该仔猪模型涉及外科手术操作、窒息至心脏骤停、复苏以及复苏后观察。该模型允许对每只动物进行多次采样，并通过连续有创动脉血压、心电图和无创心输出量监测，提供关于围产期窒息和新生儿心肺复苏中血流动力学及心脏病理生理学的知识。
本文内容
摘要
摘要
新生仔猪已被广泛用作围产期窒息的转化研究模型。2007年，我们在一个已建立的仔猪窒息模型基础上引入了心脏骤停，从而能够研究严重窒息对关键结局指标的影响，包括自主循环恢复（ROSC）所需时间，以及不同心肺复苏方案中胸外按压的效果。由于仔猪与人类新生儿在解剖和生理上的相似性，仔猪是心肺复苏及血流动力学监测研究中的良好模型。事实上，该心脏骤停模型已通过复苏方案、病理生理学、生物标志物以及新型血流动力学监测方法的研究，为临床指南的制定提供了证据支持。值得注意的是，研究中偶然发现相当一部分仔猪在心脏骤停期间出现无脉性电活动（PEA），这一发现可能进一步提高该模型的适用性（即可用于研究超出围产期范围的病理生理过程）。然而，该模型的建立在技术上具有挑战性，需要多种技能、专职人员以及对各项操作（包括手术方案和镇静剂/镇痛剂的使用）进行精细平衡，以确保合理的存活率。本文详细描述了该实验方案，并总结了多年来对方案进行调整的经验。
引言
围产期窒息是由于出生前、出生时和/或出生后气体交换受损（低氧血症和高碳酸血症）所引起的。其导致重要器官的血流减少（缺血），并继而引发混合性呼吸性和代谢性酸中毒。围产期窒息是一种常见的分娩并发症，每年在全球造成约58万名婴儿死亡1。降低这一数字对于减少新生儿以及5岁以下儿童的死亡至关重要，这也是联合国可持续发展目标3.2中提出的要求（即新生儿死亡率<每1000例活产12例，5岁以下儿童死亡率<每1000例活产25例）2。
临床上，新生儿窒息表现为缺氧缺血性脑病（HIE）、呼吸抑制和循环衰竭3（即重要器官缺氧缺血的症状和体征）4。因此，窒息新生儿可能需要接受脑病治疗，包括控制惊厥，以及高级呼吸和循环支持。全球范围内，每年多达1000万新生儿需要某种形式的干预措施，例如触觉刺激，其中600万至700万新生儿在出生时需要辅助通气5。因此，围产期窒息给医疗保健系统带来巨大压力，并带来相应的社会经济影响。为了减轻围产期窒息所致的全球疾病负担，我们的研究团队认为，科学研究应重点关注以下领域：预防措施，包括改善产前和产科护理及随访；预后生物标志物；以及优化产房内的复苏和稳定治疗6。
接近足月妊娠的新生仔猪与人类婴儿具有相似的解剖结构和病理生理学特征7。尽管目前尚无任何围产期窒息和心脏骤停的动物模型能够完全模拟导致窒息和心脏骤停的围产期过渡失败的全部情况，但仔猪是良好的转化医学模型。
早在20世纪70年代，我们就建立了成年猪的缺氧模型8。此后该模型被多个研究团队成功优化9，从而建立了新生儿窒息的新生仔猪模型10,11,12,13,14,15,16,17,18。2007年，奥斯陆大学医院外科研究所首次在新生仔猪中开展了心脏骤停实验11,13,15,16。该骤停模型为临床指南的制定提供了证据10,13,15,16,19,20，同时也为生理学研究以及设备/诊断工具的测试14,21、复苏方案（随机对照研究）13,15,16,22和血液及组织生物标志物的研究10,12,20提供了广泛的机会。因此，该模型已被证明具有高度的多功能性，传统上单次实验系列即可用于回答多个科研问题。这一点非常重要，也符合实验动物研究的“3R原则”（减少、替代与优化）23（即减少为科学目的而牺牲的动物数量的原则）。
以下方案详细描述了围产期窒息的仔猪模型，包括如何诱导、定义和确认心脏骤停。该模型经过优化，以尽量减少镇静剂的使用和手术干预，并包含机械通气、窒息、复苏、复苏后观察，以及血液、尿液和脑脊液样本的采集。我们研究组通常还会在动物死亡后采集重要器官组织，但本方案未详细描述组织采集过程。该模型模拟了伴有混合性呼吸性和代谢性酸中毒的缺氧损伤，反映了窒息新生儿的生化特征。通过使用有创血压（BP）和心率（HR）、脉搏血氧饱和度（PO）、心电图（ECG）、阻抗心动图（ICG）以及近红外光谱（NIRS）等技术对仔猪进行密切监测，可深入研究围产期窒息的生理过程，尤其重点关注心脏功能的变化。
该模型在技术上具有挑战性，需要在药物使用、外科干预以及诱导心脏骤停的方法之间达到极为精细的平衡，以确保合理的存活率。开展此类实验需要充分的准备以及一个专注且配合良好的团队。实验动物的选择似乎也在确保实验成功方面起着重要作用。本文中，我们详细描述了该实验方案及我们的相关经验。
方案
本方案已获得挪威食品安全局批准（批准编号：25030），实验操作均依照欧洲、挪威及机构相关规定进行。该模型的重复实验需根据机构和国家法规获得动物实验的伦理批准，并确保按照“3R原则”23开展实验。所有操作动物的人员均须根据欧盟指令2010/63/EU24第23条和第24条的要求，取得功能A、B和D的认证，或具备同等资质。在整个实验过程中需密切监测动物状态，并调整麻醉、呼吸机参数、体温及动物体位，以保障动物福利。应定期对模型及其应用进行审慎评估，并在必要且可行的情况下进行优化。
注意：本研究中使用的仔猪年龄为12-36小时，体重为1.7-2.3 kg，性别分布均衡，为挪威兰德瑞斯猪、杜洛克猪和约克夏猪的混种，且未经基因改造。本方案的步骤1和步骤2包括贯穿整个实验的全身麻醉和数据采样操作，步骤3至10详细描述了实验操作，包括动物准备、外科干预、窒息至心脏停搏、复苏以及复苏后观察。
1. 麻醉方案（时间：适用于整个实验）
- 通过耳缘静脉的外周静脉导管，静脉推注芬太尼（50 µg/kg）和戊巴比妥（15–20 mg/kg）以诱导麻醉。
警告：芬太尼若被吸入或摄入有害，且对眼睛和皮肤有刺激性。该药物属于管制药品，其供应和使用应根据管制药品的相关法规进行监控和管理。戊巴比妥若被摄入有害，并对眼睛和皮肤有刺激性。 - 在窒息前持续以静脉输注芬太尼（50 µg/kg/h）维持麻醉，在窒息期间停止给药，并在自主循环恢复（ROSC）后以25 µg/kg/h重新开始给药。
