小鼠 体内 胎盘靶向CRISPR操作

摘要

在这里，我们描述了一种时间特异性方法，以有效操纵 体内小鼠胎盘中的关键发育途径。这是通过在胚胎第12.5天将CRISPR质粒注射和电穿孔到妊娠母亲的胎盘中进行的。

摘要

胎盘是调节和维持子宫 内哺乳动物发育的重要器官。胎盘负责母亲和胎儿之间营养物质和废物的转移以及生长因子和激素的产生和输送。小鼠胎盘遗传操作对于了解胎盘在产前发育中的特定作用至关重要。表达胎盘特异性Cre的转基因小鼠具有不同的有效性，其他胎盘基因操作方法可能是有用的替代方案。本文描述了一种利用CRISPR基因操作直接改变胎盘基因表达的技术，可用于修饰靶基因的表达。使用相对先进的手术方法，怀孕的母亲在胚胎第12.5天（E12.5）进行剖腹手术，并通过玻璃微量移液器将CRISPR质粒输送到单个胎盘中。质粒在每次进样后立即电穿孔。母体恢复后，胎盘和胚胎可以继续发育，直到稍后的时间点进行评估。使用该技术后对胎盘和后代的评估可以确定时间特异性胎盘功能在发育中的作用。这种类型的操作将允许更好地了解胎盘遗传学和功能如何影响多种疾病背景下的胎儿生长和发育。

引言

胎盘是参与胎儿发育的重要器官。胎盘的主要作用是提供基本因素并调节营养物质和废物与胎儿之间的转移。哺乳动物胎盘由胎儿和母体组织组成，它们构成了胎母界面，因此，母体和胎儿的遗传学影响功能¹。胎盘的遗传异常或功能受损会极大地改变胎儿的发育。先前的工作表明，胎盘遗传学和发育与胎儿特定器官系统的发育改变有关。特别是，胎盘异常与胎儿大脑，心脏和血管系统的变化有关²，³，^4，5。

激素、生长因子和其他分子从胎盘到胎儿的运输在胎儿发育中起着重要作用⁶。已经表明，改变特定分子的胎盘产生可以改变神经发育。母体炎症可以通过改变胎盘中的色氨酸（TRP）代谢基因表达来增加血清素的产生，从而在^{胎儿大脑中}产生血清素7。其他研究发现胎盘异常与心脏缺陷。胎盘异常被认为会导致先天性心脏缺陷，这是人类最常见的出生缺陷⁸。最近的一项研究已经确定了几个在胎盘和心脏中具有相似细胞途径的基因。如果被破坏，这些途径可能会导致两个器官的缺陷⁹。胎盘缺陷可能会加剧先天性心脏缺陷。胎盘遗传学和功能对特定胎儿器官系统发育的作用是一个新兴的研究领域。

小鼠具有血绒毛膜胎盘和人类胎盘的其他特征，这使它们成为研究人类疾病的非常有用的模型¹。尽管胎盘很重要，但目前缺乏有针对性的体内基因操作。此外，目前有更多的选择可用于敲除或敲低，而不是胎盘中的过表达或功能获得操作¹⁰。有几种表达Cre的转基因系用于胎盘特异性操作，每种系在不同的时间点位于不同的滋养层谱系中。这些包括Cyp19-Cre，Ada/Tpbpa-Cre，PDGFRα-CreER和Gcm1-Cre 11，¹²，^13，14。虽然这些Cre转基因是有效的，但它们可能无法在特定的时间点操纵某些基因。敲除或过表达胎盘基因表达的另一种常用方法是将慢病毒载体插入囊胚培养物中，这会导致滋养层特异性遗传操作^15，16。该技术允许胎盘基因表达在发育早期发生强劲变化。RNA干扰在体内的使用在胎盘中很少使用。shRNA质粒的插入可以类似于本文中描述的CRIPSR技术进行。这已在E13.5完成，以成功降低胎盘中的PlGF表达，对后代脑脉管系统产生影响¹⁷。

