图像引导光学相干断层扫描评估啮齿动物视网膜的结构变化

摘要

此处介绍的协议详细介绍了图像引导光学相干断层扫描 （OCT） 的数据收集和数据分析程序，并展示了其在多种眼部疾病啮齿动物模型中的应用。

摘要

眼部疾病，如年龄相关性黄斑变性、青光眼、色素性视网膜炎和葡萄膜炎，总是伴有视网膜结构改变。这些影响眼底的疾病总是在视网膜的某些细胞类型中表现出典型的异常，包括感光细胞、视网膜神经节细胞、视网膜血管中的细胞和脉络膜血管细胞中的细胞。临床实践和基础研究都需要无创、高效和适应性强的成像技术。图像引导光学相干断层扫描 （OCT） 满足这些要求，因为它结合了眼底摄影和高分辨率 OCT，可准确诊断微小病变以及视网膜结构的重要变化。本研究详细介绍了图像引导 OCT 的数据收集和数据分析程序，并展示了其在脉络膜新生血管形成 （CNV） 、视神经挤压 （ONC）、光诱导的视网膜变性和实验性自身免疫性葡萄膜炎 （EAU） 的啮齿动物模型中的应用。该技术可帮助眼领域的研究人员方便、可靠和轻松地识别啮齿动物视网膜结构变化。

引言

影响眼底的眼部疾病总是表现出视网膜中某些细胞类型的典型异常，例如感光细胞、视网膜神经节细胞、视网膜血管中的细胞和脉络膜血管中的细胞，这可能会影响患者的视力¹。为避免不可逆的视力损害，需要及时诊断和适当的治疗¹。光学相干断层扫描 （OCT） 已在临床上广泛用于评估一系列眼部疾病，包括年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、青光眼、葡萄膜炎和视网膜脱离等 ^2,3,4。这种无创、高效、适应性强的成像技术也是及时评估实验动物疾病状况所必需的 5,6,7,8,9,10。

图像引导光学相干断层扫描 （OCT） 使用干涉测量法以 1.8 μm 纵向分辨率和 2 μm 轴向分辨率生成动物视网膜的横截面图像。它在研究视网膜结构变化方面至少具有三个优势 2,3,4,5,6,7,8,9,10。首先，它是一种非侵入性技术，允许研究人员动态跟踪同一动物视网膜中感兴趣的位置 5,6,7,8,9,10。其次，这个性状大大减少了每个实验的样本量³。同时，它在研究项目^{2、3、4、5、6、7、8、9、10} 中节省了大量的时间和精力。第三，图像引导 OCT 在捕获 OCT 图像的同时获取彩色眼底图像，从而为用户提供准确可靠的结果。

本手稿描述了图像引导 OCT 的图像采集和数据分析程序，并详细阐述了其在脉络膜新生血管形成 （CNV） ^11,12、视神经挤压 （ONC）^{13、14、15、16}、光诱导视网膜变性^{17、18、19、20、21} 的小鼠和大鼠模型中的应用和实验性自身免疫性葡萄膜炎 （EAU）^22,23。借助这种多功能技术，研究人员可以方便高效地捕获高分辨率 OCT 图像以及眼底图像。

方案

所有动物程序均符合视觉与眼科学研究协会关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明，并获得了温州医科大学 （WMU） 机构动物护理和使用委员会的批准。大鼠和小鼠在 12 小时的暗/光循环中以 18 lux 的环境光强度自由获得水和食物。

