过继性转移经IL-33刺激的巨噬细胞至博来霉素诱导的小鼠模型以研究其对体内特发性肺纤维化的影响 In Vivo

摘要

本方案描述了在小鼠模型中通过IL-33刺激肺泡后，分离肺间质巨噬细胞（IMs）并进行过继性转移的方法，该方法可促进对肺部免疫反应的研究 体内 特发性肺纤维化（IPF）的研究

摘要

早期肺损伤引发的炎症反应是特发性肺纤维化（IPF）发展的重要原因之一，其特征是巨噬细胞和中性粒细胞等炎症细胞的活化，以及TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的释放。已知在IL-33刺激下，肺间质巨噬细胞（IMs）活化所引起的早期炎症在IPF的病理过程中发挥关键作用。本实验方案描述了将经IL-33刺激的IMs过继转移至小鼠肺部以研究IPF发展的方法。该方法包括从小鼠肺组织中分离并培养原代IMs，随后将经刺激的IMs过继转移至博来霉素（BLM）诱导的IPF受体小鼠肺泡中（这些小鼠此前已通过氯膦酸盐脂质体处理清除肺泡巨噬细胞），并对这些小鼠进行病理学评估。代表性结果表明，过继转移IL-33刺激的巨噬细胞可加重小鼠肺纤维化，提示建立巨噬细胞过继转移实验是研究IPF病理机制的良好技术手段。

引言

特发性肺纤维化（IPF）是一种由多种因素引起的弥漫性肺部炎症性疾病¹在Th1和Th2免疫反应的细胞因子微环境中，巨噬细胞可被极化为经典活化的巨噬细胞（M1）和替代性活化的巨噬细胞（M2）。脂多糖（LPS）或细胞因子IFN-γ可诱导M1巨噬细胞极化，并产生促炎性细胞因子，包括iNOS、IL-1、IL-6、TNF-α和IL-12。相反，II型细胞因子IL-4和IL-13可驱动M2巨噬细胞的极化，后者可分泌多种促进成纤维细胞生长的因子，如TGF-β和PDGF，从而促进肺纤维化。²特发性肺纤维化（IPF）的病理过程伴随巨噬细胞的活化与浸润。IPF通过释放细胞因子介导损伤修复、炎症反应及纤维化过程。³由于目前可用的治疗选择有限，探究特发性肺纤维化（IPF）的分子病理机制对于开发新的IPF防治策略具有重要意义。我们课题组及其它研究者的前期研究^4,5 已证实特发性肺纤维化（IPF）患者及博来霉素（BLM）诱导的IPF小鼠模型中IL-33的释放增加。在纤维化过程中，上皮细胞和内皮细胞释放IL-33，进而参与巨噬细胞的活化，导致成纤维细胞异常增殖、白细胞浸润以及最终肺功能的丧失。⁵本方案描述了将白细胞介素-33（IL-33）刺激的肺间质巨噬细胞（IMs）过继转移至肺泡，以研究小鼠模型中特发性肺纤维化（IPF）发展的方法。在此，IMs 从宿主小鼠的肺组织中分离，进行体外培养 体外，用IL-33刺激24小时后，通过气管注射过继转移至受体小鼠的肺泡中。直接采集经刺激的小鼠巨噬细胞并将其过继转移至受体肺泡，可加重肺纤维化程度，相较于以往研究，更能清晰地阐明刺激因子对纤维化的影响⁶本文所述技术可使研究人员探索潜在细胞因子刺激的巨噬细胞在特发性肺纤维化（IPF）发展过程中的功能。

