在背根神经节与施万细胞的共培养体系中，可以研究周围神经系统的髓鞘形成。该模型为观察和量化周围髓鞘化过程，以及研究感兴趣化合物对髓鞘影响提供了实验机会。
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本文内容
摘要
摘要
髓鞘形成过程对于实现神经系统中快速而充分的信号传导至关重要。在周围神经系统中，神经元与施万细胞通过复杂的相互作用共同调控轴突的髓鞘化。这种相互作用的紊乱以及髓鞘结构的破坏是炎性神经病的典型特征，并在神经退行性疾病中继发性出现。本文介绍一种背根神经节外植体与施万细胞的共培养模型，该模型可实现周围轴突的显著髓鞘化，用于研究周围神经系统中的髓鞘形成过程、轴突-施万细胞相互作用，并分别评估治疗药物对两种细胞类型的潜在影响。在方法上，取胚胎期13.5天（E13.5）大鼠的背根神经节，剥离周围组织后以完整外植体形式培养3天。施万细胞则从3周龄成年大鼠的坐骨神经中分离，通过酶消化法获取，并利用磁性激活细胞分选技术进行纯化，随后在含神经调节蛋白和佛司可林的培养条件下扩增。在背根神经节外植体培养3天后，将30,000个施万细胞加入一个外植体中，培养基中添加抗坏血酸。共培养第10天时，免疫细胞化学染色显示髓鞘碱性蛋白的散在信号，提示髓鞘化初始迹象。自第14天起，髓鞘沿轴突逐步形成并延伸。可通过髓鞘碱性蛋白染色定量髓鞘化程度，以髓鞘面积与轴突面积的比值作为指标，以校正轴突密度差异带来的影响。该模型为研究周围髓鞘化的多个方面提供了实验平台。 关键词：髓鞘形成，施万细胞，背根神经节，共培养，轴突-胶质细胞相互作用，髓鞘碱性蛋白，周围神经系统，神经退行性疾病，炎性神经病 体外这对于理解周围神经系统炎症性和神经退行性疾病中脱髓鞘和神经退行性变的病理机制及潜在治疗机会至关重要。
引言
在周围神经系统（PNS）中，快速的信息转导由髓鞘包裹的轴突介导。轴突的髓鞘化对于实现电信号的快速传导至关重要，因为神经纤维的传导速度与轴突直径和髓鞘厚度相关1。从外周向中枢神经系统（CNS）的感觉信号传递依赖于位于背根膨大部分的第一级感觉神经元的激活，这些膨大部分称为背根神经节（DRG）。轴突与施万细胞之间必须持续进行通讯，才能实现髓鞘的形成和维持，其中施万细胞是PNS中负责髓鞘形成的胶质细胞2。
周围神经系统（PNS）的许多疾病会通过原发性轴突损伤或脱髓鞘损伤干扰信息的传导，导致感觉减退或感觉异常。初级感觉神经元在神经损伤后具有一定程度的再生能力，这依赖于神经元与周围施万细胞之间复杂的相互作用3。在此过程中，施万细胞可发生细胞重编程，清除轴突和髓鞘碎片，并促进轴突再生，从而实现再髓鞘化4。了解健康与疾病状态下髓鞘形成的机制，对于寻找周围神经系统脱髓鞘疾病的潜在治疗方法至关重要。急性神经创伤也可导致髓鞘损伤，目前正研究促进髓鞘形成以加快周围神经损伤后的功能恢复的各种策略5。
我们对周围神经系统髓鞘形成的认知在很大程度上得益于施万细胞与感觉神经元的髓鞘化共培养体系。自从首次应用该方法以来....
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方案
所有操作均依照欧洲共同体理事会关于实验动物护理与使用的指令进行。
1. 施万细胞培养
- 施万细胞培养用包被
- 在无菌条件下包被细胞培养皿。向两个60 mm的组织培养（TC）皿中各加入2 mL 0.01%的聚-L-赖氨酸（PLL），4 ℃孵育过夜。 °C.
