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方法文章

利用土壤密度分馏法分离不同的土壤碳库

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DOI：

10.3791/64759

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2022年12月16日

 ,  ,  , 
1Department of Crop and Soil Sciences, Oregon State University, 2USDA Forest Service

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

土壤密度分组法可将土壤有机质分离为具有不同稳定机制、化学性质和周转时间的独立组分。利用特定密度的多钨酸钠溶液，可分离游离态颗粒有机质和矿物结合态有机质，从而获得适用于描述土壤对管理和气候变化响应的有机质组分。

摘要

土壤有机质（SOM）是一种复杂的混合物，包含从游离的、部分降解的植物组分，到被土壤团聚体束缚的微生物改造程度较高的化合物，再到与活性土壤矿物紧密结合的高度转化的微生物副产物。土壤科学家一直致力于寻找将土壤分离为可测量且对土壤碳（C）建模有用组分的方法。基于密度的土壤组分分离方法正日益得到广泛应用，该方法操作简便，并可根据SOM与不同矿物结合程度的差异获得相应的碳库；因此，土壤密度分组有助于表征土壤有机质并揭示其稳定机制。然而，已报道的土壤密度分组方案存在显著差异，导致不同研究和生态系统之间的结果难以比较。本文介绍了一种可靠的密度分组流程，用于分离颗粒态有机质和矿物结合态有机质，并阐述将土壤分为两组、三组或更多密度组分的优缺点。这些组分通常在化学与矿物组成、周转时间、微生物转化程度以及矿物稳定化程度方面存在差异。

引言

土壤是陆地碳（C）最大的储存库，全球表层1米土壤中储存的碳超过1,500 Pg，更深层土壤中的碳储量几乎达到该数值的两倍，因此土壤中的碳含量超过了植物生物量和大气中碳含量的总和1。土壤有机质（SOM）能够保持水分和土壤养分，对植物生产力及陆地生态系统功能至关重要。尽管全球已普遍认识到充足的SOM储量对土壤健康和农业生产力的重要性，但由于不可持续的森林和农业管理、景观变化以及气候变暖，土壤碳储量已显著减少2,3。随着人们对恢复土壤健康以及将土壤碳固存作为自然气候解决方案关键组成部分的兴趣日益增加，科研界正致力于了解在不同环境中控制土壤碳封存与稳定性的各种因素4,5。

土壤有机质（SOM）是一种复杂的混合物，包含多种化合物，其范围从游离的、部分降解的植物组分，到被包裹在土壤团聚体（此处定义为由独立单元或组分结合形成的物质）中、经微生物显著转化的化合物，再到与活性土壤矿物紧密结合的高度转化的微生物代谢产物6。在难以全面鉴定SOM中所有单个化合物的情况下，研究者通常聚焦于识别数量较少、具有物理实在性的碳功能库，这些碳库在周转速率、基本化学组成以及与土壤矿物组分的稳定化程度方面存在差异1,7。为了能够对这些碳库进行严谨的解释和建模，必须满足以下条件：碳库数量较少、可直接测量而非仅具理论意义，并且在组成和反应性方面表现出明显差异8。

已采用多种化学和物理方法来分离具有明确意义的土壤碳库，这些方法已被von Lützow等人9和Poeplau等人10进行了系统总结。化学提取法旨在分离特定的碳库，例如与非晶质或晶质铁和铝结合的碳11。有机溶剂曾被用于提取特定化合物，如脂类12，而通过水解或氧化土壤有机质（SOM）的方法则被用作衡量活性碳库的指标13,14。然而，这些提取方法均无法将所有碳库完全划分为可测量或可建模的组分。土壤的物理分组法根据颗粒大小将全部土壤碳划分为不同的碳库，并假设植物残体的分解过程会导致其破碎并形成越来越小的颗粒。尽管仅凭粒径无法完全区分游离植物残体与矿物结合态的土壤有机质15，但由于这两类碳库在空间分布、物理特性以及形成与周转过程中的生物地球化学特性存在显著差异，对其分别定量对于理解土壤碳的稳定性至关重要16。

