使用基础显微镜和智能手机可视化大麦（Hordeum vulgare）上稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）的早期感染位点

摘要

本实验方案介绍了一种使用最少试剂和常规实验设备（包括一部基础智能手机）的 barley 叶鞘检测方法。其目的是在不具备先进显微镜设备的实验室中，观察稻瘟病的早期侵染过程。

摘要

了解植物与病原体之间的相互作用方式，以及这种相互作用最终导致植物产生防御反应还是引发病害，对于制定更有效且可持续的植物健康策略至关重要。随着成像技术的进步，研究者能够更有效地在感染和定殖过程中对植物-病原体样本进行观察，由此发展出诸如水稻叶鞘测定法等工具，该方法已被用于监测水稻与真菌病原体Magnaporthe oryzae之间的侵染及早期定殖过程。这种半活体营养型病原体可严重危害水稻及相关禾本科作物，包括小米、黑麦、大麦，以及近年来的小麦。尽管大麦作为人类和动物的重要食物来源以及发酵饮料的原料其重要性日益增加，但针对大麦与M. oryzae互作的细胞水平研究仍落后于水稻体系。本文报道了一种适用于接种后前48小时M. oryzae互作精细研究的大麦叶鞘测定方法。无论研究何种植物物种，叶鞘测定法均较为精细，本文提供了一套完整操作流程，涵盖大麦的培养条件、叶鞘的获取、接种、培养以及病原体在植物叶片上的成像等各个环节。该方案可通过简易设备（如智能手机）进行成像，从而进一步优化为高通量筛选平台。

引言

Magnaporthe oryzae（稻瘟病菌）可侵染多种谷类作物，包括大麦、小麦和水稻¹。该病原菌引发的病害极具破坏性，对这些重要农作物构成全球性威胁，若不加以控制，可能导致作物绝收。由于其全球性危害以及作为植物-真菌互作研究的优良模型，全球众多实验室均致力于稻瘟病的研究²。该菌的基因组已完全测序，其侵染周期的遗传机制，特别是早期事件，已有明确研究结果^3,4。其生命周期始于孢子在叶片表面萌发，并形成一种特化的侵入结构——附着胞。附着胞穿透叶组织后，病害继续发展，形成病斑，进而启动产孢过程并传播疾病⁴。阻断上述任一早期事件，均可显著抑制该病害的蔓延。因此，目前大多数关于稻瘟病的研究均聚焦于早期侵染阶段，即从萌发的分生孢子形成附着胞，到侵入性菌丝及活体营养界面复合体（BIC）的发育过程⁵。

尽管稻瘟病菌（M. oryzae）是多种作物的重要病原体，且新进化的菌株正成为对小麦的全球性威胁，但有关稻瘟病的大量研究仍集中在水稻上⁶。水稻与小麦和玉米并列为全球三大主粮作物，而大麦在牲畜饲料和啤酒生产中位列第四大谷物⁷。随着精酿啤酒产业的发展，大麦的经济价值也在不断提升。利用M. oryzae与大麦作为病害系统来研究稻瘟病具有明显优势。首先，存在仅侵染大麦的M. oryzae菌株，也存在可侵染多种禾本科植物的菌株。例如，菌株4091-5-8主要仅侵染大麦，而菌株Guy11和70-15则可同时侵染大麦和水稻⁸。这些菌株在遗传上具有相似性，且侵染过程也类似⁹。其次，在标准的实验室和温室条件下，大麦比水稻更易于培养，因其不需要水稻那样复杂的环境条件（如精确的温度控制、高湿度和特定的光谱）。此外，由于水稻叶片表面具有疏水性，给成像带来挑战，而大麦则不存在这一问题¹⁰。

本方案介绍了一种简单的方法，利用常见实验耗材和智能手机进行数据采集，对大麦叶鞘进行分离并用于显微分析多个感染阶段。该大麦叶鞘检测方法适用于全球各类实验室，因其所需耗材极少，却能清晰呈现病原菌与其最初感染的少数细胞之间的微观互作过程。相较于喷雾或滴注接种等致病性检测方法仅能提供病原菌形成病斑能力的宏观视角，本检测方法使研究人员能够观察从侵入前事件到表皮细胞定植等早期感染的特定步骤。此外，研究人员可轻松比较野生型真菌与毒力减弱突变体的感染过程。