注：本模型中使用的高剂量芬太尼麻醉方案是在新生儿科医生和小儿麻醉科医生的协作下，经过数十年不断优化而形成的。在成人和新生儿中，高剂量芬太尼麻醉与心血管和血流动力学稳定性相关25,26。然而，一项在新生仔猪中的研究表明，芬太尼的使用与心率（HR）和心输出量（CO）降低，以及平均动脉压（MAP）、左心室舒张末期压力和外周总阻力指数升高相关27。 - 在整个实验过程中持续监测仔猪的健康状况。检查肌张力并评估生命体征，以确保仔猪已充分麻醉。若仔猪出现痛苦迹象，应根据临床判断追加静脉注射芬太尼或戊巴比妥。
2. 数据采样与记录（时间：适用于整个实验）
- 为每只仔猪打印一份纸质病例报告表（CRF）。该报告表包含心率（HR）、血压（BP，包括平均动脉压 MAP）、血氧饱和度（SpO2）、区域脑氧饱和度（NIRS）、体温、额外用药情况以及寒战等信息。
- 在 CRF 上为仔猪分配一个编号，并在首页记录仔猪的体重和性别。
- 在稳定期间每 5 分钟进行一次记录，并在窒息诱导前立即记录一次。窒息诱导后，首次记录在 10 分钟时进行，随后每 5 分钟记录一次，直至心脏停搏。若实现自主循环恢复（ROSC），应在 ROSC 后尽快进行首次记录，ROSC 后第一个小时内每 5 分钟记录一次，之后在整个观察期的剩余时间内每 30 分钟记录一次。
- 在 CRF 上注明采集不同样本的时间。
- 在稳定期开始时、窒息诱导前、心脏停搏时、ROSC 时，以及 ROSC 后 30 分钟、60 分钟、120 分钟、240 分钟、540 分钟和研究结束时（570 分钟）采集全血和血浆。
注：重要的是要计算每只仔猪可采集的血量。例如，体型较小的仔猪、状态不稳定的仔猪以及因颈部手术导致失血的仔猪，采血量应减少。在整个实验过程中密切监测酸碱状态中的血红蛋白（Hb）水平也至关重要。本研究中，Hb <6 g/dL 的仔猪被排除。 - 在 ROSC 后 240 分钟和研究结束时（570 分钟）采集尿液。
- 在稳定期开始时、窒息诱导前、窒息诱导后 10 分钟，以及此后每 5 分钟采集一次酸碱状态，直至心脏停搏。在心脏停搏时、ROSC 时，以及 ROSC 后 5 分钟、15 分钟、30 分钟、60 分钟、120 分钟、240 分钟、540 分钟和研究结束时（570 分钟）也需采集酸碱状态。
- 在研究结束时（570 分钟）采集脑脊液（CSF）。
- 在稳定期开始时、窒息诱导前、心脏停搏时、ROSC 时，以及 ROSC 后 30 分钟、60 分钟、120 分钟、240 分钟、540 分钟和研究结束时（570 分钟）采集全血和血浆。
- 通过中心动脉导管采集全血和血浆。
- 使用肝素化注射器从中心动脉导管中抽出 2 mL 血液，暂置一旁。
- 然后，使用新的肝素化注射器抽取 2.5 mL 血液。将最后抽取的 0.5 mL 全血放入微量离心管中，并在液氮中速冻。
- 将剩余的 2 mL 血液放入适当大小的 EDTA 管中，在 4 °C 条件下以 1,700 × g 离心 10 分钟。用移液器将血浆（位于白膜层和红细胞上方的上清层）转移至微量离心管中，并在液氮中速冻。
- 使用新的肝素化注射器从中心动脉导管中再抽取 0.2 mL 血液。将注射器放入血气分析仪（见材料表），并填写相关信息（编号、时间点和仔猪体温）。
- 将先前抽出并保存在第一个肝素化注射器中的血液推回动脉导管中。用肝素化生理盐水冲洗动脉导管，确保所有血液均返回仔猪循环系统。
- 通过耻骨上穿刺法采集尿液。
- 定位解剖标志：位于最低两对乳头之间的区域，脐部下方约 2 cm 处，中线旁数毫米处。
- 使用带有 23 G 套管针的 10 mL 注射器。垂直进针约 1 cm，抽吸直至注射器充满尿液。将尿液放入冻存管中，并在液氮中速冻。
- 通过腰椎穿刺采集脑脊液（CSF）。
- 将仔猪侧卧，将后肢向胸部方向屈曲。定位解剖标志：在仔猪髂嵴水平的脊柱突之间。
- 将 21 G 套管针略向头侧方向插入脊柱突之间，直至脑脊液流出。将脑脊液放入微量离心管中，并在液氮中速冻。
- 使用数据采集与分析软件（见材料表）连续采集心电图（ECG）和有创动脉血压（BP）数据（见步骤 6 和步骤 7）。使用商用 NIRS 仪器（见材料表）进行 NIRS 检测（见步骤 7）。
3. 准备（时间：数周至数月，根据需要而定）
- 获得动物实验的伦理审批。
- 联系农户，组织挑选仔猪（年龄：12–36 小时，性别分布均衡，体重：1.7–2.3 kg），并安排交付日期和运输事宜。
注意：为减少生物学和生理学上的变异，应尽量选择同一品种（本研究中为挪威兰德瑞斯猪、杜洛克猪和约克夏猪的混合品种）、同一农场、理想情况下来自同窝且年龄范围较窄的仔猪。 - 确保在预定日期有足够人员在场。
- 检查所有必要设备是否齐备，所有仪器和观察工具是否正常工作。检查缺氧气体（8% O2, 92% N2）的有效期，并确认其未用尽。
- 布置实验室及所有设备，确保已准备好接收仔猪，并对所有必要设备进行校准。
- 若为随机对照试验，需进行样本量估算，并准备仔猪的随机分组。
4. 接收仔猪（时间：10 分钟至 2 小时，取决于仔猪数量）
- 在实验当天，安排将家养猪仔从农场运送至手术设施。在运输容器的底部铺上细木屑和热水瓶，以维持猪仔的体温。在容器上钻出小孔，确保空气流通。
- 向养殖户获取猪仔的年龄和体重信息，并在猪仔到达后核实其体重。
- 当猪仔在容器内处于安静放松状态时，将脉搏血氧仪（PO）探头（参见材料表）放置于猪仔的后肢，测量其 SpO2 和心率（HR）。
- 准备好所有器械，并打开手术台上的电热垫，开始加热。
- 让猪仔在容器中休息，直至团队所有成员均准备好进行麻醉诱导和手术操作。
5. 麻醉诱导、插管与机械通气（用时：15 分钟）
- 准备静脉通路和插管所需的设备。
- 将脉搏血氧饱和度（PO）探头置于后肢，用于监测麻醉诱导和插管期间的氧合情况及心率（HR）。
