本文介绍了一种时间特异性方法，可有效调控小鼠胎盘中关键的发育通路 体内通过在胚胎发育第12.5天向妊娠母鼠胎盘注射CRISPR质粒并进行电穿孔来完成该操作。
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本文内容
摘要
摘要
胎盘是一种关键器官，可调节并维持哺乳动物的发育 在子宫内胎盘负责母体与胎儿之间的营养物质和废物交换，以及生长因子和激素的产生与输送。在小鼠中进行胎盘特异性的遗传操作对于理解胎盘在产前发育中的特定作用至关重要。目前使用的胎盘特异性表达Cre的转基因小鼠在效率上存在差异，因此其他胎盘基因操作方法可作为有益的替代方案。本文描述了一种利用CRISPR基因编辑技术直接调控胎盘基因表达的方法，可用于改变特定靶基因的表达水平。通过相对精细的外科手术操作，在胚胎发育第12.5天（E12.5）对怀孕母鼠实施剖腹手术，使用玻璃微量移液管将CRISPR质粒分别注入各个胎盘组织中，每次注射后立即进行电穿孔转染。母鼠术后恢复后，胎盘和胚胎可继续发育，直至在后续时间点进行分析评估。通过该技术处理后对胎盘及子代的检测，可揭示特定发育时期胎盘功能在胚胎发育过程中的作用。此类基因操作手段将有助于更深入地理解在多种疾病背景下，胎盘遗传机制与功能如何影响胎儿的生长与发育。 关键词：胎盘, 基因操作, CRISPR, 电穿孔, 胚胎发育, 小鼠模型, 胎儿生长, 转基因技术, 剖腹手术, 基因表达调控
引言
胎盘是胎儿发育过程中至关重要的器官。胎盘的主要功能是提供必要的因子，并调控母体与胎儿之间营养物质和代谢废物的转运。哺乳动物的胎盘由胎儿组织和母体组织共同构成，形成母胎界面，因此母体和胎儿的遗传因素均会影响胎盘的功能1。胎盘的遗传异常或功能受损会显著改变胎儿的发育过程。既往研究表明，胎盘的遗传特征和发育状况与胎儿特定器官系统的发育异常密切相关。特别是胎盘的异常与胎儿大脑、心脏及血管系统的改变存在关联2,3,4,5。
激素、生长因子及其他分子从胎盘向胎儿的转运在胎儿发育过程中起着重要作用6。研究表明，改变胎盘中特定分子的生成可影响神经发育。母体炎症可通过改变胎盘中色氨酸（TRP）代谢相关基因的表达，增加血清素的生成，进而导致胎儿大脑中血清素的积聚7。其他研究发现胎盘异常常伴随心脏缺陷。目前认为，胎盘的异常可能促进先天性心脏病的发生，而先天性心脏病是人类最常见的出生缺陷8。最近一项研究鉴定出多个在胎盘和心脏中具有相似细胞通路的基因。若这些通....
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方案
所有操作均按照联邦法规和爱荷华大学政策进行，并经机构动物护理和使用委员会批准。
1. 动物与饲养
- 将动物置于12小时光照周期中，并提供食物和水 随意摄取.
- 使用8-15周龄的CD-1雌性小鼠。通过检测交配栓的存在来确定E0.5。
- 在E0.5天，将怀孕的母鼠单独饲养。
2. 微量移液器的校准
注意：应尽可能在手术前完成微量移液器的校准。
- 在制备和校准微移液管之前，将所有质粒用无DNase的水稀释至推荐浓度（0.1 µg/µL）。将质粒与适当稀释的快绿染料（1 µg/µL，溶于PBS）混合（质粒终浓度：0.06 µg/µL）。
- 使用拉针仪，采用长度为10 cm、外径为1.5 mm、内径为0.86 mm的玻璃毛细管拉制微电极。
- 用无菌镊子小心折断微量移液器尖端（2-3 mm）。
- 将微量移液器装入连接至显微注射仪的微毛细管尖端。确保显微注射仪已连接至显微注射装置，并且氮气储备充足，以校准微量移液器。
- 将微移液管连接至显微注射仪后，用快绿染料溶液（1 µg/µL，溶于PBS）填充微移液管以进行校准。校准微移液管，....
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结果
常规实验流程结果（图6)
在本研究中，共有三个被操纵的组别，包括注射了通用CRISPR Cas9对照质粒（Cas9 Control）、激活对照CRISPR质粒（Act Control）或一个 IGF-1 SAM激活质粒（Igf1-OE）。Cas9对照更适合敲除质粒，而激活对照更适合过表达/激活质粒。用于评估通过操控胎盘所引起的活力变化 通过 注射与电穿孔后，于E14.5分析同窝胚胎的存活情况（图6A）。选择这一时间点是因为其他已开展的研究也曾进行过该操作 体内 通过电穿孔插入CRISPR质粒已表明，可在8–22小时内实现基因表达变化30,31,32在E14.5时进行收集，可使CRISPR质粒有大约48小时的.......