1. 动物眼模型的准备

1. 小鼠激光诱导的脉络膜新生血管 （CNV） 模型^11,12
   1. 用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉 4 周龄雌性小鼠 （C57BL/6J 背景），并按照步骤 3.2 用托吡卡胺去氧肾上腺素滴眼液扩张瞳孔。当捏住脚趾后没有检测到运动时，考虑对鼠标进行适当麻醉。
   2. 接合光源盒、软件和激光盒（波长:532 nm），输出能量调整为 100 mW，持续时间为 100 ms。
   3. 将鼠标放在实验平台上，调整鼠标和平台的位置，直到鼠标眼底的视野清晰为止。
   4. 按下激光盒屏幕上的 Laser ON 按钮，调整红色激光参考点的焦距。移动激光参考点并将其调整为距离视盘一到两个直径。作脚踏板会导致激光损坏。
   5. 立即进行检查，以确定撞击后立即出现汽化气泡，这是激光损伤成功的迹象。为每只眼睛产生 3 到 5 个激光点。
2. 小鼠视神经粉碎 （ONC） 模型 13,14,15,16
   1. 按照步骤 3.2，在出生后第 21 至 P35 天 （P） 麻醉雌性小鼠 （C57BL/6J 背景）。当捏住脚趾后没有检测到运动时，考虑对鼠标进行适当麻醉。
   2. 将小鼠置于手术显微镜下，用弹簧剪刀切开一只眼睛的结膜，确保结膜切口的大小约为 1 毫米。
   3. 暴露眶内视神经，用细镊子在距离视盘 0.5 mm 处挤压 5 秒。在执行此作时，轻轻偏转眼眶肌肉和其他组织，并将它们放在一边。避免损伤手术眼中的任何血管。
      注意:要小心，因为当触摸或拔除白色束状视神经时，眼球会摆动。
   4. 术后涂抹眼药膏以避免角膜干燥。
3. 小鼠光诱导的视网膜变性 （LIRD） 模型 17,18,19,20,21
   1. 实验前的准备工作:用铝箔和铁网罩封闭小鼠笼 （30 cm x 18 cm x 13 cm）。将每个笼子放入纸盒 （52 cm x 35 cm x 30 cm） 中，顶部有白光。
   2. 暗适应 6 周龄雄性小鼠 （BALB/c） 在暗室中过夜，然后在每只眼睛中使用托吡卡胺去氧肾上腺素滴眼液扩张眼睛。完全扩张瞳孔，直到 3/4 的角膜区域未被虹膜覆盖;这通常不超过 3 分钟。
   3. 用 10,000 lux 白光照射小鼠 2 小时。术后将小鼠置于黑暗中过夜，然后恢复到正常的暗光环境。为确保有效的光刺激，请始终将一只鼠标放在笼子里。
4. 大鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎 （EAU） 模型
   1. 实验前的准备工作:将 2.5 mg hIRBP161-180 与2.5 mg/mL结核分枝杆菌H37Ra^22,23乳化在完全弗氏佐剂（1:1重量/体积）中。
   2. 将 100 μL 乳剂皮下注射到每只 Lewis 雄性大鼠的左脚垫中（约 180 g）。

2. OCT 模块设置

1. 在 OCT 扫描头和 OCT 引擎之间连接光纤和 OCT 控制电缆（图 1A）。将光纤上的槽口与连接器上的槽对齐，然后轻轻插入尖端直至其就位（图 1B）。
   注意: 在连接控制电缆之前，请关闭 OCT 发动机的电源开关。光纤非常脆弱，因此请避开光纤尖端的两端（图 1C）。如果该模块频繁使用，应避免组装和拆卸 OCT 扫描头和光纤/电缆。
2. 将鼠标或大鼠 OCT 物镜穿到机身前部（图 1A）。将 OCT 扫描头放在 OCT 镜头上，使 MR 聚焦指示器背对机器主体（图 1A）。
3. 用两个翼形螺钉固定 OCT 扫描头:一个在镜头上，一个在相机机身上。将扫描头固定得紧。
4. 打开主电源开关，然后打开相机灯，然后打开 OCT 软件。
   注意:相机需要一些时间来启动，以便计算机找到它。

3. OCT 实验的动物准备

1. 在 OCT 实验前 10 分钟，将托吡卡胺去氧肾上腺素滴眼液到动物的眼睛中，并使用干净的毛巾擦去多余的眼药水。
2. 实验前 5 分钟，将 200 μL 麻醉液注入小鼠体内，并向大鼠腹腔注射 2.0 mL。当捏脚趾后未检测到运动时，考虑对小鼠/大鼠进行适当麻醉。
   注:麻醉溶液由盐水中氯胺酮 （12 mg/mL） 和甲苯噻嗪（小鼠 1 mg/mL，大鼠 2 mg/mL）组成;通常，每 1 g 动物体重应用 10 μL 麻醉溶液。将溶液在 4 °C 下储存最多2周。
3. 麻醉后，用凝胶软膏润滑角膜，以避免眼表干燥。

4. 图像引导 OCT 成像

注意:软件界面分为三个部分:明场图像、OCT 控制选项卡和 OCT 显示（图 2）。

1. 查看明场图像时，如果需要，请键入动物信息的注释。
2. 使用复选框打开或关闭 光束位置控件 ，以捕获图像上带有或不带有线条叠加的明场图像。
3. 要更精确地放置扫描光束，请使用 Position Nudge 箭头进行精细控制，以将其向上、向下、向左或向右定向。选择厚度值和颜色，并为光束选择瞄准目标位置的角度（例如，粗、黑色和 0）。将增益值拖动到 14 db。
4. 转到 OCT 控件选项卡。从菜单中选择 文件/File_Settings，然后创建保存 OCT 和眼底图像的路径。
5. 指定扫描类型、大小和动物（大鼠或小鼠）;选择 Eye（眼睛）、左侧或右侧和 Imaging R etina（ 成像 Retina）。
   注意:OCT 可以捕获全尺寸、半尺寸、四分之一尺寸和八分之一尺寸的线、圆形和 3D 体积扫描类型。
6. 设置图像控件。调整值:60 表示对比度，100 表示灰度系数 ，0 表示亮度。
7. 将鼠标放在实验平台上，调整鼠标和平台的位置，直到鼠标眼底的视野清晰。精细调整位置以将视盘定位在中心。
8. 开始时将参考臂调整为小鼠 850 和大鼠 830，然后单击 <-1 或 +1> 按钮微调位置。水平调整 OCT 图像，然后将 OCT 图像移动到完整视图的顶部 1/3。
9. 如果需要，移动偏振滑块以调整通过 Retina 的信号亮度。
10. 在观察清晰稳定的 OCT 图像以及眼底图像后，设置帧数（通常为 20、50、80 或 100），然后按 Average。
    注意:捕获 OCT 图像需要几秒钟。帧数越多，意味着图像捕获需要更长的时间才能完成，但生成的捕获图像质量更高。
11. 按 Save 保存 OCT 和眼底图像，然后单击 Restart 以捕获另一个样本。
    注意:在醒来之前，让动物在 37 °C 加热板上恢复。这些动物在恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前不会无人看管。经过治疗的动物在完全康复之前不会放归其他动物的饲养系统。

