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高效且一致地从人眼生成用于组织学分析的视网膜色素上皮/脉络膜平铺标本

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DOI：

10.3791/64761

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2022年10月28日

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1Ocular and Stem Cell Translational Research Section, National Eye Institute, National Institutes of Health (NIH)

本文内容

摘要

我们介绍一种高效分离人眼视网膜色素上皮（RPE）与视网膜的方法，并制备完整的RPE/脉络膜铺片，用于对RPE进行组织学和形态计量学分析。

摘要

视网膜色素上皮（RPE）与视网膜是功能和结构上相互关联的组织，共同协作以调控光感知和视觉。RPE顶膜表面的蛋白质与光感受器外节表面的蛋白质紧密连接，导致RPE与光感受器/视网膜难以稳定分离。我们开发了一种方法，可高效分离人眼中的视网膜与RPE，从而制备完整的RPE/脉络膜和视网膜平铺标本，以便分别对光感受器和RPE细胞进行细胞水平分析。通过玻璃体内注射高渗的D-甘露醇溶液（一种不被RPE转运的糖类），可在整个眼球后房诱导RPE与视网膜分离，且不损伤RPE细胞间的连接结构。未观察到任何RPE组织残留在视网膜上。使用鬼笔环肽标记肌动蛋白显示RPE细胞形态得以良好保存，可对整个上皮层进行形态计量分析。我们开发了一种基于人工智能（AI）的软件，能够准确识别并分割RPE细胞边界，并量化30种不同的形态参数。该解剖方法具有高度可重复性，且可轻松推广至其他动物模型。

引言

视网膜色素上皮（RPE）与神经视网膜之间由于光感受器对RPE存在强烈的生理依赖性，因而彼此紧密相连。在解剖过程中，将神经视网膜从RPE上机械分离会导致RPE细胞撕裂，RPE的顶端部分会残留在视网膜光感受器的外节上。RPE与视网膜之间的黏附程度非常强，以至于分离后残留在视网膜上的色素量可用于量化视网膜黏附强度1。具体而言，在机械分离过程中，位于RPE顶端的紧密连接及其相连的肌动蛋白结构会发生断裂。因此，对RPE平铺标本进行细胞边界染色时，会呈现出斑片状的单层结构，其中许多细胞的边界缺失。若在解剖前使用多聚甲醛（PFA）固定组织，该现象会更加明显，因为蛋白质会发生交联。

关于玻璃体内药物递送的研究表明，在后房注射高渗溶液可诱导视网膜脱离2,3。在这些实验中，向玻璃体中部注射50 µL不同溶液（渗透压范围为1,000 mOsm至2,400 mOsm），可在数分钟内引起视网膜脱离。值得注意的是，即使长时间暴露于高渗溶液后，在兔和猴眼球的透射电子显微镜图像中，视网膜色素上皮（RPE）的紧密连接仍保持完整3。基于类似策略，我们在进行RPE解剖前，向玻璃体中部注射高渗D-甘露醇溶液以高效诱导视网膜脱离。由于D-甘露醇不被RPE转运4，因此可在玻璃体内维持高浓度，形成渗透梯度。RPE与视网膜在整个后房的高效分离，可确保RPE细胞连接结构的完整性，并允许对整张RPE平铺标本进行形态计量学研究。此外，我们开发了一种基于人工智能（AI）的软件，可识别并分割荧光标记的RPE细胞边界，量化30种不同的形态学参数，并生成每种参数的热图以供可视化分析5,6。

方案

尸体眼球来自 Advanced Sight Network（美国阿拉巴马州伯明翰）。根据美国国立卫生研究院（NIH）机构审查委员会的规定，对尸体组织进行的研究工作免于接受研究伦理委员会的审查。

1. 眼球的运输

  1. 摘除眼球后，将新鲜的眼球置于装有冰冻 DPBS 1x（含 Ca2+ 和 Mg2+）的容器中运输。
    注意：最好在摘除眼球后 24 小时内进行眼球解剖。在此时间段内，视网膜色素上皮（RPE）的形态不会发生改变。

