研究肠道炎症对上皮的影响 体外 已建立的小鼠结肠类器官

摘要

我们描述了一种从小鼠结肠隐窝中分离并建立三维结肠类器官的实验方案。所建立的结肠类器官可进一步终末分化，以模拟宿主上皮细胞的组成，随后可用于炎症刺激实验，或进一步诱导形成上皮单层细胞模型。

摘要

肠上皮在人类健康中发挥着至关重要的作用，构成了宿主与外部环境之间的屏障。这一高度动态的细胞层在微生物群与免疫细胞群之间形成第一道防线，并有助于调节肠道免疫反应。上皮屏障的破坏是炎症性肠病（IBD）的典型特征，也是治疗干预的重要靶点。三维结肠类器官培养系统是一种极为有用的 体外 用于研究炎症性肠病发病机制中肠干细胞动态变化和上皮细胞生理学的模型。理想情况下，从动物的炎症上皮组织建立结肠类器官，将最有利于评估遗传和分子因素对疾病的影响。然而，我们已证明 体内 上皮改变在由急性炎症小鼠建立的结肠类器官中未必能够保留。为解决这一局限性，我们开发了一种使用炎症介质混合物处理结肠类器官的实验方案，这些炎症介质在炎症性肠病（IBD）期间通常水平升高。尽管该体系可广泛应用于多种培养条件，本方案重点介绍对已分化的结肠类器官以及由成熟结肠类器官衍生的二维单层细胞进行处理的方法。在传统培养条件下，结肠类器官富含肠干细胞，为研究干细胞微环境提供了理想体系。然而，该体系无法用于分析肠道生理功能特征，例如屏障功能；此外，传统结肠类器官也无法用于研究终末分化的上皮细胞对促炎刺激的细胞反应。本文所述方法为克服上述局限性提供了一种替代性实验框架。二维单层培养体系还为治疗性药物筛选提供了可行平台。 离体该细胞的极化层可在基底侧用炎性介质处理，同时在顶端给予潜在的治疗药物，以评估其在炎症性肠病治疗中的效用。

引言

炎症性肠病（IBD）是一种慢性、缓解与复发交替的疾病，其特征为反复发作的肠道炎症和临床静止期。IBD 的病因是多因素的，但该病的关键特征包括肠上皮屏障功能缺陷、通透性增加，以及肠上皮细胞区室内激活的促炎信号级联反应^1,2。已有多种体外（in vitro）和体内（in vivo）模型被用于模拟 IBD 期间的上皮反应，包括细胞培养和小鼠炎症模型³。然而，这些模型均存在重要局限性，限制了其对 IBD 期间上皮变化的准确模拟能力⁴。目前用于研究 IBD 的多数细胞系均为转化细胞系，虽能形成单层并具备一定的分化能力³，但其增殖方式本质上与宿主体内未转化的肠上皮细胞不同。研究 IBD 时也采用了多种不同的小鼠炎症模型，包括基因敲除模型、感染模型、化学诱导炎症模型以及 T 细胞移植模型^5,6,7,8。尽管这些模型可分别用于研究 IBD 的某些病因学方面，如遗传易感性、屏障功能障碍、免疫失调以及微生物组的影响，但在模拟该病复杂的多因素特性方面仍存在局限。

肠类器官，包括小肠类器官和结肠类器官，在过去十年中已被建立为一种有用的模型系统 体外 研究肠道干细胞动态及其在肠道上皮屏障完整性与功能中作用的模型，对于理解肠道稳态与疾病具有重要意义。这些研究模型极大地促进了我们对炎症性肠病（IBD）发病机制的认识。⁹ 并为个性化医学开辟了新的机遇。结肠类器官（colonoids）是由结肠来源的干细胞自发组织形成的组织培养物，已成功利用小鼠和人类组织建立。该培养过程可使位于肠隐窝内的干细胞持续增殖并长期维持。¹⁰干细胞微环境 体内 依赖于细胞外因子来支持其生长，特别是经典的Wnt信号通路和骨形态发生蛋白（bone-morphogenic protein）信号通路¹¹这些因子的添加可促进结肠类器官的健康与长期存活，但也促使培养体系向一种类似于干细胞的状态发展，而该状态并不能真实反映 在体 上皮细胞结构，由自我更新细胞和终末分化细胞组成^12,13尽管肠上皮的功能依赖于干细胞区室与分化细胞之间的持续相互作用，但在结肠类器官培养系统中同时实现这两种细胞的存在仍相当有限。尽管存在这些局限性，类器官培养系统仍然是研究上皮内在特性的金标准。 离体然而，可能需要考虑替代的培养策略来回答当前的科学问题。