除了主要用于敲除或敲低的技术外，诱导过表达通常使用腺病毒或插入外源性蛋白进行。用于过表达的技术具有不同的成功率，并且大多在妊娠后期进行。为了研究胰岛素样生长因子1（IGF-1）在胎盘功能中的作用，进行了腺病毒介导的胎盘基因转移以诱导IGF-1基因^18，19的过表达。这是在小鼠妊娠后期通过直接胎盘注射在E18.5上进行的。为了提供额外的选择并规避已建立的胎盘遗传操作的可能失败，例如Cre-Lox组合失败，腺病毒的可能毒性以及shRNA的脱靶效应，可以使用胎盘的体内直接CRISPR操作²⁰，^21，22。开发该模型是为了解决缺乏过表达模型的问题，并创建一个具有灵活性的模型。

该技术基于Lecuyer等人的工作，其中shRNA和CRISPR质粒在体内直接靶向小鼠胎盘以改变PlGF表达¹⁷。该技术可用于在多个时间点使用CRISPR操作直接改变胎盘基因表达;对于这项工作，选择了E12.5。此时胎盘已经成熟，并且足够大，可以操纵，允许在E12.5上插入特定的CRISPR质粒，这可能对怀孕中晚期的胎儿发育产生重大影响^23，24。与转基因方法不同，但与病毒诱导或RNA干扰类似，该技术允许使用相对先进的手术方法在特定时间点进行过表达或敲除，从而避免早期变化可能造成的胎盘受损或胚胎致死性。由于只有少数胎盘在一窝中接受实验质粒或对照质粒，因此该方法允许两种类型的内部对照。这些质控品是用适当的对照质粒进样和电穿孔的质粒，以及未接受直接操作的质粒。该技术经过优化，通过协同激活介质（SAM）CRISPR质粒在小鼠胎盘中产生IGF-1基因的过表达。选择了 IGF-1 基因，因为 IGF-1 是一种主要的生长激素，主要在出生前在胎盘中产生^25，26.这种新的胎盘靶向CRISPR技术将允许直接操作，以帮助确定胎盘功能与胎儿发育之间的联系。

方案

所有程序均按照联邦法规和爱荷华大学政策执行，并得到机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 畜牧业

1. 将动物保持在12小时的日光循环 中，随意进食和水。
2. 使用8-15周龄的CD-1雌性小鼠。使用交配插头的存在来识别 E0.5。
3. 在E0.5上，单独容纳怀孕的水坝。

2. 微量移液器的校准

注意:微量移液器的校准应在手术前尽可能进行。

1. 在制作和校准微量移液器之前，将所有质粒稀释至无DNA酶水中的推荐浓度（0.1μg/μL）。将质粒与适当稀释的快速绿染料（PBS 中的 1 μg/μL）（最终质粒浓度:0.06 μg/μL）混合。
2. 使用外径为1.5 mm，内径为0.86 mm的10 cm玻璃毛细管拉动微量移液器。
3. 用无菌镊子小心地折断微量移液器（2-3毫米）的尖端。
4. 将微量移液器装入连接到微量注射器的微毛细管尖端中。确保微量注射器连接到显微注射机，并且有足够的氮气水平来校准微量移液器。
5. 将微量移液器连接到微量进样器后，用Fast Green染料溶液加载以执行校准（PBS中为1μg/μL）。校准微量移液器以注入约3.5μL的体积。 清空（"清除"）微量移液器以准备加载质粒溶液，如下所示。
   注意:每个微量移液器略有不同。为避免在注射过程中损坏胎盘，注射时间应设置在0.5-1.5秒之间。压力应设置在 1-8.5 psi 之间。分别校准每个微量移液器;如果微量移液器无法在这些参数内校准，则不应使用。

3. 手术（图1A）

注意:要准备，请用70%乙醇清洁准备和手术区域的表面。在准备区域放置吸收性垫。在手术区域，放一个加热垫，然后在上面放一个吸收垫。手术前对所有工具进行消毒。大坝麻醉的时间应在1小时内。