2. 硅胶模具制备

  1. 将直径为25 mm的圆底管底部20 mm处切掉，放置在方形称量皿（81 mm × 81 mm × 25 mm）底部。
  2. 按10:1的比例混合硅弹性体试剂盒的两种组分，注意避免混入气泡。将混合物倒入含有圆底管球形部分的称量皿中。
  3. 在室温下静置过夜使硅胶固化。从固化的硅胶模具中取出称量皿和圆底管。

3. 视网膜色素上皮细胞分离

  1. 用镊子和精细剪刀清除新鲜眼球巩膜上的肌肉和结缔组织。使用27 G针穿过巩膜，将眼球固定在硅胶模具上。向模具腔内加入含 Ca2+ 和 Mg2+ 的1× DPBS。
    注意：操作时注意不要刺破眼内腔室。针仅应穿过巩膜。
  2. 使用1 mL注射器和21 G针头，将约400 µL 1,700 mOsm的D-甘露醇溶液注入玻璃体。针头应通过睫状体平坦部穿入，以避免刺破眼前房。将眼球在室温下静置约45分钟。
  3. 使用精细剪刀和镊子，在睫状体平坦部水平切开眼前房。用含 Ca2+ 和 Mg2+ 的1× DPBS填充眼后房。在体视显微镜下定位黄斑（视网膜上的黄色斑点）。
  4. 若有手术用玻璃体切割器，可将其用于切除玻璃体并替换为含 Ca2+ 和 Mg2+ 的1× DPBS。若无，则尝试用镊子轻轻提起玻璃体，并用精细剪刀剪除。
  5. 注意保护黄斑区域，将眼球沿鼻侧、颞侧、上方和下方分为四个象限。若固定用针妨碍操作，可将其移除。
  6. 将展开的眼后房组织转移至含有含 Ca2+ 和 Mg2+ 的1× DPBS的100 mm培养皿中。在移除视网膜前，于睫状体边缘做一小V形切口，标记含有黄斑的瓣片。用镊子提起并剪除覆盖在视网膜表面的所有玻璃体。
  7. 使用弯头刮勺或一对镊子从多个方向轻轻抬起视网膜，检查视网膜是否已从视网膜色素上皮（RPE）分离，并使液体在两层之间流通。
    注意：此时视网膜仍与周边部（睫状体边缘）及视神经连接。
  8. 沿各个瓣片的睫状体边缘剪下视网膜，注意避免刮伤RPE。将组织置于4%多聚甲醛（PFA）中固定约1小时。用含 Ca2+ 和 Mg2+ 的1× DPBS洗涤3次。将组织转移至盛有含 Ca2+ 和 Mg2+ 的1× DPBS的容器中，4 °C保存。
    注意：此时视网膜仅在视神经处与RPE相连。此为本实验的可暂停节点。
  9. 将样品转移至含有含 Ca2+ 和 Mg2+ 的1× DPBS的100 mm培养皿中。使用1.5 mm活检打孔器切除视神经乳头，并收集视网膜。将神经视网膜保存在含 Ca2+ 和 Mg2+ 的1× DPBS中，4 °C储存。
    注意：在打孔切除视神经乳头前，应尽可能从巩膜侧切断视神经，以提高打孔精度。在4% PFA固定后的平铺标本上进行视神经乳头打孔，可减少对视神经周围RPE细胞的损伤。
  10. 使用Vannas弹簧剪刀，从周边部轻轻提起RPE/脉络膜层，并剪断位于巩膜与RPE之间的脉络膜血管和结缔组织，从而将巩膜从RPE/脉络膜复合体上剥离。待RPE/脉络膜完全与巩膜分离后，收集该组织层。将组织转移至盛有含 Ca2+ 和 Mg2+ 的1× DPBS的容器中，4 °C保存。
    注意：此时实验可暂停。

