通过邻位连接检测法对内质网-线粒体接触位点内源性细胞器内蛋白质相互作用的可视化与定量分析

摘要

由于人们对研究膜接触位点（MCSs）及其组分的细胞结构日益关注，迫切需要开发新的研究方法。本文介绍了一种整合了已有显微镜技术的实验方案，用于鉴定并定量位于膜接触位点的细胞器内及细胞器间蛋白质复合物。

摘要

膜接触位点（MCSs）是膜结构之间紧密靠近的区域，可在不发生膜融合的情况下介导相邻细胞器之间多种生物分子（如钙离子和脂质）的动态交换与调控。MCSs 对维持细胞稳态至关重要，其功能依赖于定位于这些位点的组分，这些组分通常以多聚蛋白复合物的形式存在。MCSs 常涉及内质网（ER），即脂质合成和细胞钙储存的主要场所，对于线粒体等无法通过经典囊泡运输途径进行物质交换的细胞器尤为重要。近年来，内质网与线粒体之间的膜接触位点受到广泛关注，因其功能对细胞代谢和生物能量学具有显著影响。已有多个蛋白被发现定位于这些接触位点，包括膜锚定蛋白、钙离子通道以及脂质转移蛋白，这促使人们需要开发新的方法和技术手段来研究这些 MCS 组分。本文介绍了一种整合多种技术的实验方案，包括邻近连接实验（PLA）、线粒体染色以及三维成像分割技术，可用于检测在内质网-线粒体膜接触位点上位于同一膜结构且物理距离非常接近（>40 nm）的蛋白质。例如，我们研究了两种锚定于内质网的脂质转移蛋白 ORP5 和 ORP8，它们此前已被证明可在内质网-线粒体及内质网-质膜接触位点相互作用并定位。通过将 ORP5-ORP8 的邻近连接信号与细胞成像软件分析相结合，可估算 ORP5-ORP8 复合物与线粒体表面的距离，并确定约 50% 的 ORP5-ORP8 邻近连接信号出现在靠近线粒体的内质网亚结构区域。

引言

细胞器之间的通讯是真核细胞的一个重要特征。细胞器之间的一种通讯方式是形成膜接触位点（membrane contact sites, MCSs），即两个细胞器的膜之间紧密相对，由结构蛋白和功能蛋白（如连接蛋白、脂质转移蛋白和钙离子通道）维持其稳定¹。MCSs 可在相同或不同的细胞器之间建立，介导细胞组分的交换，在维持细胞稳态中发挥重要作用。迄今为止，已鉴定出多种 MCSs，包括内质网（ER）-线粒体、内质网-质膜（PM）以及内质网-脂滴（LD）之间的接触¹。其中，内质网与线粒体之间形成的膜接触位点（MERCSs）研究最为深入，因其参与调控多种细胞功能，如脂质和钙离子稳态²。由于线粒体基本不参与经典的囊泡运输途径，因此依赖 MERCS 及其分子组分从内质网获取关键脂质或脂质前体。这些脂质通过 MERCSs 进行非囊泡运输，有助于维持线粒体正常的脂质组成及其功能与结构的完整性³。

鉴于膜接触结构（MCSs）在多种细胞功能中的关键作用，近年来人们对深入理解其分子组分的兴趣显著增加。已有多种基于成像的方法被用于推进对MCSs的研究。其中，基于荧光探针的邻近连接实验（PLA）已被广泛用作检测细胞器间蛋白质-蛋白质相互作用（检测范围为40 nm）以反映MCSs丰度的指标，且可在内源性水平上进行检测⁴。例如，通过检测多种线粒体-内质网蛋白对之间的PLA信号，已实现对线粒体-内质网接触位点（MERCSs）的可视化与定量分析，这些蛋白对包括VDAC1-IP3R、GRP75-IP3R、CypD-IP3以及PTPIP51-VAPB^5,6,7,8。尽管该技术已被用于检测和定量存在于MCSs处的细胞器间蛋白质-蛋白质相互作用^5,7,9,10,11，但大多数研究并未将PLA与细胞器染色相结合。因此，目前尚未建立一种能够定量测量PLA相互作用信号与相关细胞器之间空间接近程度的方法。因此，迄今为止，对于内质网蛋白而言，其在与其他细胞器接触的膜亚区内的相互作用尚无法与在广泛分布的内质网网络内部发生的相互作用相区分。