方案

1. 实验材料的准备

1. 通过将燕麦片搅拌成细粉来制备燕麦粉琼脂（OMA）。取25 g燕麦粉和15 g琼脂加入500 mL去离子水（ddH₂O）中，使用培养基循环进行高压灭菌（或 alternatively 煮沸20分钟）。将培养基倒入无菌的60 mm培养皿中。
   注意：其他可诱导产孢的培养基类型（如V8琼脂）也可用于本实验方案。
2. 使用无菌镊子将M. oryzae滤纸保存菌种直接接种到OMA平板上，使其覆盖整个平板（9–12天）。将平板置于25 °C、12小时光照/12小时黑暗循环的培养箱中，以促进产孢。
   注意：某些突变体生长较慢，需要额外护理（例如先在完全培养基上生长，再转移至OMA），可能需要额外一周时间才能产生足够的分生孢子。
3. 将大麦（Hordeum vulgare Lacey）种子直接播种于湿润的生长基质（例如无土育苗基质）中，每6英寸花盆播种10–15粒。将花盆放入托盘中，并加入1–2英寸深的水。
4. 设置大麦生长室条件为：白天22 °C持续12小时，夜间19 °C持续12小时，相对湿度60%。继续从底部加水，以免扰动种子。
5. 培养大麦至第二叶期，约14天。使用无菌剪刀，在土壤线以上剪断大麦植株。用镊子和刀片/手术刀小心纵向切开第一片已展开的叶鞘，并用镊子将其从第二叶基部移除。
   注意：使用前需用75%–80%乙醇清洁工具（镊子、手术刀等）。叶鞘是薄的表皮层，连接第一叶与第二叶（第二叶与第三叶等；见图1）。
6. 将第一片叶平放于含湿润滤纸的无菌60 mm培养皿中，以维持皿内湿度。用手术刀将大部分叶片组织从叶鞘上切除，仅保留约0.5英寸长的叶组织用于固定。
7. 用胶带将叶组织固定在培养皿底部。
   注意：叶鞘会自然卷曲，但这是可接受的，因为卷曲的叶鞘更易于固定分生孢子液滴。
8. 收集培养9–12天的M. oryzae平板，向其中加入0.5–2 mL无菌水。使用无菌接种环轻轻刮取菌丝，以释放附着的分生孢子。小心地将分生孢子悬液转移至含有小块纱布的微量离心管中，过滤去除分生孢子悬液中的大块菌丝。
   注意：若菌体生长和产孢情况良好，达到所需孢子浓度，最早可在第7天收集孢子。若处理生长缓慢的遗传突变体，最迟不超过14天。
9. 理想的孢子浓度为每毫升5 × 10⁴个孢子，但1 × 10⁴–1 × 10⁵的范围也可接受。浓度过高会使单个感染位点的成像变得困难；必要时可用无菌水稀释孢子悬液。
10. 小心地将分生孢子悬液滴加至卷曲的叶鞘内部。起始量为25 µL（可根据叶鞘大小增加液滴体积，最多至50 µL）。
    注意：建议对每个突变菌株或大麦品系设置三到五个重复。染色过程中常发生组织损伤，因此建议增加叶鞘重复数量。
11. 取四到五个500 mL烧杯，装入去离子水（ddH₂O），加热至产生蒸汽（可使用微波炉或电热板）。移动热水烧杯时需小心。将培养皿盖置于其中一个冒蒸汽的烧杯上方，以在皿内积聚湿度。
12. 将接种后的叶鞘培养皿叠放，并用其余热烧杯包围，以创造孢子萌发所需的高湿环境。
    注意：蒸汽处理皿盖时需小心，确保热水或蒸汽不会接触到叶鞘。
13. 避免叶鞘接触光线，用实色（推荐黑色）橡胶或塑料盒覆盖，并静置48小时或至成像所需的时间点。
    ​注意：纸板箱不适用，因其无法锁住水分/湿度，且会吸收热水烧杯产生的蒸汽。带密封盖的塑料容器能有效保持湿度，可用黑色织物或更大的暗色容器覆盖以遮光。

2. 染色过程

1. 按如下步骤配制染色液：新鲜配制45%的乙酸稀释液，并加入0.1%（v/v）的台盼蓝。将染色液分装至微量离心管中，每管1 mL。将加热块或水浴锅预热至40 °C。
2. 使用剃刀或解剖刀小心地将叶鞘从胶带上切下。用镊子将叶鞘放入微量离心管中，确保其完全浸没于染色液中。染色时间为2小时。在染色过程中，将样品置于40 °C 的加热块或水浴中，以促进染料渗透。
   注意：叶鞘容易在微量离心管中漂浮；为防止组织出现未染色区域，应将离心管装满液体，完全浸没叶鞘，并盖紧管盖。同一微量离心管中不得放入多个叶鞘。
3. 用60%甘油小心冲洗叶鞘，以去除多余的染料。通常进行三次冲洗（每次使用新鲜甘油）即可。冲洗后将叶鞘保存在甘油中，待后续制片使用。