1. 麻醉
   1. 在手术前30分钟至1小时向妊娠母亲施用5mg / kg非甾体抗炎药（美洛昔康）或其他批准的镇痛药。
   2. 将怀孕的大坝放在连接到异氟烷蒸发器的诱导室中。
   3. 将蒸发器设置为 4% 异氟醚和 3.5 L/min 氧气。
   4. 一旦确认麻醉对脚趾夹伤和呼吸频率降低缺乏反应，将大坝从诱导室移至准备区域。
2. 手术准备
   1. 在准备区域，用鼻锥仰卧位大坝。
   2. 当大坝在鼻锥中时，将蒸发器减少到 2% 异氟醚和 3.5 L/min 氧气。
   3. 彻底剃掉大坝的腹部并去除多余的皮毛。使用无菌棉头涂抹器，用聚维酮溶液和 70% 乙醇交替涂覆剃光的腹部 3 次。涂上聚维酮溶液的最后一层。为防止角膜干燥，将人工泪液凝胶放在大坝的双眼上（图2A，B）。
   4. 准备好后，将带有鼻锥的大坝移动到指定的手术区域。
3. 子宫剖腹手术
   注意:在整个手术过程中使用无菌手套。如果接触任何非无菌表面，请更换手套。
   1. 在手术区域，将大坝仰卧，并用胶带将鼻锥固定到位。将吸收垫下方的加热垫设置为45°C。
   2. 使用镊子和剪刀，在皮肤上做一个大约 2 厘米的中线切口。用镊子撑开皮肤，并在皮肤上做一个垂直切口。在此之后，通过腹膜做另一个类似大小的切口以露出子宫角。使用镊子，在垂直切口的同时撑起腹膜（图2C，D）。
      注意:切开腹膜时未能正确搭帐篷可能会导致肠道致命切口。
   3. 通过按压腹部两侧，通过切口轻轻按摩子宫角。通过不使用工具小心地引导子宫来做到这一点，只用手指以避免意外伤害。将暴露的子宫放在覆盖大坝腹部的无菌手术窗帘上，并在整个手术过程中用无菌盐水滴保持湿润，可以根据需要使用前将其加热至30°C（图2E，F）。
      注意:子宫角可以按照Wang等人²⁷中的描述进行识别。
   4. 一旦子宫暴露，选择三对胎盘进行操作。
      注意:胎盘可以按照Elmore等人²⁴的描述进行识别。为了最大限度地提高胚胎的存活率，不应治疗超过6个胎盘。如果胚胎少于12个，则不应注射超过4个胎盘。选择两个相邻的胎盘，使一个接受对照注射，另一个接受实验质粒。使用两个相邻的胎盘可以更好地比较子宫中相似位置的胎盘，还可以提高存活率。所选胎盘对是随机选择的，并在整个子宫角中间隔开（图1B）。
   5. 记录胎盘操作的位置和胚胎在子宫角内的组织，以便在收集过程中可以识别胚胎和胎盘，因为一个母亲将携带对照和实验处理的胎盘/胚胎。
4. 胎盘注射和对照质粒电穿孔
   注意:为保持无菌技术，请在使用前用冷灭菌剂对电穿孔桨和显微注射器进行消毒。如果接触任何非无菌表面，请更换手套。
   1. 使用校准的微量移液器，加载足够量的适当对照质粒进行三次进样。在~0.5mm的深度横向进行所有注射到蜕膜（白色）和交界区（深红色）之间的胎盘中（图3A-F）。
   2. 在三个对照胎盘中进行注射。
      注意:在实验进样之前执行所有对照质粒进样，以避免质粒与微量移液器交叉污染。这将允许使用相同的微量移液器，因为更换微量移液器和校准时间会大大增加手术时间并降低大坝的存活率。
   3. 在注射后2分钟内对对照质粒注射的胎盘进行电穿孔。
   4. 对于电穿孔，请使用连接到电穿孔机的一对 3 毫米桨。为确保CRISPR掺入效率和胚胎的活力，请使用以下电穿孔设置:2脉冲，30 V，30 ms脉冲，970 ms脉冲关闭，单极性。
   5. 注射后但在电穿孔前，用无菌盐水涂覆接触部位，用滴管或注射器将盐水精确地涂抹在子宫壁和桨上的三个部位。
   6. 轻轻按压胎盘侧面的电穿孔桨。将阳极桨放在注射部位和正对的阴极上（图4A-C）。
   7. 按压电穿孔机上的脉冲，等待两个脉冲完成，然后再取出电穿孔桨。
      注意:在脉冲期间，桨和胎盘之间经常看到少量白色泡沫。如果没有发生这种情况，请在进一步使用前用电压表检查桨的电压。如果电压表上的读数与电穿孔电压设置不匹配，则拨片不起作用。
5. 胎盘注射和实验质粒电穿孔
   1. 按照步骤 3.4.1 中的相同说明进行操作。到步骤 3.4.2。使用实验质粒代替对照质粒。
   2. 在注射后2分钟内对所有三个实验性注射胎盘进行电穿孔。这应以与注射对照质粒相同的方式进行。按照步骤 3.4.4 操作。到步骤 3.4.7。
6. 手术完成
   1. 胎盘操作完成后，仅用手指轻轻按摩腹腔内的子宫角（图5A）。
   2. 首先，使用45厘米长的涂层和编织可溶解缝合线和13毫米3/8c针合金在腹膜层上进行双结单缝合。将缝合线间隔2-3毫米（图5B）。
   3. 缝合腹膜层后，用可溶解的缝合线缝合皮肤。将单缝线打结三重，间隔2-3毫米，以确保大坝无法解开缝合（图5C）。
   4. 缝合完成后，将异氟醚设置为1%，将氧气设置为3.5 L / min，并将组织粘合剂涂在皮肤上的缝合线上（图5D）。
      注意:纸巾粘合剂是可选的，但建议使用，以防止由于大坝咀嚼而重新打开切口。
   5. 当组织粘合剂干燥后，关闭蒸发器，并从手术区域取出大坝。将大坝放在背上的支撑笼中。