4. 染色

  1. 将RPE/脉络膜转移至6孔板中的一个孔内。在含有Ca2+和Mg2+的1×DPBS中，加入1%牛血清白蛋白（BSA）、0.5% Tween 20和0.5% Triton X-100，于室温下封闭并透化样本1小时。
  2. 将样本与偶联647荧光染料的鬼笔环肽按1:250稀释比例溶于含Ca2+和Mg2+的1×DPBS中，其中含1% BSA、0.5% Tween 20和0.5% Triton X-100，于室温孵育1小时。用含Ca2+和Mg2+的1×DPBS洗涤3次。
  3. 将RPE/脉络膜样本转移至50 mm × 75 mm的玻璃载片上并展平。将每一片“花瓣”剪成两半以使样本更平整。注意黄斑区域。使用疏水性笔描绘平铺样本的轮廓。
  4. 为淬灭脂褐素自发荧光，加入500 µL以70%乙醇按1:20稀释的自发荧光淬灭液，于室温孵育2分钟。
  5. 用含Ca2+和Mg2+的1×DPBS充分洗涤（至少3次）。去除DPBS后加入封片介质。将盖玻片覆盖在平铺样本上，并用指甲油封固。
  6. 使用荧光显微镜对平铺样本进行成像（建议使用10×或20×物镜）。

5. REShAPE 分析

注意：由于 REShAPE 基于人工智能的算法是在 10x 和 20x 的图像上进行训练的，因此成像时强烈建议使用 10x 或 20x 物镜。否则，图像将需要相应地进行缩放调整。

  1. 如果图像使用多个荧光通道采集，请分离用于获取细胞边界的通道。将图像导出为16位灰度TIF文件。
    注意：以 .czi 文件扩展名获取的图像无需导出为 TIF 文件，但仍需分离出包含细胞边界的通道。
  2. 在 Windows x64 或 Linux（Centos 7）平台安装软件。
    注意：软件及安装说明可在 https://github.com/nih-nei/REShAPE 获取。
  3. 打开软件（图1).
  4. 在 目录 标签页中，选择输入和输出文件夹。在 输入目录，选择包含图像的文件夹。在 输出目录，让软件自动将路径更改为“input directory/Processed”。或者，手动更改输出目录。
    注意：软件将遍历输入文件夹中包含的所有图像。
  5. 在 神经网络分割选项 标签，选择以下内容 设置 用于图像分割：
    1. 批次大小在文本框中输入20作为良好的起始值，但如果系统显卡（GPU）资源耗尽，则应降低该数值。
      注意：原始图像被分割成较小的图块进行处理。批量大小指定了一次可处理的图块数量。
    2. 使用 GPU？：如果系统没有足够的 GPU 资源，请选中该复选框 无.
    3. 内部刻度：使用下拉菜单，将内部缩放比例从 无 在未使用10倍或20倍物镜获取图像的情况下。例如，将40倍图像使用下采样方法缩小至原尺寸的一半 1/2 按钮。下拉菜单中可用的重缩放选项如下： 5倍，2倍，无，1/2，1/5.
      注意：机器学习模型使用 10x 和 20x 的图像进行训练。它可能无法识别其他放大倍数下图像中的细胞边界。在此情况下，二值图像将完全呈现为黑色。
    4. Arti Filter：使用伪影滤波选项卡去除图像中可能存在的非常明亮的颗粒（如碎片或视网膜的小片段，或视神经周围结缔组织），这些颗粒可能干扰细胞边界的分割。默认情况下不使用任何滤波器。下拉菜单中的伪影滤波选项如下： 规律，强，以及 弱.
  6. 在 拼接图像选项 标签，通过调整图像瓦片之间的重叠量，在文本框中输入数值以指定重叠程度 通过垫片拼接 参数。通常设置100像素的重叠效果较好。
  7. 在 输出图形选项 标签，调整热图生成的设置：
    1. 是否重建拼接图像？：如果系统资源不足以分析大型图像，请选中该复选框 无 以便软件通过保存单个图像块来完成分析，而无需重建整幅图像。
    2. 创建彩色图像：要生成热图，请选择 全部 从下拉菜单中。
    3. 对于 染色从下拉菜单中选择任意一种可用的颜色调色板： 热力、绿色、Mpl-岩浆、相位、火焰、喷射、青色热.
    4. 对于 图像格式，通过在选项卡中选择其中一种选项，将图像另存为 TIF 或 PNG 格式。
    5. 关于 使用手动限制？ 特征，选中该复选框 无 以使软件使用每张图像中检测到的最小值和最大值。勾选该复选框 是 手动调整每种形态学指标热图的数值范围，然后单击 设置限制 按钮，通过在文本框中输入数值来选择各个参数的范围。更改感兴趣的数值后，单击 保存. 点击 加载默认设置 重置所有限值。
      注意：当需要比较多张图像的热图时（例如比较不同化合物对细胞形态的影响），请使用手动设置的阈值范围。这样可确保使用相同的数值范围。手动输入的数值范围取决于样本类型，建议通过多次尝试来选择最优化的范围。
  8. 在 用于分析的细胞大小限制 标签，选择一个 细胞大小阈值 用于分析：
    1. 在 细胞尺寸减小在文本框中输入要包含在分析中的最小细胞的尺寸。
    2. 在 上层细胞大小在文本框中输入要包含在分析中的最大细胞的尺寸。
      注意：细胞大小的单位根据所选选项的不同，会从像素变为平方微米 自动单位换算 表。
  9. 在 自动单位换算 标签，选择分析的首选单位：
    1. 在 将像素转换为实际单位？，检查 无 以像素为单位运行分析的框。选中该选项 是 用于以微米为单位运行分析的盒子。
    2. 在 比例尺长度（像素）， 在文本框中输入像素值。
    3. 在 比例尺长度（微米）在文本框中输入对应的微米距离。
  10. 开始分析前，请按 加油.
    注意：当细胞用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和碘化丙啶（propidium iodide）染色时，该软件也可用于测量细胞活力。CZI 选项 但此方法不适用于视网膜色素上皮（RPE）平铺标本。

