方法文章

研究肠道炎症对上皮的影响 体外 已建立的小鼠结肠类器官

DOI：

10.3791/64804

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2023年6月2日

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1Division of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 2Division of Pediatric Surgery, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 3Department of Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们描述了一种从小鼠结肠隐窝中分离并建立三维结肠类器官的实验方案。所建立的结肠类器官可进一步终末分化，以模拟宿主上皮细胞的组成，随后可用于炎症刺激实验，或进一步诱导形成上皮单层细胞模型。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肠上皮在人类健康中发挥着至关重要的作用，构成了宿主与外部环境之间的屏障。这一高度动态的细胞层在微生物群与免疫细胞群之间形成第一道防线，并有助于调节肠道免疫反应。上皮屏障的破坏是炎症性肠病（IBD）的典型特征，也是治疗干预的重要靶点。三维结肠类器官培养系统是一种极为有用的 体外 用于研究炎症性肠病发病机制中肠干细胞动态变化和上皮细胞生理学的模型。理想情况下，从动物的炎症上皮组织建立结肠类器官，将最有利于评估遗传和分子因素对疾病的影响。然而，我们已证明 体内 上皮改变在由急性炎症小鼠建立的结肠类器官中未必能够保留。为解决这一局限性，我们开发了一种使用炎症介质混合物处理结肠类器官的实验方案，这些炎症介质在炎症性肠病（IBD）期间通常水平升高。尽管该体系可广泛应用于多种培养条件，本方案重点介绍对已分化的结肠类器官以及由成熟结肠类器官衍生的二维单层细胞进行处理的方法。在传统培养条件下，结肠类器官富含肠干细胞，为研究干细胞微环境提供了理想体系。然而，该体系无法用于分析肠道生理功能特征，例如屏障功能；此外，传统结肠类器官也无法用于研究终末分化的上皮细胞对促炎刺激的细胞反应。本文所述方法为克服上述局限性提供了一种替代性实验框架。二维单层培养体系还为治疗性药物筛选提供了可行平台。 离体该细胞的极化层可在基底侧用炎性介质处理，同时在顶端给予潜在的治疗药物，以评估其在炎症性肠病治疗中的效用。

引言

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炎症性肠病（IBD）是一种慢性、缓解与复发交替的疾病，其特征为反复发作的肠道炎症和临床静止期。IBD 的病因是多因素的，但该病的关键特征包括肠上皮屏障功能缺陷、通透性增加，以及肠上皮细胞区室内激活的促炎信号级联反应1,2。已有多种体外（in vitro）和体内（in vivo）模型被用于模拟 IBD 期间的上皮反应，包括细胞培养和小鼠炎症模型3。然而，这些模型均存在重要局限性，限制了其对 IBD 期间上皮变化的准确模拟能力4。目前用于研究 IBD 的多数细胞系均为转化细胞系，虽能形成单层并具备一定的分化能力3，但其增殖方式本质上与宿主体内未转化的肠上皮细胞不同。研究 IBD 时也采用了多种不同的小鼠炎症模型，包括基因敲除模型、感染模型、化学诱导炎症模型以及 T 细胞移植模型5,6,7,8。尽管这些模型可分别用于研究 IBD 的某些病因学方面，如遗传易感性、屏障功能障碍、免疫失调以及微生....

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方案

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本文所述所有使用小鼠组织的实验均已获得匹兹堡大学机构审查委员会的批准，并依照匹兹堡大学和UPMC动物研究与护理委员会制定的指南进行。

1. 培养前准备

注意：所有试剂均列在材料表部分，所有溶液的组成均可在溶液组成表（表1）中找到。

  1. 按照表1所述配制小鼠清洗液，4°C保存，可保存长达2个月。
  2. 按照表1所述配制隐窝分离缓冲液1（CIB1），4°C保存，可保存长达2个月。
    ​注意：根据美国职业安全与健康管理局（OSHA）《危险信息沟通标准》，二硫苏糖醇（DTT）属于危险化学品，因其具有急性毒性，摄入后可能造成危害，接触皮肤和眼睛可导致损伤。操作该化学品时应佩戴防护手套、眼部防护装备和面部防护装备。
  3. 按照表1所述配制隐窝分离缓冲液2（CIB2），4°C保存，可保存长达2个月。
  4. 根据先前发表的方案16配制L-WRN条件培养基。
  5. 按照表1所述配制完全结肠类器官培养基。完全结肠类器官生长培养基在4°C保存可稳定5天，不损失活性....

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

三维肠道类器官培养系统是研究肠上皮在肠道黏膜稳态中内在作用的宝贵工具。本方案详细描述了如何从8周龄C57BL/6J（WT）小鼠中分离隐窝，并建立可长期培养的结肠类器官体系，该体系可用于多种下游应用。将隐窝分离后接种于基底膜基质中，通过明场显微镜观察，可见隐窝结构致密且呈多细胞形态。其形状可为球形，或呈伸长的圆柱状，类似于体内正常存在的单个隐窝样结构。 体内 肠道结构图1A）。到第1天，大多数隐窝形成一个紧凑的球形结构，少数结肠类器官开始发育出无上皮细胞的内部腔隙（空腔）。图1B）。在接下来的数天中，随着类器官持续生长，结肠类器官的直径继续增大，其管腔结构也变得更加清晰（图1C）。到第5天，每个结肠类器官直径约为100–250 µm，形成一个较大的明显腔体，周围由一层薄薄的上皮干细胞环绕（图1D）。此时，类器官需通过酶消化和机械法进行消化传代。经过两次传代后，可用于后续实验。