4. 术后护理和监测

1. 让怀孕的大坝在监督下的干净笼子中休养至少 30 分钟，以确保手术没有立即并发症。观察，直到它完全走动并且可以在没有帮助的情况下翻转站起来。手术后单独安置大坝。
2. 遵循机构术后护理和监测，直到胚胎采集。记录坝重，并每天监测缝合线和切口部位。

5. E14.5胎盘采集

1. 在 E14.5 上，用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物（1 mg/mL 氯胺酮和 0.1 mg/mL 甲苯噻嗪）深度麻醉大坝，然后颈椎脱臼大坝。
2. 用剪刀在大坝腹部做一个V形切口，然后切除子宫。立即放在冰上的5厘米培养皿上。使用镊子，小心地从子宫中取出胚胎和相应的胎盘。
   注意:记录胚胎位置和子宫角中的相应胎盘，以确定在手术过程中接受直接操作的胎盘。
3. 记录胎盘重量。使用不含RNA酶的镊子和剃须刀，将胎盘从中线切成两半。将一半放入4°C的4%PFA中。 再次将剩余的一半切成两半，并将剩余的四分之一在-80°C下储存在两个管中，一个装有RNA储存试剂。
   注意:胚胎和其他母体组织可以从收集中储存在-80°C以备将来使用。

6. 胎盘基因表达分析

1. 使用在RNA储存试剂中储存在-80°C的胎盘的四分之一。
2. 如Elser等人所述，使用Trizol方法进行RNA分离，分光光度计进行RNA浓度，cDNA合成试剂盒以及使用SYBR绿色预混液²⁸的qPCR，处理胎盘以进行qPCR。代替Elser等人引用的Turbo DNAfree试剂盒DNAse，在Trizol RNA分离后使用RNAcleanup试剂盒，以确保样品不含污染物²⁸。
   注意:阅读Trizol的材料安全数据表（MSDS），并在化学通风橱中使用它。
3. 用GFP引物评估对照质粒的质粒插入和用BLAST引物（ 补充表1中列出的引物）的实验质粒插入。使用CT值确定质粒的存在。
   注意:CT值高于35是假阳性，只有低于35的CT值才应被视为质粒已成功插入的阳性指标。
4. 评估归一化为管家基因的 IGF-1 胎盘表达 18s （ 补充表1中列出的引物）。使用ddCT方法计算倍数变化，然后计算实验样品的归一化倍数变化到对照样品的平均倍数变化。