用于图像处理的 RESHADE 控制器软件界面；包含分割、TIFF 保存和细胞大小分析的选项。
图 1：REShAPE 图形用户界面。 该图形用户界面包含多个选项卡，用于选择工作目录（目录选项卡）、修改分割选项（NN 分割选项和分块图像选项选项卡）、设定分析参数（细胞大小分析限制和自动单位换算选项卡）以及生成热图（输出图形选项选项卡）。缩写：GUI = 图形用户界面。 请点击此处查看此图的放大版本。

结果

本方案可获得视网膜色素上皮（RPE）平展标本的单层图像，并对每个正确识别的 RPE 细胞测量其细胞位置及 30 项形态学参数（图 2）。在输入目录中将自动生成一个名为“Processed”的文件夹，该文件夹包含四个子目录：“Analysis”、“Color Coded”、“Combined Files”和“Segmented Images”，以及分析过程中生成的一些临时文件。“Combined Files”文件夹中包含一个汇总所有形态学测量数据的电子表格，以及一个汇总所有文件细胞邻数频率的电子表格。“Analysis”文件夹中包含针对每幅图像单独生成的形态学测量数据电子表格和细胞邻数频率电子表格。“Segmented Images”目录保存 RPE 细胞边界的最终二值化掩膜图像，可用于评估分割质量。“Color Coded”目录包含每项形态学参数的热图，用于可视化各图像中的形态分布模式。形态学参数的定义与缩写见表 1。

有时，RPE 平铺标本中可能残留未完全去除的视网膜碎片，尤其是在视神经周围区域。样本的鬼笔环肽染色会产生来自视网膜的强信号，这会对 RPE 细胞边界的分割造成干扰。部分图像瓦片会呈现完全黑色，而周围的瓦片则显示正常分割结果。图像中出现的其他明亮物体同样会导致黑色瓦片的生成（图 3）。在此类情况下，选择 Arti Filter 下拉菜单中提供的滤波选项之一（弱、常规、强）可防止黑色瓦片的形成。

