高质量年轮样芯采集的进阶工作流程——新技术与新设备

摘要

本文介绍了一种通过使用带扭矩倍增器的无线电钻来避免在树木钻取增量芯时产生微裂纹的实验方案，以减少取芯过程中的问题，并阐述其对制备长微切片的影响。本方案还包括在野外 sharpen corers 的操作步骤。

摘要

在树木生态学研究中，对每一个生长轮进行精确定年是所有研究的基本要求，无论研究仅关注年轮宽度变化、化学或同位素分析，还是木材解剖学研究。无论特定研究的采样策略如何（例如气候学、地貌学），样本的采集方式对于后续的制备与分析成功至关重要。

直到最近，使用一个（或多或少）锋利的生长锥获取可用于砂磨以进行后续分析的钻芯样本就已足够。由于木材解剖学特征可应用于长时间序列研究，获取高质量生长锥钻芯的需求因而具有了新的意义。从根本上说，生长锥在使用时必须保持锋利（或及时 sharpen）。当手工对树木进行钻芯时，操作生长锥会遇到一些问题，导致钻芯全长范围内隐性产生微裂纹：手工开始钻取时，钻头会用力压向树皮和最外层年轮，直至螺纹完全进入树干。同时，钻头还会进行上下以及侧向移动。随后，生长锥被持续钻入树干，但每旋转一圈都需要停下，重新调整握持姿势后再继续旋转。所有这些动作，以及钻芯过程中的启停操作，都会对钻芯施加机械应力。由此产生的微裂纹使得无法制备连续的显微切片，因为样本会沿着这些裂纹完全碎裂。

我们提出了一种通过使用无线电钻的新技术来克服这些障碍的方案，该方法可在对树木进行钻芯时最大限度地减少相关问题，并改善长微切片的制备效果。本方案包括长微切片的制备步骤，以及在野外现场 sharpen 钻头的操作流程。

引言

树木年代学研究基于树木生长轮的各种特征，包括年轮及其他类型的生长轮。"前导性"学科树木年代学最初以年轮宽度的变化作为参数，用于简单地确定年轮的年代，从而建立长期的年代序列。因此，目前还广泛采用多种其他特征，如密度变化、同位素浓度或木材解剖学特征，将单个年轮或其结构与内容同环境参数进行关联，以更深入地理解环境条件随时间对树木生长的影响。

树木年代学以及树木气候学在环境研究中的重要性日益增加，主要用于重建过去的气候条件^1,2,3。为此，需要对大量树木的年轮进行详细分析。尽管目前已有一些技术可用于测定树木年轮的宽度和密度（例如，利用声波技术⁴或钻孔阻力法^5,6），但迄今为止，尚无可靠的"非破坏性"方法可从活立木中提取年轮特征。若需对树木内部的年轮特征进行非常详细的分析，或估算基面积增量，最佳方法是从目标树木上截取圆盘样本⁷。然而，这意味着必须砍伐所有需要分析的潜在目标树木。考虑到全球每年分析的树木数量极为庞大，这种取样策略并不可行。除了浪费大量资源外，该方法的成本也过于高昂。因此，生长锥取样已被确立为树木年轮研究中的标准取样技术⁸。使用生长锥可以从树干中微创地提取木材芯样，取样路径从树皮开始，理想情况下可直达树心⁹。

尽管钻取树芯会对树干造成损伤——形成一个直径约1 cm的孔洞——但树木能够通过在树芯孔洞周围增强木材形成来闭合该伤口。除孔洞本身外，另一个缺点是会出现“"隔离区"，即孔洞周围区域的细胞被酚类物质填充，以防止真菌从孔洞处扩散^10,11。据我们所知，目前仍无证据表明生长锥取样会导致树木腐朽频率显著增加，至少在未受干扰的高海拔林分中的Picea abies¹²以及温带森林中的多种硬木树种中是如此¹³。

尽管这一采样标准已在全世界应用数十年，但仍存在一些问题。其中之一是，采样必须完全依靠手工操作，无法借助任何机械辅助，这不仅耗时，而且持续作业后会使人相当疲劳。为了减轻采样负担，人们已尝试过若干（不同程度上可行的）策略，例如使用安装了钻芯装置而非链条的链锯^14,15,16,17。相较于电钻，链锯更受青睐，因为电钻动力不足；然而，由于链锯本身重量大且需要燃料，这一方案并未得到推广。

