激光消融与活体显微成像技术研究肠道重塑

摘要

本文介绍了一种在激光诱导损伤后获取肠道图像的方法。通过将小鼠肠道暴露于多光子激光下，可在局部诱导单个或多个隐窝的丧失。通过在数月内对损伤区域进行重复成像，可实时捕捉肠道修复的动态过程。

摘要

探究肠道修复 体内 是一项精细的技术挑战。由于缺乏纵向成像方案，人们对调控肠道再生的细胞和组织尺度动态过程仍缺乏深入理解。本文介绍了一种活体显微成像方法，可在单个隐窝尺度上局部诱导组织损伤，并在活体小鼠中追踪肠上皮的再生反应。通过高强度多光子红外激光，以时间和空间可控的方式消融单个隐窝或较大范围的肠组织区域。随后进行的长期重复活体成像，实现了对损伤区域随时间变化的追踪，并可在数周时间内监测组织修复过程中的隐窝动态。在激光诱导损伤后，邻近组织中观察到隐窝分裂、融合及消失等隐窝重塑事件。该方案可用于研究稳态及病理生理条件下（如衰老和肿瘤起始）的隐窝动态变化。

引言

肠道的上皮衬层 constantly 受到胃酸、毒素和微生物群的挑战，这些因素可能导致上皮屏障的破坏。肠道结构和组织具有特殊的自我更新和修复损伤的能力。小肠的单层上皮组织形成隐窝-绒毛结构单元¹。在稳态条件下，位于隐窝底部的 Lgr5⁺ 肠道干细胞能够自我更新，并产生分化的子代细胞。这些分化后的子代细胞以类似传送带的方式沿绒毛轴向上迁移，最终在绒毛顶端脱落，从而使整个肠上皮在 3–5 天内完成更新^2,3。从长期来看，并非所有 Lgr5⁺ 细胞对组织更新的贡献均等，因为部分细胞还需具备逆着传送带方向向隐窝底部移动（即逆行运动）的能力^4,5。事实上，当 Lgr5⁺ 细胞因辐射等因素被清除后，位于隐窝底部以外的前体细胞会迁移至隐窝底部，去分化并重新补充干细胞池^6,7,8。

急性炎症可导致Lgr5⁺干细胞的丢失^9,10。除了干细胞丢失外，许多外部因素还可在隐窝尺度上引起上皮的急性损伤。辐射、化学处理和抗生素已被证实会损伤肠隐窝和绒毛¹¹。细菌、病毒和寄生虫感染则可影响更大范围的隐窝和绒毛区域¹²。肠道具有通过隐窝分裂（一个隐窝分裂为两个）在隐窝尺度上从内外损伤中显著恢复的能力¹³。在损伤发生后，损伤区域邻近的隐窝会通过分裂来补充隐窝数量。这一现象在稳态条件下也会发生，尽管程度较轻^14,15。为了平衡稳态期间隐窝数量潜在的增加，隐窝也可发生融合（两个隐窝合并为一个）^16,17。隐窝融合是否在损伤后重建隐窝数量中发挥作用，目前尚不清楚。此外，该过程的动力学特征及其调控因素仍有待阐明。

损伤模型对于研究至关重要 组织再生 体内已采用多种损伤模型来研究肠道组织再生。以往的实验策略利用高剂量辐射来耗尽干细胞池¹⁸ 或使用葡聚糖硫酸钠（DSS）处理以在小鼠中诱导慢性与急性结肠炎及隐窝丢失^19,20通过遗传学或光学手段进行的单细胞消融已被用于精确控制组织损伤，被视为解析干细胞与前体细胞功能的一种有力工具^21,22 并研究血管再生²³此外，已开发出一种活检损伤系统，用于在多个隐窝和绒毛的较大区域诱导损伤²⁴重要的是，对损伤性刺激的反应可能沿着肠道的近端-远端轴存在差异，这一点已在辐射研究中得到证实，辐射在小肠中造成的损伤比在结肠中更为严重。²⁵这凸显了需要采用靶向方法，以控制肠道损伤程度及其在肠道中的定位。

损伤程度和恢复过程传统上通过静态方法进行评估，这些方法对组织恢复的动力学信息提供有限。活体显微成像技术（IVM）为量化干细胞行为、上皮重塑以及多种器官中的再生过程提供了独特的机会^{26,27,28,29,30}，同时为肠道生物学研究带来了重要见解^{4,5,21,31,32,33,34,35,36}。