本文介绍了一种检测定位于同一细胞器膜上的蛋白质之间PLA相互作用，并分析其在膜接触位点（MCS）上与对应细胞器膜之间接近程度的实验方案。该方案基于以下两个前提建立：1）既往研究表明，在过表达条件下，内质网（ER）脂质转运蛋白ORP5和ORP8可在ER-线粒体及ER-质膜（PM）的膜接触位点共定位并发生相互作用^12,13,14,15，且ORP5可定位于ER-脂滴（LD）接触位点^16,17；2）现有的技术手段，包括PLA、共聚焦显微镜、细胞器标记以及三维（3D）成像分析技术。

方案

1. 线粒体染色与邻近连接实验（PLA）

1. 将0.5 × 10⁵–2 × 10⁵个HeLa细胞接种于24孔板中的24 mm孔板内直径为13 mm的玻璃盖玻片上，细胞培养于含10% FBS、1%青霉素/链霉素和1%非必需氨基酸的DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）中，在37 °C、5% CO₂条件下培养，接种稀释比例应使实验当天细胞融合度达到75%–90%。
   注：值得注意的是，在进行线粒体染色和PLA之前，HeLa细胞可接受其他处理，例如siRNA处理和/或DNA质粒转染。
2. 线粒体染色
   1. 用预热至37 °C的无血清培养基洗涤细胞一次。在37 °C、5% CO₂条件下，用预热的无血清培养基孵育细胞10分钟。
   2. 在预热的无血清培养基中配制1 µM红色线粒体标记物。
   3. 在37 °C、5% CO₂条件下，用500 µL线粒体标记物溶液孵育细胞30分钟。在进行线粒体标记处理及后续实验步骤时，应尽可能将盖玻片上的细胞避光保护。
   4. 孵育结束后，用预热的无血清培养基洗涤1次，再用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次。此步骤应尽快完成，因为固定前长时间洗涤可能影响线粒体形态。
   5. 移除盖玻片上的1× PBS，于室温（避光）下在化学通风橱中用新配制的4%多聚甲醛（PFA，溶于1× PBS）固定细胞30分钟。用500 µL 1× PBS洗涤3次，每次2分钟（可使用一次性移液管或连接泵的真空系统）。
   6. 移除1× PBS，于室温（避光）下用500 µL 50 mM NH₄Cl孵育盖玻片15分钟。使用真空系统，用500 µL 1× PBS洗涤1次，每次2分钟。
   7. 用500 µL阻断缓冲液1（BB1，含1% BSA、0.1%皂苷的1× PBS）洗涤3次，每次2分钟，用于ORP5-ORP8 PLA；或用阻断缓冲液2（BB2，含2% BSA、0.1%正常山羊血清、0.1%皂苷的1× PBS）洗涤，用于ORP8-PTPIP51 PLA。
   8. 将盖玻片从24孔板转移至湿盒中。转移后，立即向盖玻片上加入100 µL阻断缓冲液（BB1或BB2，根据所用抗体对选择），以防止干燥。
      注：可通过将培养皿（塑料或玻璃）用铝箔包裹，并在培养皿边缘放置若干湿纸巾，快速简便地制备一个避光的湿盒。