- 去除PLL，用蒸馏水洗涤TC培养皿2次，并与2 mL的1 µg/cm2 4℃过夜孵育 laminin °C. 用去离子水清洗组织培养皿 2 次，并让培养皿自然晾干。
- 施万细胞培养基的制备
- 通过添加10%热灭活胎牛血清（FCS）和2 µ50 微摩尔 forskolin，10 纳摩尔 neuregulin，和 50 µg/mL 庆大霉素加入杜尔贝科′改良型伊格尔培养基′s 培养基（DMEM）/F-12（高糖）在无菌条件下。
- 准备 70 mL 含 50 的 Leibovitz's L-15 培养基 µg/mL 两性霉素 B，在无菌条件下。
- 坐骨神经制备
注意：所有坐骨神经制备步骤均在洁净工作台内进行。- 准备一个100 mm的TC培养皿，加入5 mL冰冻....
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结果
在共培养的第10、12、14、16、18和20天评估髓鞘形成情况。对背根神经节（DRG）外植体和施万细胞进行MBP、βIII-微管蛋白和DAPI染色。共培养中的轴突网络密集，在整个观察期间无明显变化。在第10天可检测到以微小片段形式出现的髓鞘形成的最初迹象，并在第12天有所增加（图2）。MBP阳性区域随培养时间延长逐渐增加，直至培养第20天。髓鞘化程度以MBP阳性区域与βIII-微管蛋白阳性区域的比值进行量化。与第10天相比，第18天和第20天的髓鞘化显著增加（图3；**p ≤ 0.01；***p ≤ 0.001）。
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讨论
在此，我们介绍一种快速且简便的方案，用于生成 体外 通过合并两种独立的细胞类型培养物——施万细胞和背根神经节外植体——实现髓鞘化。
该实验方案的关键步骤是背根神经节（DRG）外植体的培养，尤其是在培养的最初几天。在形成稳定的轴突网络之前，DRG非常脆弱，因此在从培养箱中取出或更换培养基时必须极其小心地操作。如果DRG从孔板底部脱落并漂浮在培养基中，则表明培养失败。对于施万细胞而言，由于培养条件和添加物（如培养基中的血清）不同而导致的增殖速率变化，可能对共培养体系构成挑战。如果施万细胞过度增殖，导致培养物从孔板底部脱落，则该培养物将无法使用。因此，建议对培养中施万细胞的数量进行滴定优化。在建立施万细胞培养方案的过程中，应通过SOX10或S100免疫染色进行纯度检测。总体而言，所有培养操作，包括更换培养基、洗涤和固定步骤，都必须谨慎进行，以确保实验成功。根据研究目的选择合适的观察时间点非常重要；第14天是首次出现密集有髓轴突的起始时间，因此可作为髓鞘形成起始阶段的观察时间点，而更晚的时间点则可观察到更完整的髓鞘结构。
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
我们感谢 Ralf Gold 教授和 Gisa Ellrichmann 副教授的建议与支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗 MBP 抗体，兔源 | Novus Biologicals, Centannial, 美国 | ABIN446360 | |
| 抗 ßIII-微管蛋白抗体，小鼠源 | Biolegend, San Diego, 美国 | 657402 | |
| 抗坏血酸 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国 | A4403-100MG | |
| B27 补充剂 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国 | 17504-044 | |
| Biosphere 滤芯吸头，100 µL | Sarstedt, Nümbrecht, 德国 | 70760212 | |
| Biosphere 滤芯吸头，1250 µL | Sarstedt, Nümbrecht, 德国 | 701186210 | |
| Biosphere 滤芯吸头，20 µL | Sarstedt, Nümbrecht, 德国 | 701114210 | |
| Biosphere 滤芯吸头，300 µL | Sarstedt, Nümbrecht, 德国 | 70765210 | |
| 牛血清白蛋白 | Carl Roth, Karlsruhe, 德国 | 8076.4 | |
| 细胞筛，100 µM | BD Bioscience, Heidelberg, 德国 | 352360 | |
| 离心机 5810-R | Eppendorf AG, Hamburg, 德国 | 5811000015 | |
| CO2 培养箱 Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, 德国 | 51017865 | |
| 盖玻片 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, 德国 | P231.1 | |
| 弯头精细镊 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, 德国 | 11370-42 | |
| DAPI 氟封片剂 (R) | Biozol, Eching, 德国 | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国 | 4942078001 | |
| 蒸馏水（水纯化系统） | Millipore, Molsheim, 法国 | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国 | 31331093 | |
| DPBS（不含 Ca2+ 和 Mg2+） | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国 | D8537-6X500ML | |
| 乙醇 | VWR, Radnor, 美国 | 1009862500 | |
| 胎牛血清（FCS） | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国 | F7524 | FCS 必须经过雪旺细胞培养测试 |
| 精细镊（Dumont #5） | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, 德国 | 11252-20 | |
| 镊子 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, 德国 | 11370-40 | |
| 福斯科林（Forskolin） | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国 | F6886-10MG | |
| 明胶 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国 | G1393-20ML | |
| 庆大霉素 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国 | 5710064 | |
| 山羊抗小鼠 IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国 | A11036 | |
| 山羊抗兔 IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国 | A11001 | |
| HBSS（不含 Ca2+ 和 Mg2+） | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国 | 14170138 | |