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讨论
胎盘是胎儿生长的主要调控器官，如前所述，胎盘基因表达或功能的改变可能对胎儿发育产生显著影响6. 本方案可用于进行靶向 体内 利用相对先进的手术方法对小鼠胎盘进行CRISPR操作。该技术可获得大量存活胚胎及其对应胎盘，可用于后续研究图6A,B）。该技术使我们能够成功地过表达胎盘 IGF-1 在 E14.5（图7A,B）。所使用的质粒具有特异性，因为插入的质粒保留在经操作的胎盘中，而在相邻未处理的胎盘中未检测到。图7C,D）。其空间分布 IGF-1 通过FISH检测dCas9-3xNLS-VP64和Prl8a8的激活质粒，结果表明该激活质粒存在于IGF1-OE胎盘的三个亚区中，而在未经处理的胎盘任何亚区中均不存在图7E
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢以下资助来源：R01 MH122435、NIH T32GM008629 和 NIH T32GM145441。作者感谢爱荷华大学的 Val Sheffield 博士和 Calvin Carter 博士实验室提供手术室和设备的使用，同时也感谢 Eric Van Otterloo 博士、Nandakumar Narayanan 博士和 Matthew Weber 博士在显微成像方面的协助。作者还感谢 Sara Maurer 博士、Maya Evans 和 Sreelekha Kundu 在初步手术中的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 ml 离心管 | USA Scientific 公司 | 1615-5500 | |
| PBS 中的 4% 多聚甲醛（PFA） | 赛默飞世尔科技 | J61899.AP | |
| 96孔板 | 科宁斯 | 3598 | 对于BCA试剂盒 |
| 吸水垫 | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| 激活对照质粒 | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | 用于稀释的无DNase水 |
| AMV逆转录酶 | New England Biolabs | M0277L | 用于cDNA合成 |
| 麻醉气体蒸发器 | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact 蒸发器 |
| 人工泪液凝胶 | 阿克恩 | NDC 59399-162-35 | |
| BCA 蛋白检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | 23227 | 蛋白质定量 |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | 手持式组织匀浆器 |
| CellSens 软件 | Olympus | V4.1.1 | FISH图像的图像处理 |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628168 | 平板离心机 |
| 氯仿 | 赛默飞世尔科技 | J67241-AP | RNA提取 |
| 棉签 | ProAdvantage | 77100 | 使用前灭菌 |
| CRISPR/Cas9 对照质粒 | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | 用于稀释的无DNase水 |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| 解剖显微镜 | Leica | M125 C | 用于尸体解剖后成像 |
| 可吸收缝线 | 医学与兽医国际 | J385H | |
| 蒸馏水 | Gibco | 15230162 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | 赛默飞世尔科技 | 14190144 | (-) 钙；(-) 镁 |
| ECM 830 电穿孔仪（电穿孔设备） | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | 发电机仅 |
| 电动剃须刀 | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| 电穿孔板/镊子电极 | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm 直径电极片；包含导线 |
| 包埋盒：250 个/包 | 格雷格纳 | 21RK94 | 胎盘包埋盒 |
| 乙醇 | 赛默飞世尔科技 | 268280010 | |
| F-Air 采气罐 | Penn Veterinary Supply 公司 | BIC80120 | 过量异氟烷过滤器 |
| 快绿FCF染料 | Sigma | F7252-5G | 溶解至1 μg/ml，过滤；避光 |
| 基于滤光片的微孔板光度计（酶标仪） | Fisher Scientific | 14377576 | 可用于 BCA 和 ELISA |
| 镊子 | VWR | 82027-386 | 精细尖头，直刃，锯齿状 |
| 中性缓冲福尔马林溶液，10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| 玻璃毛细管 - 硼硅酸盐玻璃（微量移液管） | Sutter Instrument | B150-86-10 | 外径：1.5 mm，内径：0.86 mm，长度：10 cm |
| Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液（100倍浓缩） | 赛默飞世尔科技 | 1861281 | 蛋白匀浆缓冲液 |
| 加热垫 | Thermotech | S766D | 数字控温加热湿敷垫 |
| 止血钳 | VWR | 10806-188 | 完全饱和的下颌；弯曲 |
| 热水浴 | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM 质粒 (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | 用于稀释的无DNase水 |
| 诱导室 | Vetamac | 941443 | 无需特定的升数规格 |
| 异氟烷 | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| 异丙醇/2-丙醇 | Fisher Scientific | A451-4 | RNA 提取 |