3. 邻近连接实验（PLA）
   注：PLA实验步骤依据试剂盒说明书进行，略有修改。
   1. 一抗孵育
      1. 配制一抗工作液。将兔抗ORP5抗体（1:150稀释）与鼠抗ORP8抗体（1:200稀释）加入BB1中；将鼠抗ORP8抗体（1:200稀释）与兔抗PTPIP51抗体（1:200稀释）加入BB2中；将兔抗ORP5抗体（1:150稀释）与鼠抗PTPIP51抗体（1:200稀释）加入BB1中。每张盖玻片至少准备40 µL一抗混合液（例如：0.27 µL兔抗ORP5、0.2 µL鼠抗ORP8、39.53 µL BB1）。
      2. 使用真空系统移除上一步（1.2.8）中的BB，向每张盖玻片加入40 µL一抗溶液。在避光湿盒中室温孵育1小时。
   2. 使用真空系统，用相应BB（BB1或BB2）洗涤盖玻片3次，每次5分钟，每次100 µL。
   3. PLA探针孵育
      1. 配制PLA探针工作液。将兔PLUS探针（1:5稀释）和鼠MINUS探针（1:5稀释）加入BB中并混匀。每张盖玻片至少准备40 µL PLA探针溶液（例如：8 µL兔PLUS探针、8 µL鼠MINUS探针、24 µL BB）。探针溶液配制后，室温静置20分钟再使用。
      2. 使用真空系统移除盖玻片上的BB（来自步骤1.3.2），向每张盖玻片加入40 µL PLA探针溶液。在37 °C避光湿盒中孵育1小时。
   4. 在室温下，用100 µL 1×洗涤缓冲液A洗涤盖玻片2次，每次5分钟。
   5. 连接反应
      1. 将5×连接缓冲液用超纯水1:5稀释并混匀。每张盖玻片至少准备40 µL连接反应液（8 µL 5×连接缓冲液，31 µL超纯水）。
      2. 将连接酶（1 U/µL，试剂盒提供）按1:40比例加入上一步配制的1×连接缓冲液中，混匀。
      3. 使用真空系统移除盖玻片上的1×洗涤缓冲液A（来自步骤1.3.4），加入40 µL连接酶溶液，于37 °C避光湿盒中孵育30分钟。
   6. 使用真空系统，在室温下用100 µL 1×洗涤缓冲液A洗涤盖玻片2次，每次2分钟。
   7. 扩增反应
      1. 将5×扩增缓冲液用超纯水1:5稀释并混匀。每张盖玻片至少准备40 µL扩增反应液（8 µL 5×扩增缓冲液，31.5 µL超纯水）。
      2. 将聚合酶（10 U/µL，试剂盒提供）按1:80比例加入上一步配制的1×扩增缓冲液中，混匀。
      3. 使用真空系统移除盖玻片上的1×洗涤缓冲液A（来自步骤1.3.6），加入40 µL聚合酶溶液，于37 °C避光湿盒中孵育1小时40分钟。
   8. 移除聚合酶溶液，于避光湿盒中在室温下用100 µL 1×洗涤缓冲液B洗涤盖玻片2次，每次10分钟。
   9. 于避光湿盒中在室温下用100 µL 0.001×洗涤缓冲液B洗涤盖玻片1次，每次1分钟。
   10. 使用含DAPI的封片剂（浓度为1.6–0.4 µg/mL）将盖玻片封固于载玻片上用于显微镜观察。用指甲油封边。