5. 厚度测量和定量分析

注意:此 OCT 具有内置分析软件。可以使用该软件对 OCT 图像进行分割和分析（图 3）。

1. 打开分析软件，打开需要分析的 OCT 图像。
2. 选择层数，然后按 Get Initial Layers （图 3A）。该软件将自动绘制图层。
3. 单击 铅笔图标，然后移动目标图层上的点以微调图层（图 3A、B）。仔细地逐个修改所有图层。
   注意:添加更多图层是可行的。点击 加 图标，在 OCT 图像上画几个点，然后按 勾 图标。将创建一个新图层。
4. 完成图层的微调后，导出分割 OCT 的详细值（CSV 格式）和不同图像类型（图 3A）。
   注意:可以导出不同的图像类型，包括图层、厚度、厚度图、不带 OCT 的图层和屏幕截图。需要放弃与每张图像的视神经重叠的中间值并设置为零，因为那里没有视网膜层。

结果

图像引导 OCT 可用于监测小鼠激光诱导的脉络膜新生血管 （CNV） 中激光光斑的发育。如图 1 所示，新生血管穿过 Bruch 膜以及视网膜色素上皮 （RPE） 层，并在激光损伤后形成纤维化疤痕^11,12。这个病变点可以在全尺寸扫描（图 4A）或半尺寸扫描（图 4B）下捕获。建议使用半尺寸扫描，因为它可以提供放大的图片并使观察更集中在激光点上。当然，如果研究需要，可以监测更广泛的时间窗口，包括 0 天、3 天、7 天和 14 天。

在小鼠视神经压碎 （ONC） 模型中，测量了由视网膜神经纤维层 （RNFL） 、神经节细胞层 （GCL） 和内丛状层 （IPL） 组成的神经节细胞复合体 （GCC） 厚度的动态变化。使用圆形扫描类型（图 5A

讨论

该协议为图像引导 OCT 的图像采集和厚度测量提供了说明。通过展示四种最流行的啮齿动物眼部疾病模型，研究人员发现图像引导 OCT 在检查剧烈的视网膜结构改变方面提供了出色的性能。事实上，使用高分辨率图像，也可以在 OCT 图像中轻松发现微小的病变。在图像引导 OCT 的帮助下，实验室的一个小组还在微重力小鼠模型和 Cacna1f 突变小鼠模型中发现了 OPL 内异常的高反射率点^24,25。除此之外，还可以确定从玻璃体到脉络膜的其他微小结构变化 26,27,28,29。总之，高分辨率 OCT 可以提供微小病变以及视网膜结构重要改变的准确诊断

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BALB/c 小鼠	北京维达河实验动物科技有限公司		模型制剂
C57BL/6JNifdc 小鼠	北京维塔河实验动物科技有限公司		模型制剂
Carbomer Eye Gel	Fabrik GmbH 博士之路子公司Lomb		湿润角膜
完成弗洛伊德s 佐剂	Sigma	F5881	EAU实验
实验平台	凤凰科技集团		动物模型制剂
hIRBP161-180	上海桑贡生物工程技术有限公司Services Co.， Ltd. 服务有限公司		EAU 实验
氯胺酮	Ceva Sante Animale		全身麻醉
激光盒	Haag-Streit Group	Merilas 532α	动物模型制备
路易斯大鼠	北京维塔河实验动物科技有限公司		模型制剂
结核分枝杆菌 H37RA	Sigma	344289	EAU实验
使用图像引导OCT和图像引导激光的Phoneix Micron IV	凤凰科技集团		动物模型制剂
组织镊子	苏州明仁医疗器械有限公司	MR-F101A-5	动物模型制剂
托吡卡胺 去氧肾上腺素滴眼液	SANTEN OY，日本		散瞳 散
Vannas剪刀	苏州明仁医疗器械有限公司	MR-S121A	动物模型制剂
甲苯噻嗪	Ceva Sante 动物		全身麻醉