方案

所有实验均按照《实验动物护理和使用指南》进行。所有动物实验均经江南大学实验动物福利伦理委员会批准（JN 编号：20211¹³⁰m1720615[501]）。

注意：本研究共使用了10只6至8周龄、体重20至25克的雄性C57BL/6小鼠。研究中的三个实验组每组包括三只受体小鼠，另有一只宿主小鼠用于IM分离。

1. 小鼠肺巨噬细胞的耗竭

1. 提前30分钟从冰箱中取出阿仑膦酸盐脂质体小瓶（参见材料表），使其恢复至室温，并反复倒置数次以确保均匀混合。
   注：阿仑膦酸盐脂质体包裹着亲水性的二氯亚甲基双膦酸分子。当巨噬细胞吞噬这些脂质体后，溶酶体磷酸酶作用下逐渐释放出阿仑膦酸，其在细胞内积累从而诱导细胞凋亡，导致巨噬细胞耗竭⁷。
2. 使用3%异氟烷对小鼠进行麻醉。通过轻捏一只脚检查其痛觉反射以评估麻醉深度。在双眼涂抹兽用眼膏，防止麻醉期间角膜干燥。
3. 用移液器安装无菌吸头吸取60 µL阿仑膦酸盐脂质体，逐滴给予至麻醉小鼠的鼻腔内，使小鼠吸气时将药液吸入气管。每滴给药后，需确认小鼠已完全吸入药物且呼吸节律平稳。以仅含PBS的脂质体作为对照组进行相同操作⁸（图2）。
4. 将小鼠置于38 °C恒温台上复温，以加快苏醒。持续监测小鼠直至其清醒。待小鼠恢复良好并能维持胸卧位后，将其转移回饲养笼中。
5. 在给予阿仑膦酸盐脂质体处理2天后，选用肺泡巨噬细胞已耗竭的小鼠作为细胞转输实验的受体小鼠。
   ​注：本研究中，通过检测巨噬细胞标志物的表达情况来确认肺泡巨噬细胞的耗竭，方法如前所述^8,9，即通过吸入途径给予阿仑膦酸盐脂质体后进行分析（参见补充图1）。

2. IMs 的分离与培养

1. 麻醉宿主小鼠 通过腹腔注射氯胺酮（120 mg/kg）和赛拉嗪（16 mg/kg）进行麻醉。通过脚趾夹捏反射消失确认麻醉深度。在两只眼睛上涂抹兽用眼膏，以防止麻醉期间角膜干燥。随后，用75%酒精和碘液对麻醉小鼠的皮肤进行消毒。使用剪刀剪开皮肤，暴露心肺组织。
2. 用带有20 G针头的注射器吸取10 mL 1x PBS，将针头插入小鼠右心房图3A用手术剪剪开小鼠下腔静脉，然后以恒定速度（10–20 mL/min）手动灌注 PBS，直至肺组织变白。切除肺组织并转移至含有冰冻 PBS 的培养皿中图3B).
3. 将肺组织切成约 2 mm × 2 mm × 2 mm 的小块。然后向肺组织中加入 15 mL 含 1% 胶原酶 A 的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），以分离巨噬细胞。在 37 °C 摇床中以 100 rpm 振荡孵育 30 分钟。
4. 用10 mL注射器反复抽吸肺组织悬液至少20次，使其尽可能均匀细腻。将该悬液通过40 µm细胞筛过滤。将滤液在400 x g条件下离心 g 10 分钟后弃去上清液。
5. 通过加入3 mL红细胞裂解缓冲液（见下文）裂解沉淀中的红细胞 材料表在冰上放置 2-3 分钟。
6. 离心后，150 x g 5分钟后，用10 mL DMEM（含100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素）重悬细胞沉淀。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
7. 将细胞以每10 cm贴壁细胞培养皿2 x 10⁶个的密度接种⁷ 细胞/皿，在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 1 小时₂这使得肺部固有免疫细胞能够黏附于培养皿上⁵孵育1小时后，吸除上清液及悬浮细胞，加入10 mL新鲜完全培养基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM）。继续培养8小时以上或过夜。
8. 使用流式细胞术检测所获得的IMs纯度，通过F4/80和CD11c标记物进行染色，具体步骤如前所述⁵ （参见 补充图1).