2. 图像采集

1. 观察 PLA 结果，并使用配套软件和 63 倍油浸物镜通过荧光共聚焦显微镜采集图像。
2. 使用 405 nm 激光二极管或白光激光器设置荧光激发，采用 GaAsP PMT 或混合探测器收集光谱窗口。在每个焦平面（跨度为 300 nm）采集 PLA（λex = 488 nm，λem = 505–560 nm）和线粒体（λex = 543 nm，λem = 606–670 nm）的荧光信号。

3. 与线粒体相关的PLA信号点的图像处理与评估

1. 使用图像分析软件对共聚焦图像进行处理，该软件可生成细胞组分之间的距离图。按照以下步骤，利用细胞成像软件生成PLA信号点和线粒体网络的三维重建图像，并分析它们之间的距离图1).
2. 3D 距离图扩展插件的安装
   1. 安装带有XT选项的细胞分析软件包以及MATLAB软件，或仅安装可从网站免费下载的MATLAB编译器运行时（MRC）。
   2. 设置细胞分析软件，使其在启动 XTension 时开始运行 MATLAB，操作步骤如下：从选项 Imaris （Mac OS X）或 编辑 菜单（Windows），选择 偏好，更换为 自定义工具 面板，然后设置路径：
      C:\Program Files\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB.exe 用于 Windows 或/Applications/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab 适用于 Mac OS X。
3. 将图像导入软件中
   1. 将共聚焦图像序列通过 Arena 模块直接转换为 .IMS 文件，或使用独立版本软件进行转换 文件转换器 支持批量转换。
   2. 导入后，检查图像是否仍保持正确校准。单击 编辑 > 图像属性 > 图像几何学，并检查体素在X和Y方向上的尺寸是否与实际图像预期的像素大小一致（参见采集软件中的图像校准），且体素在Z方向上的尺寸是否与显微镜生成Z层栈时所用的步进距离一致。如果数值不正确，应进行修改，以确保后续步骤中距离估算的准确性。
   3. 在菜单中调整不同通道的对比度 显示调节 通过点击 编辑 > 显示调节 独立调节每个通道，以优化每种颜色的显示效果。此步骤虽不直接影响图像数值，但对于设定精确的阈值或检测微弱目标至关重要。
   4. 通过使用选项裁剪图像，将分析限定于单个细胞 编辑 > Crop 3D要分析同一视野中的另一个细胞，可再次打开同一幅图像，并进行不同的裁剪。
4. ORP5-ORP8 斑点检测
   1. 通过点击检测 ORP5 与 ORP8 相互作用位点处产生的 PLA 信号 添加新斑点 选项，该选项将创建一组新对象并打开斑点检测向导。
   2. 选择应进行斑点检测的通道。
   3. 调节 估计的 XY 直径 （若对象大小不同，需调整该范围）以帮助斑点检测算法识别目标对象。注意，若所选值过高，邻近对象会合并；若值过小，单个信号可能被识别为多个对象，或检测到异常信号。
   4. 点击 背景扣除 在进行斑点检测之前去除图像背景，以增强感兴趣对象周围的局部对比度。
   5. 通过将质量（物体中心的强度）设为阈值参数并使用软件自动阈值，或略微调整该值以检测所有目标物体，来调节斑点检测阈值。斑点检测完成后，保存检测参数，并在处理其他图像时重复使用这些参数。
5. 线粒体网络检测
   1. 检测线粒体网络以生成表面渲染图像 点击 添加新表面 创建一个新对象，并打开表面检测向导。
   2. 选择应在其上创建表面的通道。
   3. 应用高斯滤波器以获得更平滑的表面，方法是单击 平滑 复选框并通过设置阈值来指示表面上可观察到的最小细节。
   4. 执行背景减除以增强局部对比度，并辅助阈值分割步骤。
   5. 根据信号强度调整阈值以检测线粒体网络。如果难以正确设置阈值，建议返回上一步调整平滑程度和背景扣除水平。
   6. 如有必要，可在表面应用滤波器以去除阈值处理后产生的微小残留物。为此，请选择 体素数量 在“分类表面”窗口中进行筛选，调整上下阈值，仅保留目标对象。表面创建完成后，保存创建参数，并将其用于处理其他图像。
6. 线粒体周围三维距离图的生成
   1. 生成线粒体表面外的距离图，具体步骤如下。在场景树框中选择线粒体表面，然后单击 图像处理 > 表面功能 > 距离变换这将调用一个 Matlab 扩展程序，提示用户选择应在物体表面外部还是内部计算地图。
   2. 选择 外表面物体 测量PLA信号点与线粒体表面之间的距离。生成后，距离图将在显示调节面板中显示为一个新通道。在此通道中，每个像素的值对应于其到最近线粒体的距离。
7. 提取对象与最近线粒体之间的距离
   1. 为了测量每个点到最近线粒体的距离，并识别和可视化最近的线粒体，请在场景树框中选择先前生成的点。
   2. 在统计和详细日志中选择 特定值 （以获取每个点的一个测量值）。选择 中心强度 Ch=X （其中 X 对应距离图通道的编号）。这将测量每个点中心在距离图中的值，该值表示其到最近线粒体的距离。
   3. 通过点击将数据导出为 .csv 文件 软盘 窗口左下角的图标。
   4. 为了根据斑点与线粒体之间的距离提取特定的斑点亚群，请在场景树中选择斑点，然后点击 滤光片 表。
   5. 在此窗口中，再次基于“Center Intensity Ch=X”添加一个新的滤镜，通过将下限阈值设为 0 µm、上限阈值设为 0.380 µm，提取距离线粒体小于 380 nm 的斑点。
      注意：380 nm 的阈值是基于 PLA 反应估算的，该反应包括一抗与二抗之间的结合距离（30 nm）以及 PLA 扩增信号半高全宽（FWHM）的一半（350 nm）。
   6. 要聚焦于选定的区域，并例如为其赋予不同的颜色，可通过按下按键执行复制步骤 重复选择并复制到新位置 按钮

