%-91.4%和92.5%-93.4%;变异系数分别为1.85%和0.53%。

小麦根叶中吡虫啉浓度见 表3。小麦根系和叶片均检测到吡虫啉，根部含量高于叶片。吡虫啉含量随着暴露时间的延长而增加。暴露3 d后，小麦根叶吡虫啉的含量分别为4.55 mg/kg±1.45 mg/kg和1.30 mg/kg，0.5 mg/L处理组分别为0.08 mg/kg±5 mg/L处理组分别为42.5 mg/kg±0.62 mg/kg和8.71 mg/kg±0.14 mg/kg。小麦根系暴露于吡虫啉1 d时，小麦植株根叶...

讨论

近年来，农药吡虫啉残留的预处理和检测方法经常被报道。Badawy等人²³使用高效液相色谱法测定了在温室条件下生长的番茄果实中吡虫啉的含量，并报告吡虫啉的线性良好，范围为0.0125-0.15μg/mL。Zhai等²⁴使用LC-MS-MS研究了中国细香葱中吡虫啉的残留。本研究采用QuEChERS方法从小麦根叶中提取吡虫啉。作为一种快速有效的方法，QuEChERS方法非常适合并广泛用于从土壤²⁵和植物²⁰，²⁶（如辣椒，番茄^，卷心菜和小麦）样品中提取吡虫啉。本研究的目的是确定吡虫啉的回收率是否一致并符合测定要求。吡虫啉在小麦中的回收率和变异系数符合残留测定要求，表明该方法可用于小麦吡虫啉的提取。本研究采用LC-MS-MS测定吡虫啉含量，吡虫啉的仪器检出限满足农药残留定量分析的要求。然而，当样品中的含量低于0.01μg/kg时，该方法可能无法检测到任何吡虫啉。在这种情况下，应浓缩样品，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙腈	Sigma-Aldrich （Shanghai） Trading Co.， Ltd.	1995 年 1 月 6	日 适用于 HPLC，梯度级，>99.9%
分析天平	Sartorius Lab Instruments Co.Ltd.	GL124-1SCN
人工气候培养箱	上海巴典仪器设备有限公司	HK320
离心机	Eppendorf China Co. Ltd.	Centrifuge5804
一次性使用注射器	Sigma-Aldrich （Shanghai） Trading Co.， Ltd.	Z116866	容量 5 mL，刻度 0.2 mL，非无菌
甲酸	Sigma-Aldrich （Shanghai） Trading Co. Ltd.	Y0001970	欧洲药典参考标准
石墨化炭黑 （GCB）	Sigma-Aldrich （Shanghai） Trading Co.， Ltd.	V900058	45 μm
H2O2	Sigma-Aldrich （Shanghai） Trading Co.Ltd.	31642	30% （w/w）
Hoagland's 基础盐混合物	Shanghai Yu Bo Biotech Co.， Ltd.	NS1011	无水、试剂级
水培设备	江苏荣成农业科技开发 Co.Ltd.
Hypersil BDS C18 色谱柱	Thermo Fisher Scientific （China） Co.， Ltd.	28103-102130
吡虫啉	Sigma-Aldrich （Shanghai） Trading Co.， Ltd.	Y0002028	欧洲药典参考标准
物 MgSO4	Sigma-Aldrich （Shanghai） Trading Co.， Ltd.	208094	无水，试剂级，>97%
NaCl	Sigma-Aldrich（上海）贸易 Co.Ltd。	S9888	试剂级，99%
pH计	上海雷磁仪器厂	PHSJ-3F
光控箱	哈尔滨东联电子科技有限公司	HPG-280B
移液器	Eppendorf China Co. Ltd.	研究加
针式过滤器	Sigma-Aldrich （Shanghai） Trading Co.Ltd。	SLGV033N	尼龙，0.22 和微型;m 孔径，33 mm，非无菌
超高效液相色谱串联三重四极杆质谱	Thermo Fisher Scientific （China） Co. Ltd.	UltiMate 3000
		TSQ Quantum Access MAX
涡旋混合器	上海烨拓科技有限公司	Vortex-2
小麦种子	鹿科种		集麦20