已有研究表明，连续7天给予右旋糖酐硫酸钠（DSS）处理的小鼠会出现上皮炎症和屏障功能障碍¹⁴。此外，在人类炎症性肠病（IBD）中观察到的线粒体生物合成障碍以及肠上皮内的代谢重编程现象，也在该DSS诱导的结肠炎模型中得到再现¹⁵。然而，我们的初步数据显示，从DSS处理动物的隐窝中分离获得的结肠类器官并未保留线粒体生物合成障碍的特征（补充图1）。因此，在研究炎症如何驱动小鼠肠道上皮变化时，必须采用替代性的培养方法。本文中，我们介绍了一种自行建立的实验方案，内容包括：1）如何从完整的结肠组织中分离隐窝以建立小鼠结肠类器官；2）如何对这类细胞群体进行终末分化，以使其更真实地反映体内（in vivo）的细胞组成；以及3）如何在该体外（in vitro）模型中诱导炎症反应。为了研究药物在炎症上皮中的相互作用，我们还建立了一种从小鼠结肠类器官生成二维（2D）单层细胞的方案，该模型可从基底侧接受炎症介质处理，并从顶侧接受药物治疗。

方案

本文所述所有使用小鼠组织的实验均已获得匹兹堡大学机构审查委员会的批准，并依照匹兹堡大学和UPMC动物研究与护理委员会制定的指南进行。

1. 培养前准备

注意：所有试剂均列在材料表部分，所有溶液的组成均可在溶液组成表（表1）中找到。

1. 按照表1所述配制小鼠清洗液，4°C保存，可保存长达2个月。
2. 按照表1所述配制隐窝分离缓冲液1（CIB1），4°C保存，可保存长达2个月。
   ​注意：根据美国职业安全与健康管理局（OSHA）《危险信息沟通标准》，二硫苏糖醇（DTT）属于危险化学品，因其具有急性毒性，摄入后可能造成危害，接触皮肤和眼睛可导致损伤。操作该化学品时应佩戴防护手套、眼部防护装备和面部防护装备。
3. 按照表1所述配制隐窝分离缓冲液2（CIB2），4°C保存，可保存长达2个月。
4. 根据先前发表的方案¹⁶配制L-WRN条件培养基。
5. 按照表1所述配制完全结肠类器官培养基。完全结肠类器官生长培养基在4°C保存可稳定5天，不损失活性。
6. 按照表1所述配制分化培养基。本方案改编自先前发表的研究¹⁷。分化培养基在4°C保存可稳定5天，不损失活性。
7. 按照表1所述配制炎症介质培养基。本方案改编自先前发表的研究¹⁸。炎症介质培养基在4°C保存可稳定5天，不损失活性。
8. 配制小鼠单层细胞培养基。当使用炎症因子和/或药物刺激单层细胞时，应省略Y-27632。小鼠单层细胞培养基在4°C保存可稳定5天，不损失活性。
9. 配制炎症介质单层细胞培养基。该培养基在4°C保存可稳定5天，不损失活性。

2. 从小鼠结肠组织中分离隐窝

注意：将组织置于冰上进行转移。从 −20°C 保存条件下取出适量基底膜基质，置于冰上解冻。每个 24 孔板加入 15 µL 基底膜基质。按照第 1 部分所述方法制备 CIB1、CIB2 及完全结肠类器官生长培养基。