RESHAP 软件接受 8 位或 16 位灰度图像作为输入，但不支持 RGB 图像。若使用 RGB 图像进行 RESHAP 分析，将生成完全黑色的二值图像。若出现此情况，需先将 RGB 图像转换为灰度图像，方可获得正确分割的二值图像（图 4）。在某些情况下，若视网膜色素上皮（RPE）边界未能被正确识别，例如染色效果不理想或样本表面存在划痕损伤（图 5A），可能导致大量细胞被识别为单个异常大的细胞（图 5B）。此时，可通过降低细胞大小阈值来排除这些大尺寸对象（图 5C），具体操作为在 Upper Cell Size 文本框中输入较小的数值。但此操作将导致热图显示范围发生变化。若研究者希望保持原始热图范围，可在 Use Manual Limits? 功能中勾选 Yes 复选框，以保留初始热图范围（图 5D）。随后，研究者需左键点击 Set Limits 按钮，并在对应的文本框中输入所需数值，以设定手动范围限制。

RPE平铺分析；通过显微镜可视化细胞边界和面积的分割与热图。
图 2：整个人类视网膜色素上皮（RPE）单层细胞的完整形态计量分析。（A）整个人类RPE/脉络膜平铺样本的低倍视野图像（品红色：鬼笔环肽标记）。（B）鬼笔环肽染色的RPE细胞的放大视图。（C）REShAPE软件生成的整个人类RPE/脉络膜平铺样本中RPE细胞边界的分割结果，以及（D）相应的放大视图。（E）由软件生成的热图，显示整个人类平铺样本中各个RPE细胞的细胞面积。左上角的温度标尺显示所用数值范围。（F）相应的放大视图，显示按面积着色的单个RPE细胞。比例尺 = （B、D、F）50 µm，（A、C、E）5 mm。缩写：RPE = 视网膜色素上皮。 请点击此处查看该图的高清版本。

人RPE铺片，细胞边界分割；细胞分析研究中的显微镜图像。
图3：明亮伪影的滤除。（A）用于标记细胞边界的染色人RPE铺片（品红色：鬼笔环肽）可能出现明亮区域（绿色矩形），干扰分割过程。（B）整个RPE铺片的细胞边界分割结果中包含三个完全黑色的图像块（绿色箭头），对应于荧光信号过强的区域。（C、E）其中两个黑色图像块对应含有明亮点状结构的区域，这些结构可能是某些碎片残留。（D）另一个黑色图像块由视神经周围未完全去除的神经视网膜碎片造成。神经视网膜组织的荧光强度显著高于RPE层，从而阻碍了细胞的准确分割。请点击此处查看本图的高清版本。

用于细胞结构可视化的RGB和16位细胞成像图及分割分析示意图。
图4：输入图像要求。 标记了细胞边界的RPE细胞图像保存为（A）RGB图像或（B）用于RESHAPE分析的16位灰度图像。（C）RGB图像分析的输出结果为黑色二值图像，（D）而灰度图像分析则生成正确分割的细胞边界二值图像。RESHAPE仅能分析8位或16位灰度图像。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

显微镜分析中细胞大小阈值的荧光图像与热图。
图5：次优结果。（A）RPE单层细胞的一部分图像，其中经鬼笔环肽染色的细胞被意外刮伤。（B）按细胞面积大小着色的RPE细胞热图。较大的上限细胞尺寸阈值会将较大的对象纳入分析。（C）选择较小的上限细胞尺寸阈值的细胞面积热图，以将较大的对象排除在分析之外。（D）选择较小的上限细胞尺寸阈值并手动设定范围，以保持最初使用的热图范围的细胞面积热图。请点击此处查看此图的放大版本。

表1：RESHAPE参数。 本表列出了每个参数的定义，以及在原始电子表格（“_Data.csv”文件）和热图中使用的缩写。请点击此处下载该表格。

讨论

使用本方案可实现人 RPE 与视网膜的一致且高效的分离。该方法可用于研究整个视网膜上 RPE 形态的区域差异5。方案中的关键步骤是 RPE 与视网膜的物理分离。若在某些区域两种组织未完全脱离，应轻轻抬起视网膜，注意不要撕裂组织。对大尺寸平铺样本进行 REShAPE 分析可能需要使用具有较大内存资源的系统。在此情况下，可禁用整幅图像的重新拼接功能，以使软件在处理资源不足的情况下仍能成功完成分析。