本文介绍了一种可诱导时空特异性肠道损伤并捕捉肠上皮层修复过程的方法。我们利用双光子激光消融技术损伤肠道隐窝，并通过重复性活体显微成像追踪损伤后的即时伤口反应及长期修复过程。本方案可实现对局部组织损伤后肠道组织结构再生重塑过程的系统性描绘。隐窝动态变化，包括分裂与融合事件，均可被便捷地定量分析并进行时间序列追踪。激光消融结合重复活体成像技术可作为研究肠道组织架构在稳态及病理生理条件下（如肿瘤起始过程）组织尺度动态变化的平台。

方案

本研究中描述的所有动物实验均按照荷兰癌症研究所（NKI）动物福利委员会（AWB）的指南和批准进行。

注意：在进行任何动物实验之前，请咨询所在机构的动物伦理委员会。

1. 手术与活体成像的准备工作

1. 术前处理
   1. 在手术前 4-6 周，通过腹腔注射将他莫昔芬溶于葵花籽油中，诱导 8-12 周龄的 K19-CreERT2³⁷: Rosa26-mTmG³⁸ 和 Lgr5eGFP-IRES-CreERT2¹⁸: Rosa26-Confetti³⁹ 小鼠（图 1）。
   2. 实施镇痛。手术前 30 分钟，按每 30 g 小鼠皮下注射 200 µL 用 0.9% NaCl 稀释的丁丙诺啡（0.1 mg/kg 体重）。在含有 125 mL 未酸化灭菌饮用水的瓶子中加入卡洛芬（0.067 mg/mL），于手术前 24 小时给予。或者，在手术开始前 30 分钟皮下注射卡洛芬（5 mg/kg）。
2. 手术准备
   1. 将灭菌的手术器械放入生物安全柜中。
   2. 打开加热垫并将温度设定为 37 °C。
3. 活体成像准备
   1. 在成像前至少 4 小时开启显微镜的温控腔室，以确保有足够的时间达到温度稳定。
      注意：所需时间可能因所用设备而异。
   2. 保持气候腔室内的温度稳定在 37 °C。
   3. 开启双光子显微镜、扫描仪和激光器。
   4. 启动成像软件。
   5. 将激光波长调节至 960 nm 并打开快门。