7. 胎盘蛋白水平分析

1. 使用储存在-80°C的胎盘的四分之一。 在由 11.5 mM Tris HCl、5 mM MgCl₂ 和 10 mM 蛋白酶抑制剂制成的缓冲溶液中匀浆组织，最终 pH_值为 7.4。使用手持式均质器和杵分解组织。
   注意:样品不应超过缓冲液体积的10%。
2. 在缓冲液中以1:12稀释匀浆样品，使其在二辛可宁酸测定（BCA）试剂盒的可检测范围内。根据制造商的说明进行BCA测定，并使用酶标仪定量总蛋白质。
3. 进行BCA测定后，将所有样品标准化为IGF-1 ELISA的相同总蛋白质浓度2mg / mL，如Gumusoglu等人所做的^那样29。
4. 根据制造商的说明执行 IGF-1 ELISA， 并使用标准浓度曲线用酶标仪定量 IGF-1 蛋白水平.

8. 使用荧光 原位 杂交标记的空间CRIPSR验证

1. 将胎盘两半在4°C的4%PFA中适当固定1-3天后，将它们在4°C下移动到20%蔗糖中，然后在最佳切割温度（OCT）化合物中冷冻。
2. 将OCT包埋的胎盘在-20°C低温恒温器中连续切片成10μm切片，并将它们放在要标记的载玻片上。将胎盘切成两半，以便所有三个子区域都可见。将载玻片储存在-80°C直至用于 原位 杂交。
3. 按照制造商的方案进行荧光 原位 杂交（FISH）标记。用dCas9-3xNLS-VP64探针杂交一张载玻片，用Prl8a8探针杂交同一胎盘的第二张"姐妹"载玻片。
   注意:dCas9-3xNLS-VP64探针检测过表达质粒的存在。Prl8a8探针突出显示了交界区的海绵养层，这使得胎盘的亚区域是可识别的。这两个探针标记在单独的"姐妹"载玻片上，以避免多通道荧光对胎盘中的绿色自发荧光的干扰。
4. 用检测染料（Opal 620）标记两个探针。完成制造商的 FISH 协议后，应用 DAPI 安装介质，并在载玻片上放置盖玻片。用透明指甲油密封盖玻片。
5. 在正置复合荧光显微镜上对载玻片进行成像，并使用适当的图像处理软件对其进行处理。这里使用了CellSens软件。

结果

一般手术结果（图6）
在这项研究中，有三个纵的组。这些包括注射普通CRISPR Cas9对照质粒（Cas9对照），活化对照CRISPR质粒（行动对照）或IGF-1 SAM活化质粒（Igf1-OE）的胎盘。Cas9对照更适合敲除质粒，活化对照更适合过表达/活化质粒。为了评估通过注射和电穿孔操纵胎盘引起的活力变化，在E14.5上分析了垫料中的胚胎存活率（图6A）。选择该时间点是因为使用电穿孔进行CRISPR质粒体内插入的其他研究表明，表达变化可以在8-22小时内实现³⁰，^31，32。在E14.5处收集允许CRISPR质粒整合并激活基因表达的增加约48小时。结果发现，手术操作大坝影响了所有胚胎的存活，但与接受注射和...