近年来，木材解剖学技术取得了显著发展，并已整合到树木年轮生态学研究中^18,19。然而，通过从树木年轮样芯切取微小切片以长期分析木材解剖参数的方法，却带来了意想不到的问题。通常情况下，从样芯上获取的微小切片会碎裂成许多小块，导致无法获得连续完整的切片（图1）。该问题源于人工钻取样芯的技术以及钻头不够锋利。在钻取过程中，木材受到机械应力作用，导致样芯内部产生微裂纹。这些微裂纹在对年轮样芯进行宏观检查时难以被发现，因此长期以来未被视为问题。

人工钻取树芯时，需将手柄安装在取芯器的后端，将带螺纹的尖端压在树干上，然后开始旋转手柄，直至取芯器穿透树干直径的一半以上。在此过程中，取芯器的尖端（显然）固定在树干中，但由手柄带动的取芯器后端始终会左右或上下晃动，至少在钻头完全旋入树干前都会如此；钻头完全进入后才能为取芯器提供更多的导向性和稳定性。由于施加的高压力以及取芯器的运动，最外层约5 cm的年轮样品经常发生形变（图1）。即使旋转时的摩擦力已降至最低，另一种过程仍会对取芯器内部的年轮样品施加应力。人工钻取无法使取芯器的切削刃在树干内连续运动。每次最多旋转一圈，就必须停顿以调整握持姿势，然后继续钻取。每次重新开始旋转时，样品都会轻微扭转，直到克服摩擦力后钻头才能再次转动。这些机械应力可能导致样品结构内部产生微观裂纹。

当取芯器的切割刃不够锋利时，这种机械应力甚至会进一步增加。取芯器钝化的明显标志是所取得的芯样表面不平整，在整个延伸范围内出现大量裂纹²⁰（图2）。取芯器的磨削频率取决于需要取芯树木的密度以及树皮中所含的矿物质或沙粒情况。通常情况下，不应认为新的取芯器就是锋利的。迄今为止，由于操作困难，取芯器的磨削几乎从不在野外进行，因为该操作必须手工完成，且需要丰富的经验^11,20。

综上所述，人工钻取以及刃口钝化的切割工具均会导致所获取的样本芯中出现微裂纹。迄今为止，这些问题尚未得到系统性分析，也未有人尝试提出解决方案。本文提出了一种克服上述障碍的实验方案，通过将传统人工钻芯技术与一种新技术的应用进行比较，推荐使用配备专用适配器的无绳电钻连接生长锥进行操作。本文阐述了在树木钻芯过程中，上述问题在多大程度上得以减轻，以及连续机械化钻芯对制备长段显微切片的影响。该方案包括使用水溶性胶带作为支撑辅助材料制备长段显微切片的方法，以及在野外 sharpen 生长锥的操作流程。

方案

1. 手动取芯

1. 组装增量取样器，并根据研究问题选择树干上的取样位置（例如，用于地貌重建时，沿机械应力方向平行取样；用于确定年龄时，尽可能靠近基部取样）。
   注意：每次取样应从同一树干获取两个样本，最好在相对的方向上进行。
2. 选定取样位置后，将取样器垂直于树干生长方向放置。
3. 在取样器后端放置推杆，以在钻取过程中保持稳定。
4. 保持稳定姿势，身体前倾，通过推杆向切割刃施加压力。
5. 双手转动取样器手柄，直至钻头螺纹部分完全旋入树干。
6. 释放压力，取下推杆。
7. 继续双手转动取样器手柄，直到取样器到达或穿透髓心。可通过将取出器（长度与取样器相同）紧贴树干旁的手柄处进行比对，以确认钻入深度。
8. 手持取出器，使其开口朝上，完全插入取样器内。将取样器反向旋转（一整圈），使样本与树干分离。然后将取出器连同样本从取样器中拉出。
9. 将样本从取出器中取出，并放入纸质吸管中保存。
10. 将取样器从树干中取出，并放回手柄中存放。