2. 手术与活体成像

1. 肠道的手术暴露
   1. 使用2%-3%异氟烷麻醉小鼠，并将其置于加热垫上，表面覆盖无菌布。通过观察呼吸频率和质量（每秒一次呼吸）以及检测小鼠的反射来评估麻醉深度。
   2. 用眼药膏覆盖小鼠的眼睛。
   3. 皮下注射200 µL预热的无菌生理盐水。
   4. 剃除腹部毛发并清除毛发。更换手术区域的无菌布。
   5. 插入直肠探针以监测小鼠体温。
      注意：温度应约为 37 °C。
   6. 戴上一副新的无菌手套。
   7. 以圆形方式对术区进行清洁，交替使用消毒液和80%乙醇各擦拭三次。用无菌棉签去除多余的乙醇。
      注意：此时必须密切监测小鼠是否出现低体温。
   8. 用无菌手术巾覆盖小鼠。
   9. 检查小鼠的反射。
   10. 使用无菌手术刀在皮肤上做一个约10毫米的垂直正中切口。
   11. 使用剪刀切开腹白线，分离腹直肌以打开腹腔。
   12. 使用浸有无菌预热生理盐水的无菌棉签寻找小鼠的盲肠，并以其作为参考点。
   13. 在一块无菌纱布上剪一个小口，将其浸入预热的无菌生理盐水中润湿，然后覆盖于切口上方。
   14. 用浸有预热无菌生理盐水的无菌棉签取出肠道。通过添加无菌预热生理盐水保持肠道湿润。
   15. 将一个无菌的定制成像室放置在小鼠旁边。
   16. 将小鼠转移至预热的无菌成像盒中。
   17. 将肠道置于成像盒的无菌玻璃上。将小鼠头部放入成像盒的吸入管内，如图所示 图1.
   18. 如有必要，使用无菌柔性薄膜和胶带固定小鼠。
   19. 将装有小鼠的成像箱放入显微镜腔室中。
2. 活体成像
   1. 成像过程中通过监测小鼠的呼吸频率、呼吸深度和体温来观察其状态 通过 每15分钟使用一次直肠探头。异氟烷的百分比应保持在1%至2%之间，必要时进行调整。
   2. 使用显微镜的目镜在肠道中找到一个区域。
   3. 使用显微镜内置相机获取目标区域的宽场视野图像，如图所示 图2A.
   4. 使用多光子显微镜的960 nm激光对感兴趣区域进行成像。根据实验中使用的荧光染料调整激光功率和波长。
   5. 获取目标区域10-20步、每步3 µm的z轴层扫图像。
3. 激光消融
   1. 从先前成像的图块中选择单个位置或多个位置。
   2. 使用成像软件的漂白点校准功能，在32倍放大倍数、124 × 124像素分辨率、扫描速度400 Hz条件下，采用双向扫描模式，持续3–10秒，具体时间根据预期损伤大小而定。隐窝区域损伤的起始可通过绿色和红色通道中自发荧光的增强来识别。
   3. 在同一小鼠的多个区域重复上述两个步骤。
   4. 消融后，获取损伤区域的z轴层扫图像，以确认损伤位置和范围。
4. 手术部位的关闭
   1. 将仍处于麻醉状态的小鼠置于无菌缝合区域。
   2. 使用浸有预热无菌生理盐水的无菌棉签，将暴露的肠管复位至腹腔内。
   3. 使用可吸收的5-0缝线连续缝合腹白线。以手术结结扎缝线的起始和末端。
   4. 对皮肤层重复相同的步骤。
   5. 关闭异氟烷工作站，并对成像箱及其内衬进行清洁和灭菌。
   6. 使用外科器械清洁剂、酶清洁剂和外科器械润滑剂清洁手术工具。待干燥后，将手术工具与手术箱一同放入高压灭菌器中进行灭菌。
5. 术后护理
   1. 让小鼠在手术后恢复，期间将鼠笼置于加热垫上约1小时。
      注意：如果可能，将小鼠与其他笼内同伴一起饲养。单独饲养并非恢复所必需。
   2. 每15分钟检查一次小鼠的体温。
   3. 注射 200 µL 皮下注射生理盐水稀释的丁丙诺啡（0.1 mg/kg 体重），每30 g小鼠在术后6–12 h给药。
   4. 术后72小时内，在含有125 mL非酸化高压灭菌饮用水的瓶子中加入卡洛芬（carprofen，0.067 mg/mL）供动物自由饮用。
   5. 术后每周每天称量小鼠体重并监测其健康状况。

3. 重复手术与活体成像

1. 手术
   1. 在第二次时间点（首次成像至少一周后），重复步骤 1.1.2、1.2、1.3 和 2.1。
2. 活体成像
   1. 重复步骤 2.2.1–2.2.3。
   2. 利用血管分布模式，定位在第一次时间点成像的相同感兴趣区域。
   3. 重复步骤 2.2.4 和 2.2.5。
3. 手术部位关闭
   1. 重复步骤 2.4.1。
   2. 如果小鼠无需在后续时间点进行成像，则在终末麻醉下通过颈椎脱位法处死小鼠；否则，继续下一步。
      注：根据欧盟指令 2010/63/EU 附录 IV 的指南，颈椎脱位是一种可接受的方法。
   3. 重复步骤 2.4.2–2.4.6。
4. 术后护理
   1. 重复步骤 2.5.1–2.5.5。