基于密度的土壤碳组分分离方法正日益得到广泛应用，该方法操作简便，可根据有机质与不同矿物结合程度的差异来识别不同的碳库17,18,19；因此，土壤密度分组有助于阐明不同的土壤碳稳定机制。进行土壤分组的前提是能够将有机颗粒和矿物颗粒充分分散。一旦实现充分分散，相对不含矿物的降解有机质会在密度低于约1.85 g/cm3的溶液中上浮，而矿物的密度通常在2–4.5 g/cm3之间，尽管铁氧化物的密度可高达5.3 g/cm3。轻组或游离颗粒态组分的周转时间通常较短（除非受到木炭的显著污染），且已被证明对耕作及其他扰动高度敏感。重组（>1.85 g/cm3）或与矿物结合的组分由于有机分子与活性矿物表面结合后抵抗微生物分解的能力增强，通常具有较长的周转时间。然而，重组可能达到饱和状态（即矿物络合能力的上限），而轻组在理论上可近乎无限地积累。因此，了解有机质在矿物结合态有机质与颗粒态有机质库中的物理分布，有助于阐明哪些生态系统可通过管理实现高效的碳封存，以及不同系统将如何响应气候变化和人为干扰模式的变化20。

尽管过去十年中利用不同密度的偏钨酸钠溶液进行密度分级的方法得到了广泛应用，但不同研究和技术方案之间存在显著差异，导致来自不同研究和不同生态系统的实验结果难以比较。虽然已有研究表明，1.85 g/cm3 的密度能够最大程度地回收游离轻组分，同时最大限度减少矿质结合有机质（MAOM）的混入17，但许多研究使用的密度范围仍介于 1.65–2.0 g/cm3 之间。尽管大多数研究仅将土壤分为两个组分（即轻组分和重组分，下文简称 LF 和 HF），但其他研究则采用多个密度进一步将重组分细分为与不同类型矿物结合、矿物与有机包膜相对比例不同或聚集体程度不同的多个组分（例如 Sollins 等17、Sollins 等18、Hatton 等21、Lajtha 等22、Yeasmin 等23、Wagai 等24、Volk 等25）。此外，已有研究提出更为复杂的分级流程，结合粒径与密度分离，从而获得更多的组分（例如 Yonekura 等26、Virto 等27、Moni 等15、Poeplau 等10），但也相应增加了方法学误差以及组分定量方面的不确定性。此外，研究者还采用不同强度和时间的超声处理，以期分散聚集体并使矿质表面的 MAOM 解离28,29,30。

本文介绍了一种可靠的密度分馏方法，该方法首先可识别出两种独特的土壤碳组分（轻组分LF和重组分HF，或颗粒有机质POM和矿物结合有机质MAOM），并提供了相应的技术手段和理论依据，以进一步根据矿物类型、有机包膜程度或团聚状态将重组分（HF）划分为更多不同的组分。研究表明，此处所鉴定出的不同组分在化学组成、周转时间、微生物加工程度以及矿物稳定化程度方面均存在差异18,19。

以下实验步骤通过将已知质量的土壤与特定密度的溶液混合，将大量土壤分离为颗粒有机质（POM）和矿物结合有机质（MAOM）。该方法的效率通过土壤质量和碳的回收总量相对于初始土壤样品质量和碳含量的比值来评估。通过将偏钨酸钠（SPT）溶解于去离子水中，可配制出高密度溶液。首先将土壤与高密度SPT溶液混合，并进行振荡，以充分混匀并分散土壤团聚体。随后通过离心，使土壤中漂浮的部分（轻组分）和下沉的部分（重组分）在溶液中分离。通过多次重复混合、分离、回收和洗涤步骤，确保轻重组分的有效分离，并彻底去除材料中的SPT。最后，将分离得到的土壤组分干燥、称重，并测定其碳含量。分离后的材料可用于后续的实验与分析。