| HERAcell 培养箱 | Heraeus Instruments, Hanau, 德国 | 51017865 | |
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国 | 51029882 | |
| 马血清 | Pan-Biotech, Aidenbach, 德国 | P30-0712 | |
| Image J 软件 | HIH, Bethesda, 美国 | ||
| 层粘连蛋白 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国 | L2020-1MG | |
| Leibovitz´s L-15 培养基 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国 | 11415064 | |
| L-谷氨酰胺 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国 | 25030024 | |
| MACS 多功能支架 | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 德国 | 130042303 | |
| 显微剪刀 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, 德国 | 15000-08 | |
| 显微镜 | Motic, Wetzlar, 德国 | Motic BA 400 | |
| 显微镜 Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, 德国 | 491917-0001-000 | |
| 载玻片 | VWR, Radnor, 美国 | 630-1985 | |
| MiniMACS 分离器 | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 德国 | 130091632 | |
| MS 柱 | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 德国 | 130-042-201 | |
| Neubauer 计数板 | Assistant, Erlangen, 德国 | 40441 | |
| 神经调节蛋白 | Peprotech, Rocky Hill, 美国 | 100-03 | |
| Neurobasal 培养基 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国 | 21103049 | |
| 神经生长因子（NGF） | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国 | N1408 | |
| 正常山羊血清 | Biozol, Eching, 德国 | S-1000 | |
| Nunclon Δ 多孔板，4 孔 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国 | D6789 | |
| 多聚甲醛 | Acros Organics, New Jersey, 美国 | 10342243 | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国 | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburg, 德国 | 4430000018 | |
| 移液器 | Eppendorf AG, Hamburg, 德国 | 2231300004 | |
| 聚-D-赖氨酸 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国 | P6407-5MG | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国 | P4707-50ML | |
| 反应管，15 mL | Sarstedt, Nümbrecht, 德国 | 62554502 | |
| 反应管，50 mL | Sarstedt, Nümbrecht, 德国 | 62547254 | |
| 反应管，1.5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, 德国 | 72690001 | |
| 安全柜 S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国 | 51026640 | |
| 剪刀 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, 德国 | 14083-08 | |
| 血清移液管，10 mL | Sarstedt, Nümbrecht, 德国 | 861254025 | |
| 血清移液管，25 mL | Sarstedt, Nümbrecht, 德国 | 861685001 | |
| 血清移液管，5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, 德国 | 861253001 | |
| 刮勺 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, 德国 | 10094-13 | |
| 体视显微镜 Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, 德国 | 495015-0012-000 | |
| 手术剪刀 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, 德国 | 14007-14 | |
| 细胞培养皿 100，细胞+ | Sarstedt, Nümbrecht, 德国 | 833902300 | |
| 细胞培养皿 35，细胞+ | Sarstedt, Nümbrecht, 德国 | 833900300 | |
| 细胞培养皿 60，细胞+ | Sarstedt, Nümbrecht, 德国 | 833901300 | |
| Thy-1 磁珠（MACS 试剂盒） | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 德国 | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国 | X100-500ML | |
| 0.4% 台盼蓝溶液 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国 | 15250061 | |
| 胰蛋白酶（2.5%），无酚红 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国 | 15090-046 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国 | 25300-054 | |
| I 型胶原酶 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国 | C1639 | |
| 水浴锅，型号 1008 | GFL, Burgwedel, 德国 | 4285 |
参考文献
- Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
- Taveggia, C.
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重印与许可