结果

为了展示激光消融法结合活体成像所能获得的实验结果类型，我们进行了如图1所示的实验。首先，我们向K19-CreERT2;mTmG（K19cre-mTmG）和Lgr5eGFP-IRES-CreERT2;Rosa26-Confetti（Lgr5cre-Confetti）小鼠注射他莫昔芬，以随机地标记细胞表达Confetti荧光蛋白中的某一种颜色（在mTmG小鼠中则为绿色荧光蛋白[GFP]）。K19-cre可实现所有上皮细胞的谱系示踪，而Lgr5-cre仅标记干细胞来源的细胞^8,18,37。他莫昔芬注射在手术及首次成像前4–6周进行，以确保隐窝中所有细胞均为单一克隆颜色。在数周内对相同组织区域进行可靠识别，对于追踪同一隐窝随时间变化的命运至关重要。组织固有的结构特征（如血管系统）可作为可靠的组织标志物，此处通过显微镜内置相机进行记录。此外，使用（至少两种）不同颜色标记少量隐窝，有助于在每次成像过程中识别相同的隐窝，并追踪其在激光损伤后再生过程中的行为变化。在手术暴露小鼠肠道并获取目标区域的相机图像和荧光图像后（图2A），可利用多光子激光的漂白点设置消融一个或多个隐窝（图2B、C）。损伤的起始可通过绿色和红色通道中自发荧光的增强来识别。为了研究隐窝恢复的动力学过程，在首次成像后的数周至数月内重复手术和成像操作，并利用组织固有的结构特征（血管系统和克隆标记隐窝的分布模式）作为定位标志，以精确定位先前损伤的相同位置（图2）。当该方法应用于Lgr5Cre-Confetti小鼠（其中Lgr5-eGFP呈斑片状表达）时，可捕捉到激光诱导损伤后隐窝数量和形态的变化（图3）。某些区域在隐窝数量和结构上未见明显变化（图3B），而其他区域则表现出广泛的隐窝重塑，表现为隐窝分裂与融合事件数量的增加（图3C），以及激光损伤两周后隐窝的丢失（图3D）。通过引入不同大小的损伤，并定量分析消融后发生的分裂、融合和隐窝消失事件（如图3E所示示例），可在不同小鼠模型中绘制出损伤诱导再生的动力学图谱。

图1实验装置示意图 在体 通过腹腔注射他莫昔芬，在基因修饰的小鼠模型中诱导肠道隐窝内Cre介导的重组，从而实现对肠细胞的标记。在注射后数天或数周（当隐窝变为单一颜色的单克隆状态）时，通过手术暴露小肠，并在带有温度控制腔室的多光子显微镜下进行激光消融。消融后立即评估隐窝损伤程度，随后让小鼠从手术中恢复。通过多次手术暴露结合活体成像（IVM），可随时间推移监测肠道的修复过程。利用血管系统的分布模式以及不同颜色的隐窝排列，可在消融后数周甚至数月重新定位到相同的观察区域。在消融部位，可在数周后观察到隐窝的重塑现象（如分裂或融合）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图2：肠道激光损伤后组织再生的纵向成像。当肠道以完全相同的方式定位时，可利用其血管作为图谱，用于定位并成像完全相同的区域。（A）肠道的相机概览图像。白色虚线表示损伤部位（白色方框）邻近区域的血管分布模式，作为标志物，用于在另一时间点找到相同的激光消融区域。下方两幅图像为白色方框区域的放大视图。箭头指示第1天及1个月后激光消融的确切位置。（B）通过多光子显微镜捕获的单个隐窝损伤的荧光图像。蓝色方框中的箭头显示第1天及1个月后损伤的位置。（C）隐窝损伤区域的荧光图像。蓝色方框中的箭头标记第1天及1个月后损伤区域的位置。比例尺：1 mm（A，上图）；0.25 mm（A，下图）；200 µm（B 和 C 的大范围概览图）；50 µm（B 和 C 的放大图像）。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：激光消融后隐窝命运的活体成像。（A）利用Confetti模型，可通过不同颜色标记的隐窝随时间变化来追踪恢复过程的动态。白色箭头指示激光消融位点。黄色框表示邻近区域（<100 µm，距损伤部位），而蓝色和紫色框表示远离（>100 µm）激光消融区域的部位。可观察到不同的再生模式。（B）某些区域保持不变，如紫色框所示。（C）其他区域表现出以隐窝分裂或融合形式出现的隐窝重塑；白色虚线和箭头表示隐窝分裂事件，橙色虚线和箭头表示隐窝融合事件。（D）在某些区域可观察到隐窝消失，例如黄色框中由橙色虚线标示的隐窝已消失。（E）一个量化示例，显示在损伤部位邻近区域（即小于100 µm）和远端区域（即大于100 µm）观察到的隐窝重塑事件数量。比例尺：200 µm（A）；50 µm（B-D）。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方案结合显微激光消融与纵向活体显微成像技术，用于追踪肠道从早期损伤应答到长期组织重塑的再生过程。该技术的建立严格遵循伦理考量，以诱导并成像显微激光消融；若严格按照步骤操作，可确保实验动物的健康状态。手术过程中，必须确保肠道完整性得到良好保护。可通过使用无菌湿润棉签轻柔操作组织，防止组织出血或干燥。激光诱导的微观损伤程度也应在激光消融后通过成像目标区域的不同肠壁层次进行仔细评估。若研究人员希望调整本方案中所述实验步骤的频率，应在实验前咨询所在机构的动物伦理委员会，以明确其对动物福利可能造成的影响。