3. 装载与成像流程

1. 将鞘置于干净的载玻片上，加入几滴60%甘油。在解剖显微镜下，用两对镊子小心地展开鞘，使接种中心朝上。用镊子固定鞘的开口，盖上盖玻片，以防止鞘卷曲并遮挡感染部位。
   注意：叶鞘非常脆弱，操作这些步骤时需小心，以防止叶鞘受损。
2. 用指甲油密封盖玻片以长期保存，或用胶带密封以短期保存。在复式光学显微镜下观察玻片。
3. 使用显微镜和手机拍摄基础图像。此处图像使用手机适配器支架和智能手机拍摄。对于安卓设备，将相机应用程序调整为以下设置：关闭闪光灯，关闭Top Shot功能，关闭亮度和阴影的自动调节，并将照片分辨率设置为最高。
   注意：使用手机上的相机应用程序会比平时更快地消耗电池电量，因此建议使用外部电源。
4. 将手机安装到显微镜上后，使用将用于采集数据的物镜拍摄目镜测微尺的图像。本研究中的数据采用40倍、数值孔径0.65的平场消色差物镜采集，手机适配器安装在10倍目镜上。将手机的变焦倍数调整为2.5倍，并在整个实验过程中保持一致，以确保像素尺寸恒定。
5. 鞘的中心区域含有最密集的孢子和侵染性附着胞；因此，每个鞘应拍摄9-12张图像，以获得可用于统计分析的足够数量。孢子和附着胞的数量因接种的孢子浓度而异。

4. 使用 ImageJ（FIJI）进行图像评估与计数

1. 将图像传输至运行 ImageJ（FIJI）的计算机。要打开图像，可将文件直接拖放到 ImageJ 工具栏上。
2. 通过加载载物台测微尺图像并在线条的两个刻度之间绘制一条直线来设定图像比例尺。打开设定比例尺，在已知距离栏中输入所测直线的实际距离，并输入比例尺的单位。在此示例中的测微尺，最小刻度为 10 µm。勾选设为全局选项，然后点击确定。此后加载的所有图像将自动应用相同的比例尺。
3. 为计数附着胞、孢子或其他对象，请选择点工具。接着打开感兴趣区域管理器。按下键盘上的T键，可将各点添加至列表中。如有需要，这些感兴趣区域可保存，并在之后重新加载到同一图像上。
4. 根据实验目的，进行其他测量，例如孢子长度、附着胞大小以及芽管长度。

结果

该技术的初始工作流程如图1所示。从14天龄的感病型“Lacey”大麦植株（H. vulgare）中采集叶鞘。从10天龄产孢的M. oryzae OMA平板上收集分生孢子，并使用无菌ddH₂O配制孢子悬浮液，最终浓度为每毫升5 × 10⁴个孢子。将接种悬浮液直接施加于固定在无菌培养皿上的叶鞘上。将培养皿置于温暖、湿润且无光照的环境中孵育48小时。孵育结束后，用台盼蓝对叶鞘进行染色并制备用于成像。

使用智能手机及智能手机显微镜适配器对感染位点进行成像。每种测试的M. oryzae菌株至少记录10张图像。每种真菌菌株的实验重复三次，至少获得30张图像。图2A展示了成功的叶鞘接种实验的代表性结果，同时提供了未染色和染色不当的图像作为对照参考。

根据假设，这些图像可通过多种方法进行量化和分析。本实验中，在接种后48小时，统计了活孢子（已萌发孢子）的总数、附着胞数量以及成功侵染的细胞数量。一组2,000个随机诱变的 M. oryzae 在实验室中构建了感染大麦的菌株背景。通过喷雾和滴注接种进行的致病性测定显示，许多突变体的病斑尺寸较野生型减小（这是常见的表型，对于 M. oryzae 突变体¹¹为了区分这些表型，假设病斑尺寸减小是由于抑制了早期侵染步骤之一（孢子萌发、附着胞形成、侵入钉形成、表皮细胞初期定殖）所致，其中最易于检测的是 通过 叶鞘测定法。通过正向遗传学方法，在诱变项目中鉴定出一个名为 J99A 的有前景的候选株系。¹²该突变体在筛选过程中未表现出对氮饥饿或活性氧条件的敏感性。在后续实验中，J99A 在疏水表面能形成大量附着胞，但在活体大麦上的病斑尺寸减小。通过叶鞘侵染实验检测时，J99A 能成功形成附着胞和侵入栓，侵入栓可穿透叶鞘组织，但进入内部后未能产生侵染菌丝，表明侵染过程在侵入栓阶段即已中止。图2B成功感染的细胞通过在叶鞘组织内观察到侵染性菌丝来确定。通过比较附着胞数量与感染细胞数量，可计算出成功侵染的附着胞百分比。对于野生型4091-5-8，87%的附着胞成功侵入并定殖细胞；而在突变体J99A中，仅有36%的附着胞在细胞内形成菌丝。¹².