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方案

1. 配制偏钨酸钠（SPT）储备液

警告：SPT 具有刺激性，吞咽或吸入有害。对水生生物有毒，避免向环境中释放。

  1. 配制密度为 1.85 g/cm3 的 1 L SPT 溶液：将 1,051 g 结晶 SPT 溶解于约 600 mL 去离子蒸馏水（DDI）中。搅拌溶液直至 SPT 完全溶解（约 15 分钟），然后用 DDI 定容至 1 L。
    注意：使用密度<1.85 g/cm3 的溶液进行碳回收时，可能导致来源于颗粒有机质的轻组分碳回收不足17,18，从而低估样品中的碳含量。因此，建议采用密度为 1.85 g/cm3 的 SPT 溶液8,17，以便更全面地回收与颗粒有机质相关的碳，适用于典型的土壤样品（即碳含量<10% 的大多数砂质、粉质和黏质壤土）。
  2. 配制密度为 2.40 g/cm3 的 1 L SPT 溶液：将 1,803 g 固体 SPT 溶解于约 500 mL DDI 水中。搅拌溶液直至 SPT 完全溶解，然后用 DDI 定容至 1 L。
    注意：除用于土壤组分分离外，在后续实验步骤中（见步骤 3.2）常需使用密度大于 1.85 g/cm3 的溶液来调节 SPT 溶液。若剩余额外的 2.40 g/cm3 溶液，可用去离子水稀释至 1.85 g/cm3 后用于土壤组分分离。
  3. 在用于组分分离前，应对 SPT 进行碳（C）和氮（N）含量分析。使用固体或液体元素分析仪进行该分析（示例方法：ISO 10694:1995，ISO 20236:2018）。
    1. 对于液体元素分析仪，将步骤 1.1 中的溶液进行 1:100 稀释，以减少元素捕集器和催化剂的损耗。SPT 溶液中碳和氮污染的可接受限值取决于样品类型及土壤组分的后续用途。通常认为，碳含量<1 ppm 且氮含量<0.1 ppm 的 SPT 溶液适合使用，因为此类溶液对远大于其自身含量的土壤碳库和氮库的影响可忽略不计。

2. 土壤在SPT中的溶解

  1. 将50 g风干并过2 mm筛的土壤加入250 mL锥形聚丙烯离心管中。记录质量，至少保留四位有效数字。请勿使用烘干土壤，因为加热可能导致细胞裂解，从而增加可溶性碳含量31。
    注意：可使用田间湿润土壤31，但在后续步骤中需进一步调整，以维持SPT溶液的目标密度。建议将土壤过2 mm筛，以去除可能干扰分馏结果的大颗粒物质，如石块和木质碎屑。
    1. 调整土壤质量，以确保各组分回收量足够，避免定量时产生显著误差。最常见的调整原因是POM含量较低（例如，<总土壤质量的2%）。对于此类土壤，应增加土壤质量，以准确测定POM回收率。总体而言，可针对每个样品单独调整土壤质量，因为改变样品质量不会影响POM与MAOM的比例。然而，为便于离心机平衡，通常建议使用一致的质量。
    2. 在分馏前，对富含碳酸盐的土壤进行处理，以去除无机碳酸盐32。
  2. 向离心管中加入50 mL密度为1.85 g/cm3的SPT溶液，并 tightly 盖上盖子。与土壤用量类似，可根据需要调整SPT溶液的体积。对于POM含量较高的表层土壤（例如，许多温带森林土壤），应采用更高的土壤与SPT比例（例如，30 g土壤加入60 mL SPT），以实现轻组分和重组分材料的有效分离。
  3. 用手剧烈振荡离心管约60秒，以打破非水稳性团聚体。希望土壤团聚体与离心管壁发生强烈碰撞，因此仅使用涡旋振荡可能不足以达到效果。
  4. 将离心管固定在平台摇床上。通常将离心管横放有助于土壤分散，可增强溶液的晃动作用力并降低土壤层的静置高度。注意确保离心管密封严密，在40–120 rpm条件下振荡2小时。期间定期将离心管从摇床上取下，用手剧烈振荡，以增强致密团聚材料的搅动效果。