重复的活体显微镜技术可实现对同一只小鼠体内组织修复过程的长期动态监测。通过反复进行手术暴露肠道，可方便地获得对整个肠道的光学观察通路。组织固有的特征（如血管结构）可作为解剖标志，用于在每次成像过程中识别相同的肠段区域。因此，可在数周内对同一组织区域进行连续成像，从而实现对同一只小鼠同一肠区长期组织再生过程的定量分析。该联合手术与成像方法所提供的时空控制优势在于，可在同一只小鼠中分别观察器官在稳态与再生状态下的情况，这与以往的全器官损伤模型形成对比——在那些模型中，对照组与再生样本来自不同的小鼠^{11,12,18,19,20}。因此，本实验设计显著减少了实验所需动物数量，并降低了个体间差异带来的影响。

实验方案的故障排除应首先回顾小鼠和肠道的操作技术，并检查显微镜设备及其设置。本方案中有多个关键步骤需要特别注意。首先，为确保动物福利以及持续获得高质量的数据，所有操作必须在洁净无菌的环境中采用无菌技术进行，且在手术及每次成像过程中均需维持小鼠体温。在成像期间使用无菌预热的生理盐水保持组织湿润至关重要，可防止组织发生纤维化。

为确保实验具有可重复性，使用前应对激光器进行校准以获得最佳采集效果，并在每次实验开始时测量多光子激光器的输出功率。物镜类型、放大倍数、像素驻留时间、激光功率和波长等参数均会影响显微激光消融的程度，需予以考虑。本研究中，激光消融和成像均使用 Fluotar VISIR 25×/0.95 WATER 物镜，在波长 960 nm、激光功率 1.2 W（物镜出口处）的条件下进行。改变波长或光学扫描特性会影响显微损伤的程度。较低的波长（如 840 nm）对应更高能量的光子，通常导致激光输出更高，可能增强显微损伤。更高的放大倍数（zoom）会使单位区域获得更多的能量，因此消融隐窝所需时间更短，反之亦然。也可通过增加或减少像素驻留时间来调节消融速度和损伤程度。当成像组织不稳定时（例如由于肠蠕动），需快速完成消融。为此，可通过提高放大倍数和/或增加激光输出等方式优化消融速度。

在多次成像过程中准确定位相同的肠段区域是确保实验成功的关键步骤之一，必须正确执行。为此，需要在所有时间点将肠道以完全相同的方式进行定位。我们建议始终以盲肠作为参考点，用于定位小肠和大肠中的相同区域。使用棉签轻轻拉伸目标组织，可确保感兴趣区域处于物镜工作距离范围内，并最大限度地提高可被追踪的区域数量。此外，建议在每只小鼠中消融并成像多个显微位置，以应对后续成像过程中可能无法重新定位的区域。即使肠道定位正确但仍无法找到目标区域时，可尝试重新调整小鼠体位并改变暴露区域的朝向。对于需要消融多个相邻隐窝等较大肠段区域的实验，长期追踪隐窝可能较为困难。此类损伤性操作可能引发超出上皮单层的组织重塑，最终导致用于长期追踪的组织标志物发生改变。选择距离损伤部位足够远的标志点，并获取超出损伤区域数百微米的更大视野，有助于提高长期实验的成功率。除肠道在显微镜载物台上的定位不当外，胃肠道的蠕动也可能干扰成像。该问题可通过两种方式缓解：若蠕动频率不高，可在相同区域通过增加曝光时间重复成像过程。 或者，可使用更高剂量的麻醉剂以减少蠕动。我们建议将异氟烷的高剂量使用限制在短暂调整期间。总体而言，应尽可能缩短每次成像时间，理想情况下不超过3小时，以确保动物快速恢复。