1. 根据机构动物护理和使用委员会批准的方案，对一只6-8周龄的C57BL/6J小鼠实施安乐死，并使用干净的镊子和剪刀分离其结肠远端（约5-7 cm）。
   注：本研究中，小鼠通过在二氧化碳安乐死舱中孵育2-3分钟，随后进行颈椎脱位的方式实施安乐死。
   1. 将小鼠仰卧放置，在肋骨下方做一横向切口，再从横向切口的中点向尾根部做一纵向切口，以暴露腹腔。
   2. 用镊子将小肠移出视野，识别结肠并沿其向尾根部追踪。如有需要，可用剪刀剪断骨盆以充分暴露远端结肠。使用剪刀剪下结肠最远端的5-7 cm部分。
2. 将结肠组织置于洁净的表面上。去除结肠周围多余的浆膜脂肪组织。使用连接18 G 1 1/2 针头的注射器，以杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗结肠腔内容物，以清除粪便残留。随后，将结肠放入含有10 mL冰冻DPBS的50 mL锥形管中，并置于冰上。
   注：若需从多只动物中分离结肠，应在处理下一只动物前先将组织置于冰上保存。
3. 将结肠组织转移至含有10 mL冰冻DPBS的培养皿中，使用P1,000移液器用DPBS冲洗肠腔两次。
4. 用剪刀纵向切开结肠，并在DPBS中用镊子轻轻振荡约30秒，以去除任何残留的粪便内容物。
5. 将组织转移至另一含有10 mL冰冻DPBS的新培养皿中，再次用镊子轻轻振荡，随后用剪刀将结肠切成约2 cm长的片段，并放入含有7 mL冰冻CIB1的50 mL锥形管中。将组织在冰上于CIB1中孵育20分钟。
   注：后续步骤均在生物安全柜内进行。
6. 用镊子将组织转移至预热的含有7 mL CIB2的50 mL锥形管中，并在37°C水浴中孵育5分钟。
7. 让组织沉降至锥形管底部，吸除CIB2液体，然后向同一锥形管中加入10 mL冰冻小鼠洗涤液。
8. 取一个新的50 mL锥形管，并在其开口处放置一个70 µm滤网。
9. 手持装有结肠内容物的管子，将手部旋转约45°，以剧烈摇动的方式震荡45秒，以释放隐窝。随后，将隐窝悬液通过70 µm细胞筛过滤至一个新的50 mL锥形管中。
10. 用镊子将结肠组织放回空的50 mL锥形管中，加入10 mL冰冻小鼠洗涤液。另取一个新的70 µm细胞筛，将其置于装有先前滤过液的50 mL锥形管上方。
11. 再次拿起装有隐窝片段的50 mL管，以与步骤2.9相同的方式剧烈震荡。将液体通过70 µm细胞筛过滤至50 mL锥形管中，与先前滤得的隐窝合并。
    注：若隐窝得率较低，可将组织放入装有10 mL小鼠洗涤液的空50 mL锥形管中再次震荡一次，持续45-50秒以释放更多隐窝。此外，若得率低，可增强震荡力度。最后，若总体隐窝得率仍低，可使用胎牛血清（FBS）预包被移液管和试管，以防止组织粘附于塑料表面。
12. 将含有滤过隐窝的50 mL锥形管在4°C下以300 x g离心5分钟。
    注：应在50 mL锥形管底部观察到沉淀物。
13. 吸除上清液，用10 mL冰冻小鼠洗涤液通过反复吹打重悬隐窝，并转移至15 mL锥形管中。在4°C下以300 x g离心5分钟。
14. 为获得更纯净的隐窝制备物，使用额外的10 mL小鼠洗涤液再次洗涤隐窝。弃去前次上清液，用10 mL小鼠洗涤液反复吹打重悬隐窝，并在4°C下使用15 mL锥形管以300 x g离心5分钟。
    注：吸除上清液时应格外小心，因为有时沉淀物未充分紧实。若沉淀松散，可吸除大部分上清液，保留500 µL至1 mL。然后用10 mL小鼠洗涤液吹打重悬沉淀，并将溶液转移至15 mL锥形管中。在较小的锥形管中离心可提高沉淀的紧实度。
15. 弃去上清液，用10 mL冰冻小鼠洗涤液通过反复吹打重悬隐窝。重悬后，立即吸取10 µL悬液滴加至载玻片上，在明场显微镜下计数隐窝数量。
    1. 在载玻片两端分别滴加两滴10 µL样品，计数每滴中的隐窝数量。取两滴数值的平均值，得到每10 µL中的隐窝数。将该数值乘以100，即可换算为每1 mL中的隐窝总数。
       注：为确保计数准确，必须在重悬后立即吸取10 µL隐窝悬液。否则隐窝会沉降至管底，导致计数不准确。
16. 以每孔接种300-500个隐窝为目标，将适量体积的隐窝悬液转移至新的15 mL锥形管中，并用冰冻小鼠洗涤液补足至10 mL。 在4°C下以300 x g离心5分钟。管底应可见少量沉淀。
17. 使用电动移液器吸除上清液。用P200移液器小心吸除残留液体，仅保留沉淀。
18. 通过缓慢反复吹打，将沉淀用适量冰冻基底膜基质重悬。重悬隐窝沉淀时应避免产生气泡。每孔接种300-500个隐窝/15 µL基底膜基质。接种后，将培养板倒置，放入37°C培养箱中孵育10-20分钟。
19. 将培养板恢复正位，向每孔加入500 µL完全小鼠结肠类器官培养基。每隔一天更换一次培养基，直至类器官可进行传代。每3-5天传代一次类器官。