使用 REShAPE 对人视网膜色素上皮（RPE）平铺标本进行分割的主要局限性在于，该人工智能算法主要基于诱导性多能干细胞来源的 RPE 图像进行训练。因此，对人 RPE 平铺标本的分割准确性较低。来自老年供体的 RPE 细胞含有大量脂褐素7，其广泛的自发荧光光谱会干扰细胞边界的分割。未来将使用更多 RPE 平铺标本的图像，以改善此类样本中的细胞边界分割效果。尽管存在这一局限性，RESHAPE 仍被专门训练用于识别和分割 RPE 细胞边界，其性能优于其他现有方法，例如 Voronoi8 和 CellProfiler9 对 RPE 细胞的分割方法。

此外，与手动分割相比10，RESHAPE 具有快速分析大尺寸图像的优势（已测试约 130,000 像素 × 130,000 像素的图像）。总之，该解剖方法具有高度可重复性，并可轻松扩展至其他动物模型。此外，该软件可用于研究眼平铺标本或细胞培养模型中视网膜色素上皮（RPE）的形态，以评估特定处理的影响。最后，RESHAPE 的多功能性使其广泛适用于其他类型上皮细胞的分析。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢美国国立眼科研究所（NEI）组织学核心提供蔡司Axio Scan.Z1的使用。我们还要感谢捐赠者及其家属、推进视力网络（Advancing Sight Network）以及狮子眼科研究所的慷慨支持。本工作由NEI院内研究项目资金（资助号 ZIA EY000533-04）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mm 活检打孔器 Acuderm Inc.P1525
牛血清白蛋白MP Biomedicals160069
盖玻片，50 × 75 mm，#1.5 厚度 Brain Research Laboratories5075-1.5D
弯头刮匙KatenaK3-6600
D-甘露醇SigmaM9546
含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 1× DPBSGibco14040-133
精细剪刀Fine Science Tools14558-11
Fluormount-GSouthern Biotech0100-01
镊子 - Dumont #5Fine Science Tools11252-23
显微镜载玻片 50 × 75 × 1.2 mmBrain Research Laboratories5075
21 G × 1-1/2" 皮下注射针头Becton Dickinson (BD)305167
27 G × 1-1/4" 皮下注射针头Becton Dickinson (BD)305136
16% 多聚甲醛 Electron Microscopy Sciences15710
100 mm 培养皿 Corning430167
鬼笔环肽-iFluor 647Abcamab176759
剃须刀片PAL (Personna)62-0177
50 mL 圆底管Newegg9SIA4SR9M88854
硅酮弹性体试剂盒Dow Corning Corporation4019862
方形称量舟（81 mm × 81 mm × 25 mm）SigmaW2876
手术用玻璃体切除系统BD Visitrec585100可选
1 mL 注射器Becton Dickinson (BD)309659
吐温 X-100SigmaT9284
TrueBlackBiotium23007自发荧光淬灭剂 
吐温 20Affymetrix20605
Vannas 弹簧剪刀 - 3 mm 刃口Fine Science Tools15000-10

参考文献

  1. Endo, E. G., Yao, X. Y., Marmor, M. F. Pigment adherence as a measure of retinal adhesion: Dependence on temperature. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (9), 1390-1396 (1988).
  2. Marmor, M. F. Retinal detachment from hyperosmotic intravitreal injection. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 18 (12), 1237-1244 (1979).
  3. Marmor, M. F., Martin, L. J., Tharpe, S. Osmotically induced retinal detachment in the rabbit and primate. Electron microscopy of the pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 19 (9), 1016-1029 (1980).
  4. Ban, Y., Rizzolo, L. A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions. Molecular Vision. 3, 18(1997).
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  7. Beatty, S., Koh, H. -H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).
  8. Liu, Z., Kocaoglu, O. P., Miller, D. T. 3D imaging of retinal pigment epithelial cells in the living human retina. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (9), 533-543 (2016).
  9. Bhatia, S. K., et al. Analysis of RPE morphometry in human eyes. Molecular Vision. 22, 898-916 (2016).
  10. vonder Emde, L., et al. Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes. Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19(2022).

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