| 盐酸氯胺酮 100 mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/氯化镁 | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M 蛋白匀浆缓冲液 |
| MicroAmp™ 带条形码的光学384孔反应板 | Fisher Scientific | 4309849 | 无需条形码板 |
| 微毛细管尖端 | Eppendorf | 5196082001 | 连接至 BTX 显微注射仪 |
| 显微注射仪 | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 | 不锈钢移液器架，130 mm 长，适用于 1 至 1.5 mm 移液器 |
| Microject 1000A（注射装置） | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus 系统 |
| 显微注射仪 P-97 型 | Sutter Instrument | P-97 | Flaming/Brown型微电极拉制仪 |
| 微孔板混合器（板式摇床） | scilogex | 822000049999 | |
| 小鼠/大鼠IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA试剂盒 | R & D Systems | MG100 | |
| 针头 | BD - 贝克顿·迪金森公司 | 305106 | 30 G × 1/2（0.3 mm × 13 mm） |
| 氮气罐 | Linde | 7727-37-9 | 任何惰性气体 |
| 非甾体抗炎药（NSAID） | 诺布鲁克实验室有限公司 | NDC 55529-040-10 | 镇痛药，例如美洛昔康 |
| 鼻锥 | Vetamac | 921609 | 9-14 毫米 |
| Opal 620 检测染料 | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | 用于FISH |
| 最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂 | 樱花 | 4583 | |
| 氧气瓶 | Linde | 7782 - 44 - 7 | 医用级氧气 |
| 研钵杵 | USA Scientific 公司 | 14155390 | |
| 聚维酮碘溶液，5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Power SYBR™ 绿色 PCR 预混液 | 赛默飞世尔科技 | 4367659 | 用于qPCR |
| 随机六聚体（随机引物） | 新英格兰生物实验室 | S1330S | 用于cDNA合成 |
| 剃刀刀片 | 格雷格纳 | 26X080 | |
| RNA纯化试剂盒 &和浓缩器 | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | 赛默飞世尔科技 | AM7021 | |
| RNAscope试剂盒v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | 包含荧光原位杂交所需的所有试剂。探针需单独购买。 |
| RNAscope™ 探针-Mm-Prl8a8-C2 | Advanced Cells Diagnostics | 528641-C2 | |
| RNAscope™ 探针-载体-dCas9-3xNLS-VP64 | Advanced Cells Diagnostics | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | 基准测试 | R2020 | 原位杂交用干烤箱 |
| 剪刀 | VWR | 82027-578 | 解剖剪，尖头，4¹/? |
| 氯化钠（生理盐水） | Hospra | NDC 0409-4888-03 | 无菌的， 0.9% |
| 柠檬酸钠二水合物，三钠盐，[柠檬酸三钠二水合物] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Fisher Chemical 1N 氢氧化钠浓缩液 | Fisher Scientific | SS277 | 蛋白匀浆缓冲液 |
| 蒸锅 | 贝拉 | B00DPX8UBA | |
| 无菌手术巾 | Busse | 696 | 使用前灭菌 |
| Superfrost Plus 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath 盖玻片 24x60 | Leica | 3800160 | |
| 注射器 | BD - 贝克顿·迪金森公司 | 309659 | BD鲁尔滑动针头注射器，无菌，一次性使用，1 mL |
| 赛默飞世尔科技™ Invitrogen™ Nanodrop™ 一台带WiFi功能的Qubit荧光计™ 4 氟光计 | Fisher Scientific | 13-400-525 | 此配置随 Qubit 4 荧光仪提供。 无需进行Qubit定量。 |
| 组织粘合剂 | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | 赛默飞世尔科技 | 15568025 | 1M 蛋白匀浆缓冲液 |
| TRIzol™ 试剂 | 赛默飞世尔科技 | 15596018 | RNA 提取 |
| TSA缓冲液套装 | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | 用于稀释 Opal 620 检测染料 |
| 通用F-电路 | Vetamac | 40200 | 连接至蒸发器及蒸发器配件 |
| 正置复合荧光显微镜 | 奥林巴斯 | BX61VS | 用于FISH成像 |
| 含DAPI的Vectorshield | Vector Laboratories | H-1200 | 盖玻片封片介质 |
| ViiA™ 7实时荧光定量PCR系统，配备384孔反应模块 | 赛默飞世尔科技 | 4453536 | 这是用于SYBR 384孔板检测。 TaqMan 和/或较小的片段可供使用 |
| Wet n Wild 指甲油 Wild Shine，透明指甲保护剂，指甲彩绘 | 亚马逊 | C450B | |
| 赛拉嗪 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
参考文献
- Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
- Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
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