3. 肠类器官的传代

注意：每个孔的传代比例通常为1:4至1:6，具体取决于原始孔的密度。从−20°C取出适量的基底膜基质，置于冰上解冻。类器官经过两次传代后可用于实验。传代结肠类器官时，所有步骤均应在生物安全柜中进行，以防止污染。

1. 移除需要传代的孔中的培养基。
   1. 如果基底膜基质中存在碎片（这可能在初次分离过程中发生），可使用以下方案清除碎片：
      1. 向每孔中加入 1 mL 冰冷的含 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的 DPBS（不含 Ca²⁺ 或 Mg²⁺），在生物安全柜中静置 5 分钟。
      2. 使用 P1000 移液器上下吹打 3 至 7 次，以破坏基底膜基质，并将孔内内容物收集至 15 mL 圆底离心管中。将结肠类器官在总共 5–10 mL 含 0.1% BSA 的 DPBS（不含 Ca²⁺ 或 Mg²⁺）中离心。用 0.1% BSA 补充至适当体积。
      3. 在 4°C 下以 150 × g 离心 5 分钟，使结肠类器官形成沉淀，而碎片不沉淀。
      4. 用移液器吸弃 DPBS，保留沉淀。加入 1 mL 室温（RT）酶解解离试剂，吹打 3 至 5 次。
      5. 将含有酶解解离试剂和已破坏的结肠类器官的 15 mL 圆底离心管置于 37°C 水浴中孵育 3–4 分钟。
      6. 从水浴中取出离心管，吹打 3–5 次，然后用小鼠洗涤培养基定容至 10 mL。继续进行步骤 3.6。
2. 向每孔中加入 500 µL 室温酶解解离试剂，静置约 1 分钟后，使用移液器上下吹打 3 至 7 次，以破坏基底膜基质。
3. 将培养板置于 37°C 培养箱中孵育 3–4 分钟。
4. 从培养箱中取出培养板，使用 P1000 移液器上下吹打 3 至 7 次，以解离结肠类器官。
5. 将内容物转移至 15 mL 圆底离心管中，并用冰冷的小鼠洗涤培养基定容至 10 mL。
6. 在 4°C 下以 300 × g 离心 5 分钟。
7. 根据需要使用电动移液器和 P200 移液器吸除上清液，仅保留离心管中的沉淀。
8. 根据待铺板的孔数，用适当体积的冰冷基底膜基质轻柔吹打重悬沉淀。吹打时避免产生气泡。每孔将结肠类器官片段置于 15 µL 基底膜基质液滴中。
9. 铺板隐窝结构，倒置组织培养板，然后将其置于 37°C 培养箱中孵育 10–20 分钟。
10. 最后将培养板恢复正位，向每孔中加入 500 µL 完全小鼠结肠类器官培养基。每隔一天更换一次培养基，直至类器官生长至足够大，可在约 3–5 天后再次传代。

