使用基础显微镜和智能手机可视化大麦（Hordeum vulgare）上稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）的早期感染位点

摘要

本实验方案介绍了一种使用最少试剂和常规实验设备（包括一部基础智能手机）的 barley 叶鞘检测方法。其目的是在不具备先进显微镜设备的实验室中，观察稻瘟病的早期侵染过程。

摘要

了解植物与病原体之间的相互作用方式，以及这种相互作用最终导致植物产生防御反应还是引发病害，对于制定更有效且可持续的植物健康策略至关重要。随着成像技术的进步，研究者能够更有效地在感染和定殖过程中对植物-病原体样本进行观察，由此发展出诸如水稻叶鞘测定法等工具，该方法已被用于监测水稻与真菌病原体Magnaporthe oryzae之间的侵染及早期定殖过程。这种半活体营养型病原体可严重危害水稻及相关禾本科作物，包括小米、黑麦、大麦，以及近年来的小麦。尽管大麦作为人类和动物的重要食物来源以及发酵饮料的原料其重要性日益增加，但针对大麦与M. oryzae互作的细胞水平研究仍落后于水稻体系。本文报道了一种适用于接种后前48小时M. oryzae互作精细研究的大麦叶鞘测定方法。无论研究何种植物物种，叶鞘测定法均较为精细，本文提供了一套完整操作流程，涵盖大麦的培养条件、叶鞘的获取、接种、培养以及病原体在植物叶片上的成像等各个环节。该方案可通过简易设备（如智能手机）进行成像，从而进一步优化为高通量筛选平台。

引言

Magnaporthe oryzae（稻瘟病菌）可侵染多种谷类作物，包括大麦、小麦和水稻¹。该病原菌引发的病害极具破坏性，对这些重要农作物构成全球性威胁，若不加以控制，可能导致作物绝收。由于其全球性危害以及作为植物-真菌互作研究的优良模型，全球众多实验室均致力于稻瘟病的研究²。该菌的基因组已完全测序，其侵染周期的遗传机制，特别是早期事件，已有明确研究结果^3,4。其生命周期始于孢子在叶片表面萌发，并形成一种特化的侵入结构——附着胞。附着胞穿透叶组织后，病害继续发展，形成病斑，进而启动产孢过程并传播疾病⁴。阻断上述任一早期事件，均可显著抑制该病害的蔓延。因此，目前大多数关于稻瘟病的研究均聚焦于早期侵染阶段，即从萌发的分生孢子形成附着胞，到侵入性菌丝及活体营养界面复合体（BIC）的发育过程⁵。

尽管稻瘟病菌（M. oryzae）是多种作物的重要病原体，且新进化的菌株正成为对小麦的全球性威胁，但有关稻瘟病的大量研究仍集中在水稻上⁶。水稻与小麦和玉米并列为全球三大主粮作物，而大麦在牲畜饲料和啤酒生产....

方案

1. 实验材料的准备

1. 通过将燕麦片搅拌成细粉来制备燕麦粉琼脂（OMA）。取25 g燕麦粉和15 g琼脂加入500 mL去离子水（ddH₂O）中，使用培养基循环进行高压灭菌（或 alternatively 煮沸20分钟）。将培养基倒入无菌的60 mm培养皿中。
   注意：其他可诱导产孢的培养基类型（如V8琼脂）也可用于本实验方案。
2. 使用无菌镊子将M. oryzae滤纸保存菌种直接接种到OMA平板上，使其覆盖整个平板（9–12天）。将平板置于25 °C、12小时光照/12小时黑暗循环的培养箱中，以促进产孢。
   注意：某些突变体生长较慢，需要额外护理（例如先在完全培养基上生长，再转移至OMA），可能需要额外一周时间才能产生足够的分生孢子。
3. 将大麦（Hordeum vulgare Lacey）种子直接播种于湿润的生长基质（例如无土育苗基质）中，每6英寸花盆播种10–15粒。将花盆放入托盘中，并加入1–2英寸深的水。
4. 设置大麦生长室条件为：白天22 °C持续12小时，夜间19 °C持续12小时，相对湿度60%。继续从底部加水，以免扰动种子。
5. 培养大麦至第二叶期，约14天。使用无菌剪刀，在土壤线以上剪断大麦植株。用镊子和刀片/手术刀小心纵向切开第一片已展开的叶鞘，并用镊子将其从第二叶基部移除。
   注意：使用前需用75....

结果

该技术的初始工作流程如图1所示。从14天龄的感病型“Lacey”大麦植株（H. vulgare）中采集叶鞘。从10天龄产孢的M. oryzae OMA平板上收集分生孢子，并使用无菌ddH₂O配制孢子悬浮液，最终浓度为每毫升5 × 10⁴个孢子。将接种悬浮液直接施加于固定在无菌培养皿上的叶鞘上。将培养皿置于温暖、湿润且无光照的环境中孵育48小时。孵育结束后，用台盼蓝对叶鞘进行染色并制备用于成像。

使用智能手机及智能手机显微镜适配器对感染位点进行成像。每种测试的M. oryzae菌株至少记录10张图像。每种真菌菌株的实验重复三次，至少获得30张图像。图2A展示了成功的叶鞘接种实验的代表性结果，同时提供了未染色和染色不当的图像作为对照参考。

根据假设，这些图像可通过多种方法进行量化和分析。本实验中，在接种后48小时，统.......

讨论

目前有许多常用的检测方法可用于测试M. oryzae菌株，通过喷雾或液滴接种等方式，结合病斑大小评分系统，可宏观观察其相容性或不相容性侵染反应^13,14。另一种针对M. oryzae的常见检测方法是评估病原菌形成特化侵入结构——附着胞的能力¹⁵。本文介绍一种简便的方法，可在更易操作的大麦植株上，快速高效地在细胞水平观察早期侵染过程中的变化。该方法的独特之处在于仅需使用常规实验设备和智能手机进行数据采集，无需配备相机和计算机控制系统的显微镜，从而使本实验方案适用于任何实验室。利用该方法，我们成功确定了突变菌株J99A的侵染过程在哪个步骤被阻断，而这一问题在以往实验中未能明确。

稻瘟病菌（M. oryzae）在水稻中的侵染过程，特别是对最初几个表皮细胞的定殖，已通过荧光蛋白、标记物、染料、共聚焦成像以及先进显微技术得到了清晰的可视化呈现

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸	Sigma-Aldrich	A6283
手机	Google	Pixel 4A	任何带有后置摄像头并可安装在支架上的智能手机均可使用。
手机显微镜适配器	Vankey	B01788LT3S	https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
显微镜	AmScope	FM690TC	40x–2500x 三目直立透射荧光显微镜
传统燕麦片（原味压片燕麦）	桂格	N/A	https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1
ProMix BX	ProMix	1038500RG
矩形盖玻片	Corning	CLS2975245
显微镜载玻片	Sigma-Aldrich	S8902
台式测微尺	OMAX	A36CALM7	0.1 mm 和 0.01 mm 显微镜校准载片
台盼蓝	Sigma-Aldrich	T6146