讨论

胎盘是胎儿生长的主要调节因子，如前所述，胎盘基因表达或功能的变化可能会显着影响胎儿发育⁶。这里概述的方案可用于使用相对先进的手术方法对小鼠胎盘进行靶向体内CRISPR操作。该技术允许大量可存活的胚胎及其相应的胎盘，可用于进一步研究（图6A，B）。这项技术使我们能够成功地在E14.5上过表达胎盘IGF-1（图7A，B）。使用的质粒显示出特异性，因为插入的质粒保留在操纵的胎盘中，并且不存在于相邻的未处理胎盘中（图7C，D）。FISH 确认了 dCas9-3xNLS-VP64 和 Prl8a8 的 IGF-1 活化质粒的空间分布，这表明活化质粒存在于 IGF1-OE 胎盘的三个亚区中，而不是存在于未处理胎盘的任何亚区（图 7...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 ml 管	USA Scientific Inc	1615-5500
4% Paraformeldhyde （PFA） 在 PBS	Thermo Fisher Scientific	J61899 中。
96 孔板	康宁斯	3598	用于 BCA 试剂盒
吸收性底垫	Fisher Scientific	14-206-62
活化对照质粒	Santa Cruz Biotechnology	sc-437275	用于稀释的不含 Dnase 的水
AMV 逆转录酶	New England Biolabs	M0277L	用于 cDNA 合成
麻醉剂气体蒸发器	Vetamac	VAD-601TT	VAD 紧凑型蒸发器
人工泪液凝胶	Akorn	NDC 59399-162-35
BCA 蛋白质检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	23227	蛋白质定量
Biovortexer	Bellco Glass， Inc.	198050000	手持式组织匀浆器
CellSens 软件	Olympus	V4.1.1	图像处理到 FISH 图像。
离心机 5810	Eppendorf	EP022628168	板离心机
氯仿	Thermo Fisher Scientific	J67241-AP	RNA 分离
棉签涂抹器	ProAdvantage	77100	使用前消毒
CRISPR/Cas9 对照质粒	Santa Cruz Biotechnology	sc-418922	提供用于稀释的不含 DNA 酶的水
CryoStat	Leica	CM1950
解剖显微镜	Leica	M125 C	用于坏死镜后成像
可溶性缝合线	Med Vet International	J385H
蒸馏水	Gibco	15230162
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS）	Thermo Fisher Scientific	14190144	（-） 钙;(-)镁
ECM 830 电穿孔仪（电穿孔机）	BTX 哈佛仪器	45-0662	仅发生器
电动剃须刀	Wahl	CL9990	Kent Scientific
电穿孔桨/镊子	BTX 哈佛仪器	45-0487	3 毫米直径桨;包括电线
嵌入盒：250 PK	Grainger	21RK94	胎盘包埋盒
乙醇	Thermo Fisher Scientific	268280010
F-Air 罐	Penn Veterinary Supply Inc	BIC80120	过量的异氟醚过滤器
固绿染料 FCF	Sigma	F7252-5G	溶解至 1 &μ;g/ml 和过滤器;避光
基于滤光片的微孔板光度计（读板器）	Fisher Scientific	14377576	可用于 BCA 和 ELISA
镊子	VWR	82027-386	细头，直，锯齿状
福尔马林溶液，中性缓冲，10%	Sigma Aldrich	HT501128
玻璃毛细管 - 硼硅酸盐玻璃（微量移液器）	萨特仪器	B150-86-10	外径：1.5 毫米，内径：0.86 毫米，长度 10 厘米
停止蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 （100x）	Thermo Scientific	1861281	蛋白质匀浆缓冲液
加热垫	Thermotech	S766D	手指湿式加热垫
止血钳	VWR	10806-188	完全膨胀的下巴;弯曲
热水浴	Fisher Scientific	20253	Isotemp 205
Igf-1 SAM 质粒 （m1）	Santa Cruz Biotechnology	sc-421056-ACT	提供用于稀释的不含 Dnase 的水
诱导室	Vetamac	941443	无需特定升大小
氟醚	Piramal Pharma Limited	NDC 66794-013-25
异丙醛/2-丙氨酸	Fisher Scientific	A451-4	RNA 分离
盐酸氯胺酮 100mg/ml	Akorn	NDC 59399-114-10
MgCl2/氯化镁	Sigma Aldrich	63069-100ML	1M。蛋白质匀浆缓冲液