3. 将肺泡巨噬细胞过继转移至肺泡

1. 将含有分离的肺部IMs的培养板（步骤2.7）中的培养基更换为含有10 ng/mL IL-33的完全培养基，以刺激IMs。于37 °C、5% CO₂条件下孵育24 h。₂使用1x PBS代替IL-33作为对照。
2. 用1 mL 0.25%胰蛋白酶处理肺部间质巨噬细胞5分钟以进行解离。随后加入3 mL新鲜完全培养基终止消化，并将细胞悬液在150 x g条件下离心以收集肺部巨噬细胞。 g 4 °C 下孵育 5 分钟。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞重悬于 PBS 中，调整终浓度为 5 × 10⁵ 细胞/50 µL
3. 用3%异氟烷气体麻醉受体小鼠。待小鼠失去意识（同步骤1.2），用医用胶带将麻醉小鼠的四肢固定在垂直板上。用棉签轻轻将小鼠舌头偏向一侧。
4. 打开插管灯，将其光线照射在小鼠喉部，以便观察气管。检查气管是否靠近舌根部，食管是否位于颈部后方，但在操作过程中不应看到食管开口。
5. 使用插管灯（22 G）辅助小鼠插管。在导丝（直径0.4 mm）引导下，将留置针导管插入气管。拔出导丝，推进导管进入小鼠气管，完成插管。
6. 当观察到套管进入气管后，注入50 µL细胞悬液（含5 x 10⁵ 通过气管将IMs注入受体小鼠。
7. 将小鼠置于38°C恒温加热垫上进行复温，以加快恢复速度。持续监测小鼠直至其苏醒。待小鼠恢复良好并达到胸卧位后，将其转移至笼中。
8. 24小时后，给予博来霉素（BLM） 通过 气管（采用3.3-3.5步骤中的操作），剂量为1.4 U/kg体重，以诱导特发性肺纤维化（IPF）。对照组给予等体积的生理盐水。
9. 21天后，通过评估纤维化标志物的表达水平和Ashcroft评分，确定经PBS或IL-33刺激的IM悬液过继转移的不同小鼠组肺纤维化的严重程度¹⁰.
   1. 使用RNA提取试剂从肺组织中提取总RNA（参见 材料表).
      注意：定量分析使用微孔板读数仪进行。若OD260/OD280比值为1.8–2.0，则RNA纯度较高。所有样品均于−80 °C保存。
   2. 采用特异性引物通过荧光定量PCR检测α-平滑肌肌动蛋白（SMA）和纤连蛋白的表达水平。
      ​注意：α-SMA 的引物为上游 5'- GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3' 和下游 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3'，纤维连接蛋白（fibronectin）的引物为上游 5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAATGG-3' 和下游 5'-CACTGAAGCAGGTTTCCTCGGTTGT-3'。
10. 按如下所述进行免疫组织化学实验。
    1. 脱水左肺，包埋后用石蜡切片机切成4 µm厚的切片。
    2. 将组织切片置于载玻片上，于65–70 °C烘箱中烘烤30分钟至1小时。用梯度递减的酒精（即100%、95%、90%、80%和70%酒精）对载玻片进行脱蜡，每步5分钟。
    3. 将切片置于苏木精染液（分析纯）中染色5分钟，随后用自来水冲洗切片。将切片浸入1%盐酸酒精溶液中3秒，洗去浮色，再置于流动水中浸泡5分钟，切片将变为蓝色。
    4. 将切片浸入伊红溶液中染色10秒至1分钟（根据染色程度确定时间），用自来水冲洗，依次置于70%、80%、95%、100%和100%酒精中，每级5分钟。随后将切片分别置于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ溶液中各3分钟。干燥后，用中性树胶封片，于体视显微镜下观察并拍照。
    5. 对切片进行Ashcroft评分以评估肺纤维化的严重程度¹⁰使用独立样本t检验对数据进行统计分析。