图1：从10日龄大麦植株上采集的叶鞘，使用经乙醇消毒的工具小心剥离。 收集分生孢子，并用无菌水将浓度调整至每毫升0.5–1.0 × 10⁵。将分离的叶鞘固定于60 cm培养皿内侧，将分生孢子悬浮液注入叶鞘中。接种后的样品置于室温、避光环境中，并用盛有热水的烧杯维持湿度。接种后48小时，样品在含45%乙酸和0.1%台盼蓝的染色液中40 °C下染色1–2小时，随后用60%甘油漂洗三次。染色后的样品封片并进行显微成像。 请点击此处查看该图的高清版本。

图 2：染色实验方案的代表性结果。（A）若偏离染色实验方案，可能导致结果不理想。加热和乙酸可轻柔软化叶片组织。染色后在60%甘油中清洗，不仅能去除多余染料，还有助于减少叶片引起的光散射，从而提高图像质量。比例尺 = 50 µm。（B）代表性图像显示本实验方法具有良好的稳健性，可观察到J99A菌株穿透失败并继而发生多次侵染尝试（箭头所示），而4091WT菌株成功侵入并在叶片组织中形成侵入性菌丝（箭头所示）。比例尺 = 50 µm。所有图像均在接种后48小时拍摄。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

目前有许多常用的检测方法可用于测试M. oryzae菌株，通过喷雾或液滴接种等方式，结合病斑大小评分系统，可宏观观察其相容性或不相容性侵染反应^13,14。另一种针对M. oryzae的常见检测方法是评估病原菌形成特化侵入结构——附着胞的能力¹⁵。本文介绍一种简便的方法，可在更易操作的大麦植株上，快速高效地在细胞水平观察早期侵染过程中的变化。该方法的独特之处在于仅需使用常规实验设备和智能手机进行数据采集，无需配备相机和计算机控制系统的显微镜，从而使本实验方案适用于任何实验室。利用该方法，我们成功确定了突变菌株J99A的侵染过程在哪个步骤被阻断，而这一问题在以往实验中未能明确。

稻瘟病菌（M. oryzae）在水稻中的侵染过程，特别是对最初几个表皮细胞的定殖，已通过荧光蛋白、标记物、染料、共聚焦成像以及先进显微技术得到了清晰的可视化呈现¹⁶。这类成像实验成本高、耗时长，且需要特定的专业技术。许多实验室能够利用同源重组技术构建M. oryzae的遗传突变体，以分析单个基因在侵染周期中的作用，但可能无法获得探索其底层细胞生物学机制所需的先进设备和技术专长。本实验方案旨在弥补这一差距，仅使用复式光学显微镜和智能手机对固定后的叶鞘组织进行数字图像采集，并生成类似z-stack的视频。该方法可对组织内数个细胞层进行成像，持续观察侵入性菌丝长达48小时。水稻和大麦的叶鞘具有相似的特性：厚度仅为少数几层细胞，且叶绿体较少，因而更易于成像。如前所述，大麦比水稻亲水性更强且更易培养，同时许多稻瘟病菌菌株均可侵染水稻和大麦，因此本实验可作为更为复杂的水稻检测方法的一种简便替代方案。

该方法的一些局限性包括：需使用智能手机的视频功能来采集z轴方向的数据，而视频帧率对应的z轴步进值未知。另一个局限性是需要使用固定组织（而非活细胞）。然而，由于该实验方案具有快速简便的优点，可通过检测感染后不同时间点的样本，来克服这一局限性。

该实验方案中最关键的步骤之一是适当的染色。冲洗不当会导致玻片制备中残留过多染料，引起染料过饱和，从而使病原菌组织与叶片组织无法区分。而染色不足则会导致病原菌组织与叶片组织之间的对比度不够，难以分辨。

上述方法可适用于多种科学问题，可用于评估真菌突变体、评估大麦植株中不同水平的遗传抗性，以及检验先前施用的真菌防控方法的效率。该方法也可拓展至其他植物-病原体互作体系，特别是其他单子叶植物的叶鞘。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸	Sigma-Aldrich	A6283
手机	Google	Pixel 4A	任何带有后置摄像头并可安装在支架上的智能手机均可使用。
手机显微镜适配器	Vankey	B01788LT3S	https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
显微镜	AmScope	FM690TC	40x–2500x 三目直立透射荧光显微镜
传统燕麦片（原味压片燕麦）	桂格	N/A	https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1
ProMix BX	ProMix	1038500RG
矩形盖玻片	Corning	CLS2975245
显微镜载玻片	Sigma-Aldrich	S8902
台式测微尺	OMAX	A36CALM7	0.1 mm 和 0.01 mm 显微镜校准载片
台盼蓝	Sigma-Aldrich	T6146