图像引导光学相干断层扫描评估啮齿类动物视网膜结构变化

Huiyi Zeng; Qiaoli Yang; Jingrun Chen; Liujun Ding; Fengqin Rao; Jineng Lv; Bintao Xie; Shengjin Xiang; Huanyun Yu; Xuejiao Chen; Kunchao Wu; Qi Chen; Lue Xiang

doi:10.3791/64783

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图像引导光学相干断层扫描评估啮齿类动物视网膜结构变化

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DOI：

10.3791/64783

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2023年2月10日

Huiyi Zeng^*¹ , Qiaoli Yang^*¹ , Jingrun Chen¹ , Liujun Ding¹ , Fengqin Rao¹ , Jineng Lv¹ , Bintao Xie¹ , Shengjin Xiang¹ , Huanyun Yu¹ , Xuejiao Chen¹ , Kunchao Wu¹^,² , Qi Chen¹ , Lue Xiang¹

¹State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry, and Vision Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, ²Department of Ophthalmology, The First People's Hospital of Guiyang

^* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文所述方案详细介绍了图像引导光学相干断层扫描（OCT）的数据采集与数据分析步骤，并展示了其在多种啮齿类动物眼科疾病模型中的应用。

摘要

年龄相关性黄斑变性、青光眼、视网膜色素变性以及葡萄膜炎等眼病通常伴随视网膜结构的改变。影响眼底的这些疾病常在视网膜特定细胞类型中表现出典型的异常，包括光感受器细胞、视网膜神经节细胞、视网膜血管细胞以及脉络膜血管细胞。临床实践和基础研究均需要具备无创性、高效率和良好适应性的成像技术。图像引导的光学相干断层扫描（OCT）技术满足了这些要求，因其结合了眼底照相与高分辨率OCT，能够对微小病灶以及视网膜结构的重要变化做出准确诊断。本研究详细阐述了图像引导OCT的数据采集与分析流程，并展示了其在脉络膜新生血管（CNV）、视神经挤压（ONC）、光诱导视网膜变性以及实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）等啮齿类动物模型中的应用。该技术有助于眼科领域的研究人员便捷、可靠且可追踪地识别啮齿类动物视网膜的结构变化。

引言

影响眼底的ocular疾病通常表现为视网膜中某些细胞类型的典型异常，例如光感受器细胞、视网膜神经节细胞、视网膜血管内的细胞以及脉络膜血管内的细胞，这些异常可能继而影响患者的视力¹。为避免不可逆的视力损害，需要及时诊断和适当治疗¹。光学相干断层扫描（OCT）已在临床上广泛用于评估多种ocular疾病，包括年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、青光眼、葡萄膜炎和视网膜脱离等²^,³^,⁴。这种无创、高效且适应性强的成像技术同样需要用于实验动物疾病状况的及时评估⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰。

图像引导的光学相干断层扫描（OCT）利用干涉测量技术，以1.8 µm的纵向分辨率和2 µm的轴向分辨率生成动物视网膜的横截面图像。该....

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方案

所有动物实验均符合眼科与视觉研究中动物使用问题的视力研究协会声明，并经温州医科大学（WMU）机构动物护理和使用委员会批准。大鼠和小鼠可自由获取水和食物，环境光照强度为18勒克斯，光照/黑暗循环周期为12小时光照/12小时黑暗。

1. 眼部动物模型的制备

小鼠激光诱导脉络膜新生血管（CNV）模型¹¹^,¹²
1. 使用氯胺酮和赛拉嗪麻醉4周龄雌性小鼠（C57BL/6J背景），并按照步骤3.2使用托吡卡胺去氧肾上腺素滴眼液散瞳。当轻捏脚趾无任何运动反应时，视为小鼠已充分麻醉。
2. 启动光源箱、软件和激光器（波长：532 nm），将输出能量调节至100 mW，持续时间调节至100 ms。
3. 将小鼠置于实验平台上，调整小鼠和平台的位置，直至眼底视野清晰。
4. 按下激光器屏幕上激光开启按钮，调节红色激光参考光斑的焦距。移动参考光斑，使其位于视盘旁1至2个瞳孔直径处，踩下脚踏开关实施激光损伤。
5. 立即检查激光照射后是否出现汽化气泡，这是激光损伤成功的标志。每只眼睛产生3至5个激光斑点。
小鼠视神经钳夹（ONC）模型