结果

本实验所用方案总结于图1所示的流程图中。通过鼻腔吸入氯膦酸盐脂质体（图2）清除成年C57BL/6小鼠的肺泡巨噬细胞，从而构建出良好的受体小鼠模型。从另一只未经处理的小鼠（供体小鼠）中分离肺驻留巨噬细胞（图3A、B），并在体外进行培养。体外分离的巨噬细胞用IL-33刺激24小时后，经气管注入受体小鼠体内（图3C），未受刺激的巨噬细胞作为对照组。24小时后，向受体小鼠给予博来霉素（BLM）以建立肺纤维化模型。在给予BLM后21天，比较经IL-33刺激或未刺激的巨噬细胞过继转移后肺纤维化的程度。肺组织病理切片的苏木精-伊红（H&E）染色显示，给予BLM后出现典型的纤维化病理改变：小鼠肺组织结构遭到破坏，成纤维细胞聚集，正常肺泡消失或减少。过继转移经IL-33刺激的巨噬细胞加重了BLM处理小鼠的肺组织破坏程度，并增加了成纤维细胞的聚集（

讨论

本研究提供了一种有效的方法，用于耗竭、分离、培养和转移巨噬细胞，有助于研究小鼠肺纤维化的机制。小鼠巨噬细胞耗竭的方法有多种，例如气管给药、尾静脉注射和鼻腔吸入¹¹。本研究优化了鼻腔吸入法，该方法操作简便，可有效耗竭肺部巨噬细胞^8,9。在体外培养中，将IMs经IL-33刺激24小时后，通过无创气管给药途径将IMs过继转移至受体小鼠肺部，该方法对小鼠造成的创伤最小。插管过程中，采用持续时间超过>20分钟的麻醉，以确保插管顺利进行，显著提高了小鼠的存活率。初次气管给予50 µL IM悬液时，需使用微量移液器以保证给药准确性。气管给药后，应立即使用1 mL注射器向肺内注入500 µL空气，以确保导管内的细胞悬液完全进入肺组织。尽管该方法可清除肺泡巨噬细胞，但在疾病发展过程中，小鼠其他部位的巨噬细胞也可能迁移至肺泡，从而稀释所转移细胞在肺泡中的比例。因此，对于细胞转移比例要求严格的实验，需进一步探索其他方法。

肺巨噬细胞...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Life technologies Biotechnology，美国	1508012
动脉留置针	B Braun Melsingen AG，德国	21G15G8393
BD Accuri C6 Plus	Becton Dickinson，美国
博来霉素	Biotang，美国	Ab9465
二氧化碳培养箱	Thermo Forma，美国	Thermo Forma370
CD11b	R&D Systems，美国	1124F
CD11c	R&D Systems，美国	N418
细胞培养皿	Thermo Forma，美国	174926
氯膦酸盐脂质体	Clodronate liposomes，荷兰	CI-150-150
胶原酶A	Sigma-Aldrich，美国	10103578001
F4/80	R&D Systems，美国	521204
Falcon细胞筛	Becton, Dickinson and Company，美国	352340
胎牛血清（FBS）	Life technologies，美国	1047571
苏木精-伊红	南京建成科技，中国	06-570
LightCycler 480 PCR检测系统	Roche，美国
小鼠重组因子IL-33	Peprotech，美国	210-33
尼康显微镜	尼康公司，日本	941185
青霉素、链霉素	Life technologies，美国	877113
磷酸盐缓冲液（PBS）	广东环凯微生物科技，中国	1535882
RBC裂解液	碧云天生物技术公司，中国	C3702
RNA Isolater	诺唯赞公司，中国	R401-01-AA	总RNA提取试剂
RWD吸入式麻醉机	深圳瑞沃德生命科技，中国	R500
半自动石蜡切片机	Leica，德国	LeicaRM2245
SYBR Premix Ex Taq	Takara，日本	410800
0.25%胰蛋白酶	Life Technologies，美国	1627172