- 确保操作人员一固定好包裹后的仔猪，使其保持静止和安静；操作人员二在耳缘静脉插入外周静脉导管。用约1 mL生理盐水冲洗导管以确认位置正确，并用胶带固定导管。
- 通过耳缘静脉注射芬太尼和戊巴比妥的负荷剂量（如步骤1.1所述）。用1 mL生理盐水冲洗导管。通过评估仔猪的退缩反射来确认其是否已进入麻醉状态。
- 确保操作人员一将仔猪置于仰卧位。打开其口腔，用10 cm × 10 cm的纱布块拉出舌头，并保持喉部处于一条直线上。
- 确保操作人员二使用喉镜（见材料表）抬起舌头。推进喉镜以抬高会厌并暴露声带。将气管内导管（ETT，见材料表）经声带插入。
注意：使用带气囊的ETT可能会增加导管通过声带的难度。若插管困难，尤其需密切监测仔猪的生命体征。若生命体征下降，应将面罩覆盖于仔猪吻部，连接自充气复苏球囊，手动通气直至生命体征恢复正常，然后再次尝试插管。若仍困难，可考虑追加一次戊巴比妥剂量。在极少数情况下（如上呼吸道畸形），需行气管切开术。但由经验丰富的人员操作时，通常可顺利插管。 - 将ETT连接至自充气复苏球囊（见材料表），开始手动通气。
- 通过以下方式确认ETT位置正确：1）通气时双侧胸廓对称均匀抬升；2）双肺听诊区呼吸音对称，剑突区域无气体进入音；3）SpO2和心率（HR）反应良好；4）ETT内出现冷凝水。如有疑问，可对呼出CO2进行（半）定量检测。
- 充盈ETT气囊。使用纵向剖开的胶带，在距前牙稍远位置将ETT固定于12–13 cm深度（适用于2 kg仔猪）。将胶带绕在ETT位于前牙远端的部分，并继续绕过吻部进行固定。
- 持续手动通气，直至仔猪转移至手术操作台并连接机械呼吸机。在台上，将ETT连接至机械呼吸机（见材料表），设置如下参数：PInsp = 15–20 cm H2O，PEEP = 5.0 cm H2O，FlowInsp = 8.0 L/min，频率 = 30 bpm，TInsp = 0.34 s。
注意：若仔猪SpO2 <90%，可逐步提高PInsp 和呼吸频率，直至SpO2 ≥90%。若复苏方案不涉及不同FiO2的比较，可使用辅助氧气。 - 插入直肠温度计，并用外科胶带固定于仔猪尾部周围。
- 通过在仔猪周围覆盖温热的毯子或毛巾形成巢状保温，调节仔猪下方加热垫的温度，和/或使用装有热水的橡胶/乳胶手套置于包裹仔猪的毛巾中，维持其体温在38.5–39.0 °C。在手术过程中持续监测体温，并根据需要采取体温稳定措施。
6. 外科干预（用时：20 分钟）
- 准备好所有必要的设备，并用生理盐水填充所有导管（图1）。在病例报告表（CRF）上记录手术干预开始的时间。
- 使用5 mg/mL的有色氯己定溶液，配合3-5块外科纱布，对麻醉后的仔猪皮肤进行消毒。
- 使用手术刀在仔猪颈部右侧做一条长2.5 cm的皮肤切口。
- 使用眼睑拉钩将切口两侧的皮肤牵开。
- 使用动脉钳分离并暴露颈内静脉（图2）。
- 在颈静脉下方放置两根3-0尼龙缝合线，以保持静脉稳定。
- 一只手握住其中一根缝线，另一只手握住中心静脉导管（图3），插入中心静脉导管，然后撤出针芯。
- 将用于固定静脉的一根缝线在导管进入静脉的部位结扎于静脉（及导管）周围（图4）。
注意：确保固定缝线不要过紧地绑在导管周围，且结扎位置应位于导管远端尖端的近端。 - 用1 mL生理盐水冲洗，以确认导管位置正确。
- 使用可吸收的4-0缝线缝合皮肤。
- 将芬太尼（50 µg/kg/h）和平衡碳水化合物-电解质溶液（含葡萄糖10 mg/mL，参见材料表）连接至中心静脉导管。
- 使用手术刀在仔猪颈部左侧做一条长2.5 cm的皮肤切口，切口位置略较右侧切口偏内侧。
- 使用眼睑拉钩将切口两侧的皮肤牵开。
- 随后使用动脉钳分离并暴露颈总动脉（位于胸锁乳突肌内侧）。
- 在颈总动脉下方放置两根3-0尼龙缝合线，以保持动脉稳定。
- 一只手握住其中一根缝线，另一只手握住中心动脉导管，插入中心动脉导管，然后撤出针芯。
- 将用于固定动脉的一根缝线在导管进入动脉的部位结扎于动脉（及导管）周围。
注意：确保固定缝线不要过紧地绑在导管周围，且结扎位置应位于导管远端尖端的近端。 - 用1 mL生理盐水冲洗，以确认导管位置正确。
- 使用可吸收的4-0缝线将导管翼固定于皮肤，并缝合皮肤。
- 连接有创动脉血压监测装置（参见材料表），并使用数据采集与分析软件开始记录。
注意：确保有创动脉血压换能器在心脏水平进行校准，以获得准确的血压读数。 - 覆盖透明敷料。此时，中心动脉导管已放置到位。
- 在病例报告表（CRF）上记录手术结束时间。
7. 稳定期（时间：至少1小时，或根据需要延长，以确保仔猪在手术后生命体征稳定，并为工作人员准备窒息诱导做好准备）
- 将仔猪连接至心电图监测设备（参见材料表）。
- 根据需要剃除并清除电极放置部位的毛发。将两个电极分别置于胸腔两侧——即每侧前肢内侧，第三个电极置于脐部左侧。
- 将导联线连接至电极，并使用数据采集与分析软件开始记录。
- 将仔猪连接至无创心输出量（CO）监测设备（参见材料表）。
- 根据需要剃除并清除电极放置部位的毛发（参见材料表）。第一个电极置于仔猪头部顶部，眼睛后方；第二个电极置于颈部左侧；第三个电极置于腹部左侧，腋中线水平与脐部齐平；第四个电极置于左大腿。
- 在设备上填写相关信息并开始记录。由于设备内部存储空间有限，应根据实验持续时间调整采样频率。
- 将仔猪连接至近红外光谱（NIRS）监测设备。
- 根据需要剃除并清除电极放置部位的毛发。将NIRS电极（参见材料表）置于仔猪头部顶部，位于无创CO监测电极后方，并用不透光胶带固定以避光。
- 根据需要连接其他监测设备，若实验方案包含，则进行超声心动图检查。
- 将仔猪置于舒适体位，首选俯卧位。
- 在稳定期进行各项测量与记录，并填写至病例报告表（CRF）（参见步骤2）。
- 在稳定期内观察仔猪的体温、血氧饱和度（SpO2）、心率（HR）、血压（BP）及寒战情况。根据需要调整呼吸机参数、仔猪体温及追加麻醉药物。