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讨论

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类器官的开发彻底改变了科学界在体外研究器官系统的方式，能够在培养皿中部分重现动物或人类的细胞结构与功能。in vitro 此外，源自患病患者的类器官系统为个性化医疗提供了有前景的工具，可指导治疗决策。本文 介绍了一种效果良好的隐窝分离方案，并阐述了在接种前清除分离过程中多余碎片的关键步骤。此外，我们还解释了该过程中常被忽视的一个关键细节——准确计数隐窝以用于接种。在结肠类器官建立后，我们概述了若干关键操作步骤，可实现其细胞分化或形成单层结构，从而增强研究炎症性肠病（IBD）期间肠上皮变化的能力。

哺乳动物结肠上皮中的隐窝-绒毛轴是一种复杂的结构，由具有不同功能的多种细胞类型组成。该轴的维持依赖于内在和外在的细胞因子，这些因子共同作用以维持上皮稳态18我们注意到，在传统培养基中培养的小鼠结肠类器官主要反映的是干细胞，而非干细胞与终末分化细胞的混合群体，后者在体内可见 体内此外，以这种方式培养和维持的小鼠结肠类器官呈圆形结构，而非扁平的单层细胞。这些差异可能对我们研究肠道疾病的努力产生影响 <.......

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有参与作者均无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作获得了美国国立卫生研究院资助 R01DK120986（资助对象：K.P.M.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.4-μM 透明 Transwell，24 孔Greiner Bio-one662-641
15 mL 锥形管Thermo Fisher 12-565-269
50 mL 锥形管Thermo Fisher 12-565-271
70-μM 细胞筛VWR76327-100
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-010储存浓度 (1x)；终浓度 (1x)
B-27 添加剂 Invitrogen12587-010储存浓度 (50x)；终浓度 (1x)
EVO 用筷子电极组World Precision InstrumentsSTX2
Corning Matrigel GFR 膜混合液Corning354-230储存浓度 (100%)；终浓度 (100%)
二硫苏糖醇 (DTT)Sigma-AldrichD0632-5G储存浓度 (1 M)；终浓度 (1.5 mM)；溶剂（超纯水）
高糖 DMEMThermo Fisher11960-069储存浓度 (1x)；终浓度 (1x)
不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液 (Dulbecco's phosphate-buffered saline)Gibco 14190-144储存浓度 (1x)；终浓度 (1x)
乙二胺四乙酸 (EDTA)Sigma-AldrichE7889储存浓度 (0.5 M)；终浓度 (30 mM)
胎牛血清Bio-TechneS11150H储存浓度 (100%)；终浓度 (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片，白色，25 × 75 mmThermo Fisher 12-550-15
G418InvivoGenant-ga-1终浓度 (400 µg/µL)
庆大霉素试剂Gibco/Fisher15750-060储存浓度 (50 mg/mL)；终浓度 (250 μg/mL)
GlutaMAX-1Fisher Scientific35050-061储存浓度 (100x)；终浓度 (1x)
HEPES 1 MGibco15630-080储存浓度 (1 M)；终浓度 (10 mM)
hIFNγR&D Systems285-IF储存浓度 (1000 ng/µL)；终浓度 (10 ng/mL)；溶剂（超纯水）
hIL-1βR&D Systems201-LB储存浓度 (10 ng/µL)；终浓度 (20 ng/mL)；溶剂（超纯水）
hTNFαR&D Systems210-TA储存浓度 (10 ng/µL)；终浓度 (40 ng/mL)；溶剂（超纯水）
过氧化氢 SigmaH1009储存浓度 (30%)；终浓度 (0.003%)；溶剂（小鼠洗涤培养基）
Hygromycin B GoldInvivoGenant-hg-1终浓度 (400 µg/µL)
L-WRN 细胞系ATCCCRL-3276
mEGFNovusNBP2-35176储存浓度 (0.5 µg/µL)；终浓度 (50 ng/mL)；溶剂（D-PBS + 1% BSA）
N-2 添加剂Invitrogen17502-048储存浓度 (100x)；终浓度 (1x)
N-乙酰-L-半胱氨酸Sigma A9165-5G储存浓度 (500 mM)；终浓度 (1 mM)；溶剂（超纯水）
NogginPeprotech250-38储存浓度 (0.1 ng/µL)；终浓度 (100 ng/mL)；溶剂（超纯水 + 0.1% BSA）
青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)Thermo Fisher15140-122储存浓度 (100x)；终浓度 (1x)
培养皿（灭菌；100 mm × 15 mm）聚苯乙烯一次性使用VWR25384-342
聚苯乙烯微孔板，24 孔，组织培养处理，无菌Greiner Bio-one5666-2160
R-SpondinR&D Systems3474-RS-050储存浓度 (0.25 µg/µL)；终浓度 (500 ng/mL)；溶剂（D-PBS + 1% BSA）
Tryp LE ExpressThermo Fisher12604-013储存浓度 (10x)；终浓度 (1x)；溶剂 (1 mM EDTA)
超纯水 Invitrogen10977-023储存浓度 (1x)；终浓度 (1x)
Y-27632 二盐酸盐 Abcamab120129储存浓度 (10 mM)；终浓度 (10 µM)；溶剂（超纯水）

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
  2. McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G.

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