2. 使用无绳电钻进行钻孔

1. 使用配备扭矩增强器的无绳电钻，并安装由WSL开发的树芯钻取仪专用转接头。
2. 将树芯钻取仪插入扭矩增强器的转接头中，根据研究任务选择树干上的钻取位置（参见步骤1.1）。
3. 选定钻取位置后，将钻取仪垂直于树干生长方向放置。
4. 保持稳定姿势，紧握无绳电钻，并对切削刃施加压力。
5. 启动无绳电钻，缓慢旋转，直至钻头螺纹部分完全进入树干，随后提高转速，直至钻取仪到达或穿透髓心。
   注意：深度可按步骤1.7所述方法进行检查。
6. 从钻取仪上取下无绳电钻，装上手柄，并按步骤1.8所述方法使用取出器将树芯取出。
7. 将树芯样品存放在纸质吸管中。
8. 取下手柄，将无绳电钻重新安装到钻取仪上，将钻取仪从树干中退出。

3. 锐化增量钻的切削刃

1. 使用 WSL 磨削支撑装置
   1. 取新设计的夹具并将其放置在地面上。
   2. 将无绳电钻（包括增量取芯器）放置在指定的支撑点上，并闭合安装支架以固定无绳电钻。
   3. 通过在启动按钮上固定聚四氟乙烯块来启动无绳电钻，使其运转。取锥形磨石，用其研磨切削刃的内表面。
      注意：接触角度取决于切削刃内侧的形状。磨石应与内侧壁完全接触，从切削刃一直延伸至取芯器内部扩大部分。
   4. 取矩形磨石，研磨切削刃的外表面以去除毛刺。
      注意：此步骤旨在去除因从内侧研磨而产生的边缘毛刺，并最终完成刃口的 sharpening。
   5. 从启动按钮上取下聚四氟乙烯块以停止电钻运转，打开安装支架释放无绳电钻，并将设备从夹具中取出。
2. 检查切削刃的锋利程度
   1. 从无绳电钻的适配器上卸下增量取芯器。
   2. 将一张纸放在磨削支撑装置的木板上。
   3. 将取芯器的切削刃置于纸上，同时保持取芯器垂直。
   4. 在保持取芯器垂直的同时旋转它，不对取芯器施加额外压力——仅依靠取芯器自身的重量压在纸上。
   5. 提起取芯器，检查是否有一圆形纸片留在取芯器切削刃内部。如果是，则说明取芯器已足够锋利；如果不是，则重复磨削步骤（步骤 3.1）。如果取出的芯样外表面不光滑，则需重复整个流程（步骤 3.1 和 3.2）。

5. 使用水溶性胶带切割完整年轮样本的微小切片

1. 将一块长玻璃载玻片放在切片机旁边，并沿载玻片全长在其中央加入一些水。
2. 将岩心样品放入岩心切片机的样品 holder 中。
   注意：为了获得真正的横截面切片，请确保纤维方向保持垂直。
3. 抬起样品 holder，直到岩心几乎接触到刀片边缘。将刀片拉过岩心，切去顶部。
4. 再次将刀片置于岩心起始端，将样品抬升约 10 µm，并重复切割操作，直至获得宽度至少为 2 mm 的平整表面。
5. 用刷子在切割面上涂抹淀粉溶液²¹。
6. 使用一块布从岩心顶部去除多余的溶液。
7. 裁剪一段与岩心等长的水溶性胶带；将胶带一端对准岩心起始端，重叠约 1 cm，且岩心起始端朝向切片机刀片方向。
8. 用手指轻擦胶带表面，将其牢固粘附在岩心表面。
9. 将切片机中的样品抬升 15–20 µm，轻轻掀起胶带的重叠部分，并将切片机刀片置于岩心边缘。
10. 在握住胶带末端的同时进行切片。
11. 取下带有薄片的胶带，将切面朝下放置于第 5.1 步准备好的玻璃载玻片的水线上。
12. 约 10 秒后，用镊子夹住胶带一侧并缓缓上提，开始移除胶带，注意确保切片保留在玻璃载玻片上。
13. 如需制作该切片的永久装片，请遵循标准操作流程²²。