8. 诱导窒息与心脏骤停（时间：15–60 分钟，因仔猪而异）
注意：所有相关人员在诱导窒息前均需明确各自职责。
- 确定窒息开始时间（根据稳定持续时间和人员可用性），并将该时间记录在病例报告表（CRF）上。
- 在诱导窒息前，记录仔猪的生理参数于病例报告表（CRF）上，并采集血样。
- 在窒息开始前立即停止静脉输注芬太尼。
- 为开始窒息，将机械呼吸机的氧气调节旋钮调至100%，并将呼吸机上的氧气管切换至窒息气体（8% O2, 92% N2）。
- 将呼吸机通气频率降低10次/分钟。
- 确认仔猪的SpO2下降，以确保诱导成功。
- 窒息10分钟后，再次将呼吸机通气频率降低10次/分钟。
- 在窒息10分钟后，以及此后每5分钟，检测酸碱状态，并在病例报告表（CRF）上记录仔猪的生理参数。持续监测直至心脏停搏。
- 窒息20分钟后，再次将呼吸机通气频率降低10次/分钟。
- 窒息30分钟后，使用动脉钳夹闭气管导管（ETT）。
- 当平均动脉压（MAP）降至20 mm Hg以下时，开始持续听诊心脏。
注意：心脏停搏定义为听诊无法闻及心音和/或动脉导管搏动消失。需注意心电图（ECG）上可能出现无脉性电活动（PEA）。 - 确保由第一人进行心脏听诊。当心音不再可闻（心脏停搏）时大声报出，同时移除气管导管（ETT）上的夹子。确保第二人将呼吸机上的窒息气体管路切换回氧气出口。在病例报告表（CRF）上记录心脏停搏时间，并启动计时器。
- 根据实验方案设定吸入氧浓度（FiO2）（本研究中，仔猪被随机分配接受FiO2为0.21或1.0）。设置呼吸机参数如下：PInsp = 30 cm H2O，PEEP = 5.0 cm H2O，FlowInsp = 8.0 L/min，频率 = 40 bpm，TInsp = 0.34 s。
- 按照步骤2.5所述，采集心脏停搏时间点的血样。
9. 心肺复苏（CPR）（时间：0-15 分钟）
注意：心肺复苏（CPR）可按照国际复苏联络委员会（ILCOR）指南28进行，胸外按压与通气比例为3:1，或根据研究目的采用不同的胸外按压与通气比例。
- 若采用ILCOR推荐的3:1心肺复苏（CPR）方案，请执行以下步骤。
- 在心脏骤停后对仔猪进行30秒的机械通气，随后开始胸外按压，目标为按压与通气比例为3:1。
注：由于通气由呼吸机完成而非人工操作，胸外按压与通气有时可能同时发生或不协调。 - 按压深度为胸腔前后径的1/3，确保胸廓充分回弹，并采用双手环抱双拇指按压技术。目标是产生≥20 mm Hg的动脉收缩压。
- 在开始胸外按压30秒后静脉注射肾上腺素（0.02–0.03 mg/kg），之后每3分钟CPR给药一次（最多四次）。每次肾上腺素给药后用1 mL生理盐水冲管。
- 在心脏骤停后对仔猪进行30秒的机械通气，随后开始胸外按压，目标为按压与通气比例为3:1。
- 通过观察动脉血压波形和心电图（ECG）判断自主循环恢复（ROSC），并结合心脏听诊确认。ROSC的定义为稳定且无需辅助的心率≥100次/分钟（bpm）。
- 持续复苏操作直至实现ROSC或最长15分钟。若在15分钟内CPR未成功，则停止复苏，记录死亡时间，并在病例报告表（CRF）中登记。
- 若复苏成功，应在病例报告表（CRF）中记录ROSC时间、CPR持续时间（以秒为单位）以及给予肾上腺素的次数。
- 在ROSC后尽快采集血样并进行病例报告表（CRF）登记，并继续按照第2步所述方法进行后续9.5小时（570分钟）的登记。
10. ROSC 后观察（时间：9.5 小时）
- 重新启动芬太尼静脉输注，初始剂量为 25 µg/kg/小时，根据临床效果/需求进行滴定。
注意：在窒息期间及之后，代谢率降低，因此静脉注射芬太尼的剂量较低。然而，部分仔猪可能需要更高的输注速率，因此观察仔猪的生命体征和反射反应至关重要。 - 仔细监测仔猪 9.5 小时。根据需要调整呼吸机参数，以维持 SpO2 ≥90% 并维持常碳酸血症（温度校正后的二氧化碳分压）2 (pCO₂)25–7.5 kPa）
- 保持仔猪体温在 38.5-39.0 °C，并根据需要采取温度校正措施。
注意：仔猪在窒息期间及之后容易出现低体温。 - 根据病例报告表（CRF）规定的时间点（步骤2）采集样本并进行CRF登记。
- 在ROSC后9.5小时观察时，处死仔猪（步骤11）。
注意：部分仔猪可能无法存活至复苏后观察9.5小时结束。若仔猪出现明显痛苦迹象且病情恶化，应提前实施安乐死。
11. 安乐死（时间：10 分钟）
- 准备好解剖台，配备必要的手术器械、用于储存组织样本的离心管以及液氮，以便快速冷冻样本。
- 按照步骤2所述方法采集实验终点（570分钟）的样本。
- 静脉注射戊巴比妥钠150 mg/kg，进行解剖，将器官样本放入标记好的低温冻存管中，并在液氮中快速冷冻。如有需要，可将一半脑组织保存于福尔马林中。
- 将实验所得样本（全血、血浆、尿液、脑脊液及器官样本）置于−80 °C冰箱中保存，或根据后续分析要求采用其他方式储存。
图1：放置外科手术器械的无菌台。 颈部手术开始前，外科手术器械已准备就绪并存放于无菌台上。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：颈内静脉。 颈内静脉在游离并暴露后的状态。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：中心静脉导管的插入。 在插入中心静脉导管之前，缝合线已被固定。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：用于固定中心静脉导管的缝合线。 缝合线围绕静脉（及导管）打结，以将导管固定于静脉内。 请点击此处查看该图的放大版本。
结果