3. 进行粗土壤组分分离

  1. 从摇床中取出离心管。通过小心地添加额外的SPT溶液，使待离心的一组离心管质量保持一致，并在加入SPT溶液后用手剧烈震荡30秒，以确保均匀混合。随后在摆桶式离心机中以3,000 × g 离心10分钟。
  2. 在吸取样品前，用移液器吸取5 mL上清液，通过天平测量其质量，以检测上清液的密度。根据需要调整SPT溶液的密度以达到目标密度。若进行了密度调整，则需再次震荡并离心。
  3. 将一个1 L抽滤瓶连接至真空泵。在内径为12 cm的瓷质布氏漏斗中放置一张110 mm玻璃纤维滤膜（孔径0.7 µm）。使用锥形橡胶垫圈将漏斗小心密封在抽滤瓶上。
    注：玻璃纤维滤膜在使用前应预先在150 °C的烘箱中烘干，并用双蒸水（DDI）冲洗。
  4. 设置另一个连接至真空泵的1 L抽滤瓶。在瓶口插入一个橡胶塞，并连接一段长约0.5 m的抽吸管用于抽吸。
    注：可在抽吸管末端连接一个塑料吸头（例如剪去尖端成斜角的5 mL一次性移液器吸头），以提高抽吸过程中的控制性（见图1）。
  5. 轻轻抽走上清液以及沿离心管壁沉积在溶液顶层的悬浮物质，注意不要让抽吸管尖端接触底部的土壤沉淀表面。
    注：若不慎将土壤沉淀物（重组分）与悬浮物（轻组分）一同抽走，则必须重复分步分离操作。若未察觉此错误，将导致轻组分质量高于预期且碳含量低于预期，这可能在具有相似土壤性质的样品数据分析中显现出来。
    1. 在样品之间清洗抽吸管时，可快速将管尖浸入双蒸水（例如，浸入0.1秒），然后开启真空泵抽吸约5 mL双蒸水通过管道。重复操作直至管道内所有残留物被彻底冲洗干净。
    2. 从抽滤瓶上取下橡胶塞和抽吸管装置，在真空泵开启状态下将瓶内液体倒入布氏漏斗中。
    3. 用双蒸水冲洗抽滤瓶，轻轻旋转混匀后将冲洗液倒入布氏漏斗。重复操作，直至瓶壁上所有残留物均被清除。
  6. 向离心管中加入50 mL SPT溶液，用手剧烈震荡60秒（或使用摇床，若土壤不易迅速分散），确保彻底打碎管底的坚硬沉淀，使所有残留物重新悬浮。随后在3,000 × g 条件下离心10分钟。
  7. 重复步骤3.5。将抽滤瓶中的内容物倒入步骤3.5.2中使用的同一布氏漏斗中。
  8. 向离心管中加入50 mL SPT溶液，并用手剧烈震荡，确保彻底打碎管底的坚硬沉淀。在3,000 × g 条件下离心10分钟。
  9. 重复步骤3.5。将抽滤瓶中的内容物倒入步骤3.5.2中使用的同一布氏漏斗中。

4. 使用更高密度的 SPT 进行额外的密度分离

注意：如果进行多个额外的密度梯度分离，后续的分离步骤必须按照密度递增的顺序进行。此处展示了使用1.85-2.4 g/cm3和>2.4 g/cm3密度SPT进行分离的步骤。