结果

与手动钻取法相比，使用无绳电钻的优势显而易见。我们对胸径为60–80 cm的云杉（Picea abies (L.) H. Karst.）进行了钻取比较。所有钻取样本均使用直径5 mm、长度40 cm的钻取器，并将钻取器完全插入树干。手动钻取时，完成一次取芯并从树干中拔出钻取器的整个过程平均耗时约6分钟。而使用配备扭矩增强器的无绳电钻重复该操作时，整个过程平均仅需1分钟。除了使用无绳电钻钻取完全不会造成操作者疲劳外，由于在钻取初期钻头切削刃受到的压力较小，直至螺纹完全进入树干，因此所有样本均未发生变形。一旦螺纹进入树干，钻取器便基本实现稳定，上下移动的可能性被降至最低（图3）。

当第一个钻头外表面不再光滑，而是出现划痕和裂纹时（如图2所示），就需要对切削刃进行修磨。由于无线电钻可以固定使用（即连同适配器和生长锥一起安装，如图4所示），因此修磨过程也非常快速。稍加练习后，修磨时间不超过5分钟。一旦切割后的纸张能够顺利卡入生长锥内，即可继续取样。所获得的钻取样品表面光滑，无任何划痕或裂纹。借助无线电钻获取的钻芯出现微裂纹的概率较低，这是制备完整生长轮钻芯显微切片的前提条件。使用水溶性胶带（如图5所示）使长而脆弱的切片操作更加便捷，因为该胶带可在将薄片从刀片上取下并转移至载玻片的过程中防止其撕裂。该方法不仅节省了实验室操作时间，还提高了显微切片的质量，因为在切片过程中，胶带的粘合剂除了与非牛顿流体（玉米淀粉溶液；参见实验方案第5.5步）共同作用外，还能稳定细胞壁结构。

图1：生长锥。（A）用于手动钻取的生长锥，以及螺纹和切削刃的放大视图。（B）由于手动钻取初期对木材施加了过高的压力，导致钻芯发生变形。（C）因微裂纹而碎裂的钻芯部分的显微切片。比例尺 = 0.5 cm。（D–F）使用无绳电钻进行钻取操作的步骤照片。开始钻取时无需施加高压力（D,E），可轻松利用手柄取出钻芯（F），随后直接拔出电钻（G）。请点击此处查看该图的高清版本。

图 2：增量岩心显示由于使用钝刃取芯器导致外表面出现划痕和裂纹。比例尺 = 0.5 cm。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 3：增量钻取芯及相关的显微切片。（A）使用锋利的取芯器和无绳电钻获取的直线型钻芯。（B）使用钝的取芯器手动采集导致变形的钻芯。（C）使用锋利的取芯器采集的Pinus sylvestris钻芯的连续切片。（D）由于使用钝的取芯器，导致Larix decidua钻芯断裂成碎片的切片。比例尺 = 0.5 cm（A, B）；1 cm（C）。请点击此处查看该图的高清版本。

图4：用于修磨增量取芯器刃口的夹具设计。（A）用于引导和稳定增量取芯器的聚四氟乙烯块。（B）用于固定无绳电钻启动器的聚四氟乙烯块。（C）六角扳手，用于根据所用取芯器类型将部件A固定在板上的其他位置。（D）用于固定无绳电钻的夹具。（E）将圆锥形磨石置于刃口内部进行研磨。（F）将直形磨石置于外部以去除刃口毛刺。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：水溶性胶带的应用。（A）将胶带裁剪至足以覆盖岩心表面的长度。（B）将胶带贴在已准备好的岩心表面。（C）用手固定胶带边缘，切割样品。（D）将带有样品的一面朝下放置在载玻片上，并加水使胶带与样品分离。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：显示“蓝环”的针叶树显微切片。 1974年年轮的晚材细胞壁未发生木质化，因此呈现蓝色（上方放大图显示的是长切面）。比例尺 = 1 cm。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

树木年轮生态学研究中显著加强了木材解剖学的融入^23,24, 以及树木年轮研究专家与木材解剖学家之间日益加强的交流²⁵，开辟了对过去环境条件进行广泛而深入分析的新领域。这些新研究开拓了新的可能性并提出了新的问题，但同时也引发了一些新的挑战。