在仔猪完成仪器连接并稳定后，使用数据采集与分析软件持续收集心电图（ECG）和血压（BP）测量值。窒息期间的血流动力学变化可在软件中清晰观察到（图5）。在窒息过程中，血压逐渐下降，直至心脏停搏时血压降至0。恢复自主循环（ROSC）后，血压上升，经过一段时间后再次恢复正常。血压和心电图数据可用于多种类型的分析，例如，心肺复苏（CPR）期间冠状动脉灌注压的计算，以及窒息前、窒息期间和/或窒息后血压与心电图节律及形态的变化分析。
采用阻抗心动图（一种无创心输出量测量方法）持续监测心脏每搏输出量和心脏指数21。为研究心脏损伤，检测心肌氧化应激和无氧代谢的相关标志物19。此外，还可测定血浆中的心肌酶，包括心肌肌钙蛋白T（结果尚未发表）。
缺氧改变了仔猪的生理状态。图6展示了心率（图6A）、平均动脉压（MAP，图6B）、pH值（图6C）、pCO2（图6D）、碱剩余（图6E）和乳酸（图6F）在整个实验过程中变化的一个示例。如预期所示，在缺氧期间，MAP、pH值和碱剩余下降，而pCO2和乳酸升高（混合性呼吸性和代谢性酸中毒）。接近实验结束时，各项指标逐渐恢复正常。
既往实验使用气管切开的仔猪11,13,15,16,19（即气道无泄漏）。为减少手术应激，自2019年起的实验中，仔猪采用经气管插入无套囊气管导管（ETT）的方式。在这些实验中21，观察到自主循环恢复（ROSC）率明显降低。因此，在近期实验中，我们比较了使用无套囊与有套囊ETT时的ROSC率。使用无套囊ETT时，19只仔猪中有7只实现ROSC；而使用有套囊ETT时，5只仔猪全部实现ROSC（p = 0.012）（未发表结果）。该发现支持在此模型中维持无泄漏气道的重要性。
图 5：使用数据采集与分析软件进行连续数据采样。 连续数据采样在数据采集与分析软件中的显示示例。（A）整个实验的血压（BP）。（B）逐搏的血压（BP）和心电图（ECG）复合波形。不同实验阶段在图（A）中标注：1）窒息开始，2）心脏停搏与心肺复苏（CPR），3）自主循环恢复（ROSC）。请点击此处查看该图的放大版本。
图6实验过程中心血管和代谢变量的变化。 展示实验过程中不同变量的变化情况。所示的六个时间点如下：缺氧开始前（基线）、缺氧10分钟、心脏骤停、自主循环恢复（ROSC）、ROSC后120分钟，以及研究结束时（ROSC后570分钟）。A心率（HR），B平均动脉压（MAP），（CpH，（D二氧化碳分压2 (pCO₂)2), (E) 碱剩余，以及（F乳酸 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
该仔猪模型耗时较长且技术难度较高，包含多个关键步骤。需要在药物使用、外科干预以及心脏骤停诱导方法之间取得精细平衡，以确保合理的存活率。由于该实验方案持续时间相对较长，并包含多个关键步骤，因此开展实验需要充分的准备以及一个专注且配合良好的团队，且实验应在具备大型动物研究经验的机构中进行。我们的研究团队曾同时对一至三只仔猪进行实验。建议在实验过程中始终至少有两人在场，若同时对三只仔猪开展实验，则至少需要三人。
实验中尤为关键且技术上具有挑战性的部分包括以下几点：1）确保所有设备正常运行，并且所有数据采样工具均可用、功能正常且已完成校准；2）良好的机械通气效果，特别是在窒息前及心肺复苏（CPR）期间；3）外科手术操作；4）窒息的诱导；5）确认心脏骤停的发生；6）心肺复苏（CPR）；7）样本采集，尤其是在心脏骤停和自主循环恢复（ROSC）等时间敏感的关键节点。本实验方案中最关键的步骤是窒息的诱导和心脏骤停的确认。在早期实验中，曾向窒息气体中添加CO2，以更真实地模拟围产期窒息所引起的混合性呼吸性和代谢性酸中毒10,11,13,14,15,16,20。然而，在后续实验中7,21,22，由于无法获得CO2气体，通过降低机械通气频率并在20–30分钟后夹闭气管导管（ETT），同样观察到了混合性呼吸性和代谢性酸中毒的发生。心脏骤停时的高CO2水平不仅对于模拟临床情况至关重要，还可能影响自主循环恢复（ROSC）。其原因可能是心脏骤停发生在特定的pH值范围内，而该pH值同时受乳酸和CO2水平的影响。由于高碳酸血症比乳酸性酸中毒更容易逆转，因此以呼吸性酸中毒为主还是以代谢性酸中毒为主，可能决定了仔猪从窒息中恢复的速度。其他用于围产期窒息或缺氧缺血性脑病（HIE）的仔猪模型通常在心脏骤停发生前即开始再氧合/复苏，通常依据平均动脉压（MAP）数值或窒息持续时间进行（例如，窒息45分钟29，窒息2小时30，MAP降至20 mmHg31，MAP为30–35 mmHg30，MAP较基线下降70%29,32）。本模型的优势在于，通过诱导心脏骤停，可以研究新生儿心肺复苏（CPR），并在心脏骤停前、期间及刚发生后采集数据。值得注意的是，研究中偶然发现相当一部分仔猪在心脏骤停期间表现为无脉电活动（PEA）7,33，这一现象可能使该模型的应用范围超出围产医学领域34。
多年来，该模型不断优化，以尽量减少仔猪接触镇静剂和外科手术干预，并改善数据采样与记录。早期方案10,11,13,14,15,16,20采用七氟烷诱导麻醉，但目前已弃用此方法，因为现行方案直接通过耳缘静脉建立静脉通路并给予静脉药物。由于在由受过培训的操作人员插入外周静脉导管前，仅通过用毛巾包裹仔猪即可有效避免其产生应激反应，因此该方法可行。在早期实验方案中也曾使用咪达唑仑；然而，执行绝大多数尸检的研究人员（R.S.）主观评估认为，若以持续输注方式使用咪达唑仑，尸检时脑组织状态更差。因此，目前我们仅使用静脉注射芬太尼来维持麻醉。仅当仔猪出现应激迹象且芬太尼和/或戊巴比妥无效时，方可考虑以推注剂量使用咪达唑仑；但我们在实践中几乎从未需要使用。