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结果

图像引导的光学相干断层扫描（OCT）可用于监测小鼠激光诱导的脉络膜新生血管（CNV）中激光斑的发展过程。如图1所示，新生血管穿过布鲁赫膜以及视网膜色素上皮（RPE）层，在激光损伤后形成纤维化瘢痕¹¹^,¹²。该病变区域可在全尺寸扫描（图4A）或半尺寸扫描（图4B）下被捕捉。推荐使用半尺寸扫描，因其可提供放大的图像，使观察更集中于激光斑区域。当然，若研究需要，也可监测更宽的时间窗口，包括损伤后0天、3天、7天和14天。

在小鼠视神经钳夹（ONC）模型中，测量了由视网膜神经纤维层（RNFL）、节细胞层（GCL）和内丛状层（IPL）组成的节细胞复合体（GCC）厚度的动态变化。采用环形扫描模式（图5A），在OCT图像中观察到节细胞的退行性特.......

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讨论

本方案提供了图像引导OCT的图像采集和厚度测量操作指南。通过展示四种最常用的啮齿类动物眼病模型，研究人员发现，图像引导OCT在检测显著的视网膜结构改变方面表现出优异性能。事实上，借助高分辨率图像，OCT图像中亦可轻松识别微小病灶。在图像引导OCT的辅助下，实验室团队还在微重力小鼠模型和Cacna1f突变小鼠模型中发现了外丛状层（OPL）内的异常高反射斑点²⁴^,²⁵。此外，还可识别从玻璃体到脉络膜之间的其他细微结构变化²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹。综上所述，高分辨率OCT不仅能够准确诊断微小病灶，还可揭示视网膜结构的重要改变⁵^,⁶^,

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披露

所有作者均无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢眼科学、视光学与视觉科学国家重点实验室成员在技术方面提供的支持以及对本文稿提出的宝贵意见。本研究得到了国家自然科学基金（82101169、81800857、81870690）、中国浙江省自然科学基金（LGD22H120001、LTGD23H120001、LTGC23H120001）、中国温州市科技局项目（Y20211159）、贵州省科技支撑项目（黔科合支撑[2020]4Y146）以及眼科学、视光学与视觉科学国家重点实验室项目（编号：K03-20220205）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
BALB/c 小鼠	北京维通利华实验动物技术有限公司		动物模型制备
C57BL/6JNifdc 小鼠	北京维通利华实验动物技术有限公司		动物模型制备
卡波姆眼用凝胶	Fabrik GmbH，Bausch 的子公司 && 罗姆		湿润角膜
完全弗氏佐剂’佐剂	Sigma	F5881	EAU实验
实验平台	凤凰科技集团		动物模型制备
hIRBP161-180	上海桑戈生物工程技术服务 &有限公司		EAU实验
氯胺酮	Ceva Sante Animale		全身麻醉
激光盒	Haag-Streit 集团	Merilas 532α	动物模型制备
Lewis大鼠	北京维通利华实验动物技术有限公司		动物模型制备
结核分枝杆菌 H37RA	Sigma	344289	EAU实验
Phoneix Micron IV 眼底成像系统，配备图像引导的光学相干断层扫描和图像引导激光	凤凰科技集团		动物模型制备
组织镊	苏州明仁医疗器械有限公司	MR-F101A-5	动物模型制备
托吡卡胺去氧肾上腺素滴眼液	SANTEN OY，日本		散瞳
Vannas 剪刀	苏州明仁医疗仪器有限公司	MR-S121A	动物模型制备
赛拉嗪	Ceva Sante Animale		全身麻醉

参考文献

Cen, L. -P., et al. Automatic detection of 39 fundus diseases and conditions in retinal photographs using deep neural networks. Nature Communications. 12, 4828(2021).
Kashani, A. H., et al.

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