MicroAmp™带条形码的光学 384 孔反应板	Fisher Scientific	4309849	无需条形码板
微量毛细管尖端	Eppendorf	5196082001	连接到 BTX 显微
注射器	BTX 哈佛仪器	45-0766	不锈钢移液器支架，130 mm 长，用于 1 至 1.5 mm 移液器
Microject 1000A（注射机）	BTX Harvard 仪器	45-0751	MicroJect 1000A Plus 系统
微量移液器拉拔器 型号 P-97	萨特仪器	P-97	火焰/棕色微量移液器拉拔器
微孔板混合器（平板摇床）	scilogex	822000049999
小鼠/大鼠 IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA 试剂盒	R &D Systems	MG100
针	BD - Becton， Dickson and Company	305106	30 Gx 1/2 （0.3 mm x 13 mm）
氮气罐	Linde	7727-37-9	任何内分泌气体
非甾体抗炎药 （NSAID）	Norbrook Laboratories Limited	NDC 55529-040-10	美洛昔康等镇痛药
锥	Vetamac	921609	9-14 mm
蛋白石 620 检测染料	Akoya Biosciences	SKU FP1495001KT	用于 FISH
最佳切割温度 （O.C.T） 化合物	Sakura	4583
氧气罐	Linde	7782 - 44 - 7	医用级氧气
杵	USA Scientific Inc	14155390
聚维酮碘溶液，5%	Avrio Health L.P.	NDC 67618-155-16
电力 SYBR™绿色 PCR 预混液	Thermo Fisher Scientific	4367659	用于 qPCR
随机 Hexamers（随机引物）	New England Biolabs	S1330S	用于 cDNA 合成
Razor Blade	Grainger	26X080
RNA 纯化试剂盒 &浓缩仪	Zymo Research	R1013
RNALater	Thermo Fisher Scientific	AM7021
RNAscope kit v.2.5	Advanced Cells Diagnostics	323100	包含荧光原位杂交所需的所有试剂。探头单独出售。
RNAscope™探针 - MM-PRL8A8-C2	Advanced Cells Diagnostics	528641-C2
RNAscope™探针-Vector-dCas9-3xNLS-VP64	高级细胞诊断	527421
Roto-Therm Mini	Benchmark	R2020	原位杂交干烘箱
剪刀	VWR	82027-578	解剖剪刀，尖锐的尖端，4¹/？
氯化钠（盐水）	Hospra	NDC 0409-4888-03	无菌，  0.9%
柠檬酸钠、三钠盐、二水合物、[柠檬酸、二水合三钠]	Research Product International	03-04-6132
氢氧化钠 1N 浓缩液，Fisher Chemical	Fisher Scientific	SS277	蛋白质匀浆缓冲液
	Bella	B00DPX8UBA
无菌手术单	Busse	696	使用前消毒
Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
Surgipath 盖玻片 24x60	Leica	3800160
注射器	BD - Becton， Dickson， and Company	309659	BD 鲁尔滑头注射器 无菌，一次性使用，1 mL
Thermo Scientific™Invitrogen™纳米滴™一台带 WiFi 和 Qubit&trade 的分光光度计;4荧光计	Fisher Scientific	13-400-525	此配置配有Qubit 4荧光计。不需要 Qubit 定量。
组织胶粘剂	3M	1469SB	VetBond
Tris HCl	Thermo Fisher Scientific	15568025	1M. 蛋白质匀浆缓冲液
TRIzol™试剂	Thermo Fisher Scientific	15596018	RNA 分离
TSA 缓冲液包	Advanced Cells Diagnostics	322810	用于稀释 Opal 620 检测染料
通用 F 回路	Vetamac	40200	连接到蒸发器和蒸发器附件
正置化合物荧光显微镜	Olympus	BX61VS	用于 FISH 成像
含 DAPI	Vectorshield Vector Laboratories	H-1200	盖玻片封固剂
ViiA™ 7 实时 PCR 系统，含 384 孔模块	Fisher Scientific	4453536	这是用于 SYBR 384 孔模块检测的。提供 TaqMan 和/或更小的模块
Wet n Wild 指甲油 Wild Shine、Clear Nail Protector、指甲油	Amazon	C450B
甲苯噻嗪 20mg/ml	酥油	343730_RX