在其他改进方面，以往的实验中，仔猪通过声门下切口进行气管造口术，并插入牢固固定的气管导管。该操作可提供无泄漏的气道，但会给仔猪带来手术应激。另一方面，由于仔猪上呼吸道较大，使用无套囊气管导管（ETT）进行气管插管时存在明显的漏气问题。因此，我们开始采用带套囊的气管导管（ETT），这实现了零漏气，并显著提高了自主循环恢复（ROSC）率，结果与气管造口术仔猪的实验相当。此外，在数据采样方面也进行了一些调整。以往部分实验7,19,22,33,35,36在左侧颈总动脉周围放置了血流探头。然而，近年来我们奥斯陆实验室难以获得该血流探头。埃德蒙顿实验室仍在使用颈动脉血流探头，其应用可能为模型提供有价值的附加血流动力学数据。少数先前实验还通过颈动脉插入导管至左心室，使用了压力-容积导管。但由于胸外按压干扰了压力-容积导管的信号记录，某些情况下甚至导致导管故障或损坏，因此在心脏骤停模型中已弃用该方法。最近，实验方案中新增了无创心输出量（CO）监测设备，我们正致力于优化心脏骤停及心肺复苏期间的心电图（ECG）信号，因其可能提供有关心电图形态和电-机械分离（PEA）的有价值信息。最后，自主循环恢复（ROSC）后的观察时间已从4小时延长至9.5小时，因为4小时过短，不足以检测组织病理学变化、细胞死亡以及某些生物标志物的改变。
该模型以及将仔猪普遍用作转化研究模型的一个最重要局限性在于，与产房心肺复苏不同，仔猪出生后的 cardiopulmonary 转变已经完成。仔猪不太可能存在开放的胎儿心血管分流通道和高肺动脉压力，而这些特征在窒息新生儿中是典型的。尽管 Fugelseth 等人的一项研究37使用了本仔猪窒息模型的早期版本（非心脏骤停模型），表明在窒息期间仔猪体内的血管分流可能重新开放，但其对通气和血流动力学支持的反应可能有所不同。因此，生理学测量结果并不总是能代表正在经历过渡期的人类新生儿。仔猪与新生儿之间也存在一些解剖学差异，例如仔猪的上呼吸道较大，容易导致气管导管（ETT）漏气（因此使用带套囊的 ETT 至关重要），以及基础体温较高。
尽管存在这些局限性，全球科研界长期以来一直将新生仔猪作为围产期窒息的转化研究模型。猪在解剖结构、生理学、组织学、生物化学和炎症反应等方面与人类相似38，除了足月时出生体重较低（1.5–2.5 kg）外，新生仔猪的体型与人类新生儿相当接近。其体型和解剖结构使得可以进行插管、监测、影像学检查以及采集生物样本，操作方式与人类新生儿相似。该模型还适用于复苏研究，因为胸外按压的操作方式与人类新生儿类似，且相对容易实施；猪的心脏解剖结构和生理特征与人类相似39，包括冠状动脉血流分布、传导系统的血液供应、心肌的组织学形态，以及对缺血性损伤的生化和代谢反应40。另一个重要因素是，新生仔猪的围产期脑发育程度与人类新生儿相近41，窒息后会产生类似的生化反应，表现为高碳酸血症以及混合性呼吸性和代谢性酸中毒，这与窒息新生儿的病理生理变化相似。
总之，围产期窒息模型在技术上具有挑战性且耗时较长。然而，该模型能够提供围产期窒息期间生理及血流动力学变化的宝贵信息，可用于新生儿复苏研究，并可揭示心脏骤停前、中、后期的生理变化，这些信息也可能对围产医学以外的其他医学研究领域具有重要意义。
披露
作者无任何与本文相关的利益冲突需要披露。
致谢
我们谨向所有协助我们在本机构建立、开发和完善这一新生仔猪围产期窒息与心脏骤停模型的研究员和研究人员表示感谢。感谢挪威奥斯陆大学外科研究所和比较医学研究所动物实验设施的工作人员，以及加拿大埃德蒙顿阿尔伯塔大学研究技术人员多年来在合作中的大力支持。感谢奥斯陆大学医学生科研项目、挪威研究理事会以及挪威SIDS与死产协会为本出版物提供的经费支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 酸碱分析仪（ABL 800 Flex） | Radiometer Medical ApS, Brønshøj, 丹麦 | 989-963 | |
| 适用于 PC 的 AcqKnowledge 4.0 软件 | Biopac Systems Inc., Goleta, CA, 美国 | ACK100W | |
| 粘性开口巾 | OneMed Group Oy, 赫尔辛基, 芬兰 | 1505-01 | |
| 肾上腺素（1 mg/mL） | Takeda AS, Asker, 挪威 | Vnr 00 58 50 | 用生理盐水稀释 1:10 至 0.1 mg/mL |
| 动脉导管 20 G 1.10 mm x 45 mm | Becton Dickinson Infusion Therapy, 赫尔辛堡, 瑞典 | 682245 | |
| 动脉钳 | 任意品牌 | ||
| 窒息用气体，8% 氧气/氮气混合气 | Linde Gas AS (AGA AS), 奥斯陆, 挪威 | 110093 | |
| Benelyte, 500 mL | Fresenius Kabi, Norge AS, 哈尔登, 挪威 | 79011 | |
| Biopac 心电图与有创血压模块，型号 MP 150 | Biopac Systems Inc., Goleta, CA 93117, 美国 | ECG100C, MP150WSW | |
| 用于样本储存的纸板箱 | Syhehuspartner HF, 奥斯陆, 挪威 | 2000076 | |
| 导管，23G x 1 1/4"- Nr.14 | Beckton Dickinson S.A., Fraga, 西班牙 | 300700 | |
| 导管，18G x 2" | Beckton Dickinson S.A., Fraga, 西班牙 | 301900 | |
| 导管，21G x 1 1/2"- Nr.2 | Beckton Dickinson S.A., Fraga, 西班牙 | 304432 | |
| 离心机（Megafuge 1.0R） | Heraeus instruments, Kendro Laboratory Products GmbH, Hanau, 德国 | 75003060 | |
| 含色氯己定 5 mg/mL | Fresenius Kabi Norge AS, 哈尔登, 挪威 | 00 73 24 | |
