本文所述方案展示了强效黏附性水凝胶明胶邻硝基苯甲醛（gelatin-NB）的合成方法。gelatin-NB具有快速且高效的组织黏附能力，可形成坚固的物理屏障以保护创面，因此有望应用于损伤修复生物技术领域。
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方法文章
强效粘附性水凝胶 Gelatin O-硝基苯甲醛的合成
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
粘附性材料已成为生物医学和组织工程领域中广受欢迎的生物材料。在我们之前的研究工作中，我们提出了一种新型材料——明胶邻硝基苯甲醛（gelatin-NB），该材料主要用于组织再生，并已在角膜损伤和炎症性肠病的动物模型中得到验证。这是一种通过邻硝基苯甲醛（NB）对生物明胶进行修饰后形成的新型水凝胶。明胶-NB的合成方法是：首先活化NB-COOH中的羧基，然后在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的作用下与明胶发生反应。所得产物经过纯化后获得最终产品，可稳定储存至少18个月。NB能够与组织中的-NH2基团产生强粘附作用，形成大量C=N键，从而增强明胶-NB在组织界面的粘附性能。该制备过程包括NB-COOH基团的合成、基团修饰、明胶-NB的合成以及化合物纯化等步骤。本研究旨在详细描述明胶-NB的具体合成过程，并展示其在组织损伤修复中的应用。此外，本实验方案的提出，有助于科学界进一步增强和拓展该材料的性能，以适用于更多实际应用场景。
引言
水凝胶是一类通过吸水溶胀形成的三维聚合物。特别是来源于细胞外基质的水凝胶，由于其优异的生物相容性和治疗效果，在生物合成与再生医学领域得到广泛应用1。已有研究报道水凝胶可用于胃溃疡、神经炎、心肌梗死2,3,4等疾病的治疗。此外，已有研究证实明胶-NB可改善炎症性肠病（IBD）的炎症结局5。传统的水凝胶包括结冷胶、明胶、透明质酸、聚乙二醇（PEG）、层状、疏水/亲水、海藻酸盐/聚丙烯酰胺、双网络以及两性聚电解质水凝胶6，这些水凝胶均具有良好的组织相容性和力学性能。然而，这些传统水凝胶易受环境中湿气和空气的影响。若长时间暴露于空气中，会失水干燥；若长期浸入水中，则会吸水膨胀7，从而降低其柔韧性与力学功能。此外，维持传统水凝胶的组织粘附性仍是一项重大挑战8。
基于此，我们设计并合成了纳米级水凝胶明胶-NB，这是一种通过将生物明胶与NB修饰而形成的新型水凝胶（图1）。NB对组织上的-NH2
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方案
C57BL/6小鼠购自浙江大学医学院附属邵逸夫医院，新西兰兔购自浙江大学。动物在自然光照-黑暗循环条件下饲养，并可自由获取食物和饮用水。所有实验程序均经浙江大学伦理委员会（批准号：ZJU20200156）和浙江大学医学院附属邵逸夫医院动物护理与使用委员会批准，符合《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》的标准（批准号：SRRSH202107106）。
1. NB-COOH 的合成
- 根据先前研究提出的方案10，称取4-羟基-3-(甲氧基-D3)苯甲醛（8.90 g，58.5 mM，1.06当量[eq.]）、碳酸钾（10.2 g，73.8 mM，1.34 eq.）和4-溴丁酸甲酯（9.89 g，55.0 mM，1.0 eq.）。将上述化合物溶于40 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，在常温下搅拌16小时。
- 向混合物中加入200 mL 0 °C的水，使产物析出沉淀，得到粗产物。
- 将粗产物反复溶于DMF中，并重复沉淀过程共五个循环。沉淀后在80 °C下干燥2小时，得到前期产物。
2. 化学修饰与处理
- 按以下方法进行甲基4-(4-甲酰基-2-甲氧基苯氧基)甲氧基苯基丁酸甲酯的ipso取代反应。 ....
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结果
图 2A 展示了明胶-NB 合成过程中涉及的主要化学反应示意图，该反应通过将 NB 基团接枝到明胶上，促进组织整合。图 2B 显示，明胶-NB 水凝胶中的邻硝基苯在紫外光照射后立即转化为 NB 基团，随后活性醛基可与氨基发生交联，形成席夫碱。图 2C 表明，NB 基团的不同比例可能导致明胶-NB 形成不同的交联结构。
同时，对明胶-NB的物理性质进行了初步表征。如图3所示，当NB的投料比（FR）较低时，明胶-NB表现出强烈的凝胶化趋势。这意味着低FR的明胶-NB由于含有大量可与光生醛基反应的氨基，会形成柔软的水凝胶；而高FR的明胶-NB则能保持为可变形的液滴状态。我们还通过扫描电子显微镜（SEM）观察到，明胶-NB的整体形态能够稳定地黏附在角膜表面，如图3C所示。然而，未经处理或仅用明胶.......
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讨论
粘合材料是一类新型材料。越来越多的研究人员致力于合成各种类型的粘合材料，并尝试将其应用于生物技术、组织工程、再生医学及其他领域，近年来由此推动了该领域的蓬勃发展。除了关注粘合材料的强粘附性能外，研究人员也日益重视其他特性，如可注射性、自愈合性、止血性、抗菌性、可控移除性等13。这些新应用极大地拓展了粘合材料的应用范围，展现出广阔的应用前景。
本文介绍了新型水凝胶明胶-NB的合成方法。明胶-NB具有较强的黏附性，据报道其可应用于临床角膜损伤和肠道损伤的修复5,12。因此，推广明胶-NB的制备方法具有重要的学术价值和应用意义。
制备明胶-NB的关键步骤是其合成过程。我们提出了“投料比”（FR）的概念，即NB基团与明胶中伯氨基之间的摩尔比。合成明胶-NB的FR并非固定不变，可根据粘附组织界面的性质进行调整。对于兔角膜，明胶-NB滴眼液的FRNB =.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC） | 阿拉丁 | L287553 | |
| 4-羟基-3-(甲氧基-D3)苯甲醛 | 上海阿科迈生物科技有限公司 | H946072 | |
| 二氯甲烷（DCM） | 阿拉丁 | D154840 | |
| 二氯甲烷 | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | 20-139 | |
| 二甲基甲酰胺（DMF） | Sigma-Aldrich | PHR1553 | |
| 明胶 | Sigma-Aldrich | 1288485 | |
| 硫酸镁 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| 甲醇（MeOH） | Sigma-Aldrich | 1424109 | |
| 甲基 4-(4-甲酰基-2-甲氧基苯氧基甲氧基苯基)丁酸甲酯 | chemsrc | 141333-27-9 | |
| 4-溴丁酸甲酯 | 阿拉丁 | M158832 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 215511 | |
| N-羟基琥珀酰亚胺（NHS） | 阿拉丁 | D342712 | |
| 硝酸 | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| 碳酸钾 | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| 扫描电子显微镜（SEM，Nova Nano 450） | Thermo FEI | 17024560 | |
| 四氢呋喃/乙醇（THF/EtOH） | 阿拉丁 | D380010 | |
| 三氟乙酸（TFA） | Sigma-Aldrich | 8.0826 |
参考文献
- Tam, R. Y., Smith, L. J., Shoichet, M. S. Engineering cellular microenvironments with photo- and enzymatically responsive hydrogels: toward biomimetic 3D cell culture models. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 703-713 (2017).
- Xu, X., et al.
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