与其它损伤模型相比，联合激光消融与纵向活体显微技术具有多项优势。以往的（化学性）损伤模型无法实现损伤区域的局部限定^{6,11,12,19,20}。激光消融通过将损伤限制在特定感兴趣区域，克服了这一局限性。这使得研究人员能够精确控制损伤的位置以及损伤范围。通过调节损伤强度，可实现对隐窝或整个显微肠区的消融，从而研究隐窝尺度上的再生反应。除了空间控制能力外，激光消融还可精确控制损伤发生的时间，因此在时间精度上优于以往的药物、化学和感染模型^{9,10,11,12,19,20}。本方案在先前使用激光诱导热消融以在肠道内造成局部损伤的研究基础上进行了拓展^21,23。以往的激光诱导损伤模型仅对小肠局部区域²¹或远端结肠腔面²³进行成像。本研究结合外科手术与激光消融技术，可实现对肠道上皮（尤其是隐窝）的高分辨率可视化，并可在小肠、盲肠及近端结肠的任意位置实施激光消融，随后对组织修复过程进行连续成像观察。该方法能够长期追踪同一肠道区域的恢复过程，根据实验设计可视化肠道的不同层次结构（黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层）。本技术主要适用于持续数周至数月的长期重复成像研究。若需研究隐窝的短期恢复动态（例如损伤后连续数天内的变化），可将本文所述的激光消融方法与活体成像窗技术相结合^27,28,40。

该方案可广泛应用于再生、免疫学和癌症研究等多个科学领域的研究。对肠道再生进行纵向成像，有助于揭示维持上皮完整性与屏障功能、介导宿主防御肠腔病原体侵袭，以及驱动致癌突变清除与扩散的细胞动态过程。每个科学问题对激光诱导损伤的程度和成像持续时间均有特定要求。利用荧光报告小鼠及注射染料可显著扩展并优化数据获取能力，实现对任何目标细胞和结构的可视化观察。例如，Lgr5-CreERt2:Rosa26-Confetti 小鼠可用于追踪干细胞子代，而 Rosa26-mTmG 报告系统则可揭示组织结构。这些最新技术进步共同使活体肠道实验成为深入理解肠道生物学与疾病机制的有力工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉诱导箱	Veterinary Technics
高压灭菌器	Certoclav
聚维酮碘	Mylan	202809
护理垫（吸水垫）	Absorin comfort
杜蒙特镊子	Fine Scientific Tools	11255-20 或 11272-40	不锈钢，型号 #55，用于夹持腹膜
酶解器械清洗剂	Roboz	EC-1000
80% 乙醇	自制	NA
眼膏	Duratears Z (Alcon)	288/28282-6
直头精细剪刀，9 cm	Fine Scientific Tools	14060-09	用于剪开小鼠皮肤和腹膜
纱布 5 cm×5 cm	Cutisoft (Bsn medical)	45847-00
格拉夫齿状弯镊	Fine Scientific Tools	11051-10	用于夹持皮肤
哈特曼直型止血钳	Fine Scientific Tools	13002-10	用于缝合
加热垫	Comfort	T5-5000
成像箱	定制
切口膜	Nobafilm	172215
带自动载物台的倒置多光子显微镜	Leica Microsystems	NA
异氟烷（vetflurane）	Pharmachemie BV, Haarlem, Netherlands	305788
异氟烷蒸发器	Penlon sigma delta
纸质微孔胶带	Micropore
0.9% 氯化钠	Braun		其他品牌可用
25G 针头	BD	300600
tesa 纸胶带	Tesa	NA
Parafilm 封口膜	Bemis	PM-994	半透明胶带
剃须刀片	Supermax 不锈钢		其他品牌可用
直肠探头	Kent Scientific	20250-91
Rimadyl 牛用（卡洛芬）	Zoetis B.V	注册号 REG NL 10130
学生用直头精细剪刀，11.5 cm	Fine Scientific Tools	91460-11	用于剪纱布
外科器械清洗剂	Roboz	IC-1000
外科器械润滑剂	Roboz	IL-1000
注射器（1 ml）	BD	303172	其他品牌可用
他莫昔芬	Sigma	T5648
丁丙诺啡盐酸盐（Temgesic）	Indivior UK Limited/Reckitt Benckiser Healthcare	注册号 RVG 08725
薇乔聚乳酸-羟基乙酸缝线 5-0，FS-2 针	Ethicon	V292ZH
VirkonS	Bio-services		消毒溶液
木柄无菌棉签	Klinion	531530	其他品牌可用