| Combi-Stopper | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, 德国 | 4495101 | |
| CRF 表格 | 自制 | ||
| Desmarres 眼睑拉钩 13 cm x 18 mm | 任意品牌 | ||
| 数字体温计 ama-digit ad 15 th | Amarell, Kreuzwertheim, 德国 | 9243101 | |
| 心电图电极，Skintact | Leonhard Lang, 因斯布鲁克, 奥地利 | FS-TC1 /10 | |
| 电热毯 | 任意品牌 | ||
| 延长管路 | Codan Medizinische Geräte GmbH & Co KG, Lensahn, 德国 | 71.4021 | |
| 芬太尼（50 µg/mL） | Hameln, Saksa, 德国 | 00 70 16 | |
| 细木屑 | 任意品牌 | ||
| Finnpipette F1, 100-1000 µL | VWR, PA, 美国 | 613-5550 | |
| 配备齐全的手术室 | |||
| 气体软管 | 任意品牌 | ||
| 纱布敷料 5 cm x 5 cm | Bastos Viegas,.a., Penafiel, 葡萄牙 | ||
| 肝素，肝素钠 5000 IE/a.e./mL | LEO Pharma AS, Ballerup, 丹麦 | 46 43 27 | |
| HighClean 无纺布擦拭巾，10 cm x 10 cm | Selefa, OneMed Group Ay, 赫尔辛基, 芬兰 | 223003 | |
| ICON | Osypka Medical GmbH, 柏林, 德国 | 便携式无创心功能监测仪 | |
| ICON 电极/心电图电极，Ambu WhiteSensor WSP25 | Ambu A/S, Ballerup, 丹麦 | WsP25-00-S/50 | |
| Infusomat Space 注射泵 | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, 德国 | 8713050 | |
| 有创血压监测系统 | Codan pvb Critical Care GmbH, Forstinning, 德国 | 74.6604 | |
| 喉镜 SunMed Greenlinen 刀片 No 2 | KaWe Medical, Asperg, 德国 | ||
| Leoni plus 机械通气机 | Löwenstein Medical SE & Co. KG, Bad Ems, 德国 | ||
| 液氮 230 L | Linde Gas AS (AGA AS), 奥斯陆, 挪威 | 102730 | |
| 微量离心管，1.5 ml | Forsyningssenteret, 特隆赫姆, 挪威 | 72.690.001 | |
| Microcuff 气管插管，尺寸 3.5 | Avanos, GA, 美国 | 35162 | |
| 持针器 | 任意品牌 | ||
| Neoflon 外周静脉导管，24 G 0.7 mm x 19 mm | Becton Dickinson Infusion Therapy AB, 赫尔辛堡, 瑞典 | 391350 | |
| 12-36 小时龄新生仔猪 | 尽可能年轻 | ||
| NIRS 电极， FORE-SIGHT 单用非粘贴式传感器套件（小型） | Cas Medical Systems Inc., Branford Connecticut, 美国 | 01-07-2000 | |
| NIRS 仪器，FORE-SIGHT 通用型，脑氧仪 MC-202，台式区域血氧仪 FORE-SIGHT | Cas Medical Systems Inc., Branford Connecticut, 美国 | 01-06-2020 | 也可使用 INVOS, Covidien |
| 生理盐水，NaCl 9 mg/mL，500 mL | Fresenius Kabi Norge AS, 哈尔登, 挪威 | 货号 141387 | 未混合 |
| 生理盐水，NaCl 9 mg/mL，500 mL | Fresenius Kabi Norge AS, 哈尔登, 挪威 | 141388 | 用于静脉血压监测，加入肝素（500 mL 0.9% NaCl 中加入 0.2 mL 肝素 5000 IE/a.e./mL） |
| Nunc 冻存管 1.8 mL | VWR, PA, 美国 | 479-6847 | |
| Original Perfusor 标准 PE 输液管路 | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, 德国 | 8723060 | |
| 血氧饱和度监测仪，MasimoSET, Rad 5 | Masimo, Neuchâtel, 瑞士 | 9196 | |
| 血氧饱和度监测仪，OxiMax N-65 | Covidien LP (前 Nellcor Puritan Bennett Inc.), Boulder, CO, 美国 | N65-PDN1 | |
| 戊巴比妥（100 mg/mL） | Norges Apotekerforening, 奥斯陆, 挪威 | Pnr 811602 | |
| 移液器吸头 | VWR, PA, 美国 | 732-2383 | |
| 带孔塑料容器 | 任意品牌 | 必须允许空气流通 | |
| 打印机标签 B-492，白色，25 mm x 9 mm，3000 张 | VWR, PA, 美国 | BRDY805911 | 用于 Nunc 管 |
| 剃刀，一次性使用 | 任意品牌 | ||
| 橡胶手套 | 任意品牌 | ||