这个新时代的快速发展 "树轮解剖学" 需要大量的样本，而使用无线电钻进行取样（如前所述）可充分支持这一需求。除了用电钻钻取树芯完全不会造成体力消耗外，还能节省大量时间。尽管本文展示的结果仅针对单个树芯的取样速度测试，表明其取样效率比人工钻芯快六倍，但在常规取样过程中（一人钻取树芯，另一人负责编码和保存树芯），我们曾在1.5小时内完成对24棵云杉（每棵取两条完整长度的树芯）的钻芯作业，这些树木的茎干直径约为80 cm。这相当于平均每 <一个样本芯的处理耗时2分钟，包括储存、包装及移至下一棵树。

整个操作过程的快速处理得益于新设计的增量取芯器适配器，该适配器无需使用螺丝或其他类似的固定装置即可将取芯器固定在适配器内。因此，将钻头更换为取芯手柄以折断并提取岩芯的操作快速且简便。适配器的设计允许在钻入过程中即使遇到茎干腐烂的情况，也能直接将取芯器拉出；或者在某些增量取芯器常见的状况下，当反向旋转时螺纹无法咬合导致取芯器无法退出时，同样可轻松取出。

然而需要注意的是，在将取芯器从茎干中取出时，应稍微倾斜适配器，以便能够顺利拔出，同时防止电钻滑脱（实验方案步骤 2.8）。随着树木年轮研究对基于解剖学代用指标建立长期年表的需求不断增加^19,26，需要对生长锥获取的增量芯进行显微切片制备，这些芯样可在制备前被截成若干段，或整体制成显微切片²²。尽管长达 40 cm 的显微切片质量尚不能始终与短切片相媲美（例如，细胞在纵向延伸方向上的角度变化常会影响细胞壁测量），但其仍可用于识别和定年特定的生长响应，如反应木或蓝环的出现²⁷（图 6）。

因此，样品质量是成功制备和进一步分析解剖结构的基本前提。这一要求使得在采取增量钻芯时，必须更加谨慎地关注采样工作的精确性。如果未预先对样本进行包埋，制备显微切片可能会非常耗时且劳动强度大，有时甚至无法完成²⁸。

手工打磨增量取芯器的刃口需要大量实践和经验，才能在没有任何支撑的情况下手动均匀地磨削整个刃口。使用新型钻头夹具打磨增量取芯器刃口的功能，使得即使缺乏打磨经验的用户也能在野外轻松完成刃口 sharpening。这一操作现在可以快速完成，将有助于提高今后所采集样本的质量。

尽管使用新设备在岩心后续处理中表现出明显优势，但无绳电钻也可与约40年前开发并推出的小型磨削装置配合使用。²⁰. Maeglin²⁰ 介绍了对一种改造的构建细节 "古德柴尔德钻头研磨器" 由木材和金属制成²⁹如今，该设备可以毫无困难地通过3D打印机进行建模和打印。³⁰只需创建卷笔刀的详细三维模型，即可打印单个部件并在现场组装使用。改进的可能性尚未穷尽，我们相信本出版物将激励许多同行进一步开发此处介绍的工具。一个尚未解决的障碍是，需要卸下钻头并换上取芯器手柄才能提取岩芯。

完整年轮样本微切片的最后切割步骤²² 仍然是一个棘手的问题。如前所述，使用水溶性胶带可在切割组织并将其放置于载玻片上时起到稳定作用，从而辅助该过程。然而，此操作仍要求操作者具备较高的经验水平。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BS 18 LTX-3 BL QI	Metabo		无线电钻
Core-microtome	WSL		用于从生长锥钻取的样芯上切割微小切片的切片机
生长锥钻头适配器	WSL		将生长锥固定在无线电钻上的适配装置
生长锥	Haglöff		40厘米长的生长锥
Power X3	Metabo		扭矩放大器
磨削辅助底板	WSL		用于固定无线电钻，以便研磨生长锥切割刃的底板
水溶性胶带 5414，透明 3/4英寸	3M		用于支撑切割长切片的透明胶带