  1. 加入50 mL密度为2.4 g/cm³的溶液3 SPT 加入含有该样品的离心管中 >1.85 g/cm3 来自步骤3的土壤样品。用手剧烈振荡（>60 秒），确保将管底的硬沉淀充分打散。在 3,000 x g 条件下离心 10 分钟 g.
  2. 在吸取样品前，用移液器吸取5 mL上清液，通过天平称量其质量以检测溶液密度。根据需要调整SPT密度以达到目标密度。若进行了溶液密度调整，则需再次摇匀并离心。
  3. 使用 2.4 g/cm 重复步骤 33 用SPT溶液替代1.85 g/cm3 之前使用的SPT溶液。在第3步结束时，布氏漏斗中分离得到的材料密度介于1.85–2.4 g/cm³之间。3，而离心管中剩余的物质将具有较高的密度 >2.4 g/cm3.

5. 从重密度和轻密度组分样品中洗涤SPT

注意：以下洗涤步骤必须对所有分步收集的组分进行。如果SPT溶液未从材料中彻底冲洗干净，相应的组分重量将不准确。

  1. 向含有重组分材料的离心管中加入 50 mL 去离子水，手动剧烈振荡 60 秒，确保将管底的坚硬沉淀充分打散。在 3,000 × g 条件下离心 10 分钟。
  2. 如步骤 3.5 所述进行吸除。此时，所有轻组分材料应已被去除。将澄清的上清液弃入废液桶中，不要将其加入滤漏斗。
  3. 重复步骤 5.1–5.2 两次。在最终吸除管中溶液之前，使用移液器吸取 25 mL 上清液，通过将溶液质量除以体积来测定其密度，以确认样品中的 SPT 已被充分去除。如果密度<1.01 g/mL，则进入下一步。如果密度为 1.01 g/mL 或更高，则重复上述水洗步骤，直至密度低于 1.01 g/mL。
  4. 为确保从轻组分中完全去除 SPT，用去离子水充满每个布氏漏斗，使内容物通过玻璃纤维滤膜进行过滤。待水完全滤过后，再重复此过程两次。如果土壤有机质含量较高，过滤可能需要长达 48 小时。

6. 重组分物质的收集

  1. 小心地将离心管中的土壤刮入一个干净且已标记的玻璃烧杯或玻璃瓶中。向离心管中加入足够的去离子水（DDI水），以松动残留的土壤；盖上管盖并振荡，然后将所得悬液转移至玻璃容器中。用去离子水将离心管中剩余的土壤全部冲洗下来，并转移至玻璃容器中。
  2. 将玻璃容器放入设定温度为40–60 °C的干燥烘箱中。干燥至恒定干重，通常需要24–72小时。

7. 轻组分物质的收集

  1. 关闭真空泵，将漏斗从侧臂烧瓶上取下。将漏斗水平持于已标记的玻璃烧杯或玻璃瓶上方，使用去离子水洗瓶轻轻冲洗滤膜上的颗粒。
    注意：可能需要用刮刀轻轻刮擦滤膜，并冲洗滤膜两侧，以去除所有残留物。
  2. 将玻璃容器放入设定温度为 40–60 °C 的干燥箱中。干燥至恒重，通常需要 24–72 小时。

8. 称量分馏后材料的干重

  1. 将每个容器中的所有干燥物料轻轻刮入塑料称量舟中。记录质量至小数点后四位。将样品放入已标记的储存瓶或袋中。
  2. 对所有干燥样品重复上述操作。

9. 总有机碳的数据采集与分析

  1. 根据所用仪器的要求，遵循相应的分析步骤进行元素碳含量分析（例如，ISO 10694:1995）。
    注：将干燥后的组分材料研磨成细粉是常见的操作，以确保在元素分析前组分样品的均一性。
  2. 确保所有组分的累计质量至少达到原始土壤样品质量的 ~90%。如果材料损失量>10%，建议进行额外的重复分组实验。
  3. 量化各组分中土壤有机碳（SOC）的累计回收率。由于不同组分材料的非等比例损失以及溶解性有机碳的流失，SOC 的损失可能与质量损失并不完全对应。然而，SOC 的损失量也应<土壤样品中初始 SOC 含量的 10%。