结果

利用上述方案，我们检测了两种内质网（ER）锚定的脂质转运蛋白ORP5和ORP8的相互作用位点，并评估了它们在与其他细胞器（特别是线粒体）接触的ER膜亚区域中的分布情况。为此，使用红色线粒体标记物对HeLa细胞中的线粒体网络进行染色，并在固定后通过抗ORP5和抗ORP8的一抗检测ORP5-ORP8邻近连接实验（PLA）绿色信号点，这些一抗的特异性已通过免疫荧光预先验证¹⁵。共聚焦图像显示，HeLa细胞中内源性的ORP5-ORP8 PLA相互作用发生在网状ER、皮层ER以及与线粒体紧密接触的ER亚区域，后者通常被称为线粒体相关ER膜（MAMs；图2A）。为了定量分析发生在MAMs上的ORP5-ORP8 PLA相互作用，我们采用三维图像分析方法测量每个PLA信号点与线粒体之间的距离。使用380 nm作为距离阈值，三维成像分析显示，约50%的内源性ORP5-ORP8 PLA相互作用位于MAMs（图2A，B），其余50%的相互作用分布在皮层ER和网...

讨论

本方案旨在识别并定量在膜接触位点（MCSs）上，特别是在线粒体-内质网接触位点（MERCSs）上的细胞器间蛋白质邻近连接分析（PLA）相互作用。本方案的创新之处在于，它将PLA技术与多种细胞器标记、共聚焦显微镜成像以及三维图像分析相结合，用于定位和定量定位于同一膜结构中的两种蛋白质之间的PLA信号，具体而言即内质网膜中与线粒体膜（MAM）或同时与MAM和脂滴（LDs）邻近区域内的蛋白质相互作用。该方案可作为验证潜在定位于特定MERCSs、以及其他MCSs的蛋白质的工具。

自2006年发展以来，内质网（ER）与线粒体蛋白之间的邻近连接测定法（PLA）已被广泛用于定量线粒体-内质网接触位点（MERCSs）^7,9,10,11。然而，将PLA用作细胞中MERCS丰度的指标时，需通过高分辨率方法进行严格验证。例如，敲除线粒体蛋白SAM50...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1X 杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（1X DPBS）	Gibco	14190-094
氯化铵（NH4Cl）	VWR	21236.291
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A7906
圆形玻璃盖玻片 13 mm，1.5 号	Agar Scientific	L46R13-15
CMXRos 红色 MitoTracker	Invitrogen	M7512	红色线粒体标记物
共聚焦倒置显微镜 SP8-X	Leica	DMI 6000
Corning Costar TC 处理 24 孔板	Merck	CLS3526
Duolink 原位检测试剂 Green	Sigma	DUO92002
Duolink 原位封片介质含 DAPI	Sigma	DUO82040
Duolink 原位 PLA 探针 抗小鼠 MINUS	Sigma	DUO92004
Duolink 原位 PLA 探针 抗兔 PLUS	Sigma	DUO92014
Duolink 原位洗涤缓冲液，荧光	Sigma	DUO82049
Gibco Opti-MEM I 减血清培养基，含 GlutaMAX 补充剂	Gibco	51985026	无血清培养基
Imaris 软件 v 9.3	Bitplane	N/A	细胞成像软件
培养箱 UINCU-line IL10	VWR	390-0384
显微镜载玻片 StarFrost（3“ x 1“）	Knittel Glass
小鼠抗 ORP8	Santa Cruz	134409
多聚甲醛（PFA）	Sigma	P6148
兔抗 ORP5	Sigma	HAP038712
皂苷	Sigma	84510
超纯蒸馏水，无 DNase/RNase	Invitrogen	10977-035