| 橡胶热水袋 | 任意品牌 | ||
| 500 ml 自充式硅胶小儿呼吸袋 | Laerdal Medical, Stavanger, 挪威 | 86005000 | |
| 小口径 T 型连接延长管 | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, 德国 | 471954 | |
| 无菌外科乳胶手套，Sempermed supreme | Semperit Technische Produkte Ges.m.b.H., 维也纳, 奥地利 | 7 号：822751701 | 不同尺码 |
| 听诊器 | 任意品牌 | ||
| 三通旋塞阀，Discofix | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, 德国 | 16494C | |
| 3.5 号导丝 | 任意品牌 | ||
| SunMed Greenlinen 喉镜刀片 No 2 | KaWe Medical, Asperg, 德国 | ||
| 手术刀片，15 号 | Swann Morton LTD, 谢菲尔德, 英格兰 | 205 | |
| 手术镊 | 任意品牌 | ||
| 手术剪 | 任意品牌 | ||
| 无菌手术海绵 | Mölnlycke Health Care, Göteborg, 瑞典 | C0130-3025 | |
| 手术擦拭巾 | Mölnlycke Health Care, Göteborg, 瑞典 | 159860-00 | |
| 外科胶带 Micropore 2.5 cm x 9.1 m | 3M Norge AS, Lillestrøm, 挪威 | 153.5 | |
| 缝线，Monsoft 单丝尼龙 3-0 | Covidien LP (前 Nellcor Puritan Bennett Inc.), Boulder, CO, 美国 | SN653 | |
| 缝线，Polysorb 编织可吸收缝线 | Covidien LP (前 Nellcor Puritan Bennett Inc.), Boulder, CO, 美国 | GL884 | |
| 注射器 0.01-1 mL Omnifix F Luer Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, 德国 | 9161406V | 用于酸碱血样采集。用肝素冲洗 |
| 注射器 10 mL Omnifix Luer Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, 德国 | 4616103V | |
| 注射器 2.5 mL BD Plastipak | Beckton Dickinson S.A., 马德里, 西班牙 | 300185 | 用于采血。用肝素化 NaCl 冲洗 |
| 注射器 20 mL Omnifix Luer Loc Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, 德国 | 4617207V | |
| 注射器 20 mL Omnifix Luer Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, 德国 | 4616200V | |
| 注射器 5 mL Omnifix Luer Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, 德国 | 4616057V | |
| 注射器 50 mL Omnifix Luer Lock Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, 德国 | 4617509F | |
| 注射器 50 mL Omnifix Luer Solo | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, 德国 | 4616502F | |
| 手术台铺巾，asap drytop | Asap Norway AS, Skien, 挪威 | 83010705 | |
| 胶带 Tensoplast 2.5 cm x 4.5 m | BSN Medical, Essity Medical Solutions, Charlotte, NC, 美国 | 66005305, 72067-00 | |
| 计时器 | 任意品牌 | ||
| 毛巾 | 任意品牌 | ||
| 透明静脉固定敷料 | Mediplast AB, Malmö, 瑞典 | 60902106 | |
| 超声耦合剂 | Optimu Medical Solutions Ltd. 利兹, 英国 | 1157 | |
| 超声设备，LOGIQ e | GE Healthcare, GE Medical Systems, WI, 美国 | 5417728-100 | |
| 无菌通用铺巾 | OneMed Group Oy, 赫尔辛基, 芬兰 | 1415-01 | |
| Vacuette K3E K3EEDTA 2mL | Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, 奥地利 | 454222 | |
| Venflon Pro Safety 22 G 0.9 mm x 25 mm | Becton Dickinson Infusion Therapy, 赫尔辛堡, 瑞典 | 393222 | |
| 专为仔猪吻部设计的紧密贴合通气面罩 | 任意品牌 | 通常为锥形 | |
| 体重秤 | 任意品牌 |
参考文献
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