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结果

土壤密度分级法非常适合用于研究不同土壤在颗粒态有机质和矿物结合态有机质含量上的差异。将土壤有机碳（SOC）划分为这两种不同的组分，有助于阐明土壤碳含量及其稳定化动态的变化，而这些变化在仅观察全土碳含量趋势时可能并不明显。进一步将重组分物质（密度 >1.85 g/cm3）进行分离，可更深入地了解土壤碳稳定化的变化趋势，但也会增加实验操作的复杂性、结果解释难度以及相关成本。尽管如此，将土壤划分为三个或更多密度组分，有助于揭示土壤碳库中复杂的趋势和化学差异。与所有土壤分级方法一样，这种土壤碳组分的分离并不完全精确，因此在报告结果时应充分认识到此类误差的潜在影响以及方法本身所依赖的假设条件。最后，操作人员应了解目前存在的多种土壤分级方法及其各自的优势与局限性（详见 von Lützow 等人9 和 Poeplau 等人10 提供的综述与比较）。这些土壤分级方法并非互斥，可根据需要合理组合使用，以改进或验证对土壤碳动态的分析。

在开始分步分离程序之前，选择所用密度组分的数量是...

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讨论

在整个土壤密度分组分离流程中，有几个特定步骤必须密切监控，以减少土壤组分分离与分析过程中的误差。土壤密度分组分离过程中的一个关键步骤是反复验证SPT溶液的密度。土壤样品中的水分往往会稀释SPT溶液，从而降低其密度。因此，研究人员必须始终确保离心后轻组与重组溶液已实现完全分离。如果组分未能充分分离，应添加更多SPT溶液，或减少土壤质量。砂质土壤分离迅速，而质地较细的土壤（尤其是氧化土）由于细颗粒悬浮量高，在离心过程中可能长时间保持浑浊状态。当离心后溶液仍呈浑浊时，应延长离心时间或提高离心速度。作为替代方案，可通过分析吸出液中的碳含量，估算悬浮沉积物造成的碳损失。

选择购买的多钨酸钠（SPT）质量取决于分馏后将进行的分析类型。Kramer 等人34发现，市售的 SPT 可能富含高15N 的铵，因此可能显著改变土壤组分的15N同位素特征。因此，在需要测定土壤同位素特征的研究中，应使用高纯度级别的 SPT（例如 SPT-0），以确保碳和氮的污染最小化。然而，纯度等级稍低一级的 SPT（例如 SPT-...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了美国国家科学基金会的资助，资助编号为授予 K.L. 的 DEB-1257032 以及授予 H. J. Andrews 长期生态研究计划的 DEB-1440409。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
吸液器/真空管 1/4 x 1/2"Kimble10847-216
锥形聚丙烯离心管，250 mLThermo Scientific376814
用于过滤瓶的锥形橡胶垫圈DWK Life Sciences292020001
双头平口不锈钢刮刀Fisher Scientific14-373-25A
玻璃纤维滤膜，GF/F 级，110 mmWhatmanWHA1825110
玻璃广口罐，16 盎司Ball Corporation500 ml 烧杯或玻璃称量皿也可替代使用 
聚丙烯锥形瓶适配器，250 mLBeckman Coulter369385
瓷质布氏漏斗，90 mmFisherBrandFB966F
往复式摇床，双速EberbachE6000.00
侧臂烧瓶，1000 mLVWR89000-386
多钨酸钠，结晶状SometuSPT-0 或 SPT-1，SPT 选择请参见讨论部分通过联邦快递从德国运输
摆动桶式离心机 Beckman Coulter3362020

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