4. 终末分化结肠类器官细胞

1. 按上述方法传代结肠类器官，并向每个孔中加入 500 µL 完全小鼠结肠类器官培养基。
2. 传代至少 48 小时后，移除完全小鼠结肠类器官培养基，并向每个孔中加入 500 µL 分化培养基（见第 1 节）。
3. 将结肠类器官在分化培养基中培养 48 小时，之后即可用于实验，包括 RNA 和蛋白质的收集。
   ​注意：可通过收集 RNA 并利用定量反转录聚合酶链式反应（qPCR）检测干细胞标志物 Lgr5 和细胞增殖标志物 Ki67 的表达水平，来评估结肠类器官的分化情况。与在传统结肠类器官培养基中生长、具有较强干细胞特性的类器官相比，终末分化的细胞中 Lgr5 和 Ki67 的表达水平应相对较低。结肠类器官在分化培养基中所需的培养时间可能需要根据不同实验室的具体条件进行优化。引物列表详见 补充表 1。

5. 使用炎性介质诱导分化后结肠类器官产生炎症反应

1. 结肠类器官在分化培养基中孵育 2-3 天后，移除现有培养基，每孔加入 500 µL 炎症介质培养基。
2. 继续孵育 24-72 小时，随后收集 RNA 和蛋白质（或检测其他下游指标）。每天更换培养基。

6. 由已建立的小鼠结肠类器官衍生的肠道上皮单层细胞

注意：小鼠肠道上皮单层细胞来源于已传代至少两次的小鼠结肠类器官。为了在3至5天内成功形成单层细胞，必须避免将结肠类器官分离成单个细胞。通过酶消化解离为细胞簇的类器官碎片最适合用于培养。

1. 实验开始前准备好所有试剂。将基底膜基质置于冰上解冻。按照第1节所述方法配制小鼠单层培养基。用预冷的小鼠单层培养基将解冻后的基底膜基质按1:20稀释，置于冰上备用。
2. 使用无菌镊子将一个0.4 µm透明细胞培养小室放入24孔组织培养板的单个孔中（材料表）。夹住小室的一个角状突起，将其转移至孔中。重复操作，直至获得所需数量的细胞培养小室。
   注意：需额外设置一个仅用基底膜基质包被的对照孔。该细胞培养小室将用于测量无细胞时小室本身的背景电阻，具体操作见后续步骤（步骤6.3）。
3. 使用P200移液器，将150 µL稀释后的基底膜基质覆盖于每个细胞培养小室的顶面（上表面）。将移液器吸头置于小室中央，避免接触小室膜，缓慢排出溶液。将培养板放入37°C、5% CO₂的无菌培养箱中孵育至少1小时。
4. 使用前轻轻去除基底膜基质，并将细胞培养小室在生物安全柜中晾干至少10分钟。
   1. 去除基底膜基质时，将24孔板倾斜45°角。用手指固定小室的角状突起以稳定小室，使用P200移液器将吸头轻轻置于小室底部一侧，吸除基质。
   2. 用150 µL无Ca²⁺和Mg²⁺的无菌DPBS洗涤每个细胞培养小室，以去除残留物。
5. 晾干10分钟后，在每个细胞培养小室底部加入400 µL小鼠单层培养基，在顶部加入75 µL。重复操作，直至所有小室均被浸没。将培养板置于生物安全柜中或放回培养箱中备用。
6. 从37°C、5% CO₂培养箱中取出成熟的（生长第3-5天）小鼠肠道类器官24孔板，置于生物安全柜中。使用无菌吸头吸除培养基，并用1 mL室温无菌DPBS（不含Ca²⁺或Mg²⁺）洗涤每孔。
   注意：每孔含75-125个成熟类器官时，按1:4比例进行传代。
7. 使用无菌吸头吸除不含Ca²⁺和Mg²⁺的DPBS，并在每个待传代的孔中加入500 µL室温酶解消化试剂，以消化基底膜基质凝块。
8. 将每孔液体用移液器上下吹打约6-10次以打散凝块。切勿刮擦孔底以去除凝块。可将24孔板倾斜45°角，将移液器吸头置于凝块边缘，轻轻吹打使其脱离。
9. 将24孔板重新放回37°C、5% CO₂无菌培养箱中孵育3-4分钟。
10. 取出培养板，在生物安全柜中将每孔的酶解消化试剂用移液器上下吹打5-7次。将解离后的类器官从各孔转移至无菌15 mL锥形管中，并用冰上预冷的小鼠洗涤培养基定容至10 mL。
11. 将部分消化的类器官在4°C下以300 x g离心5分钟（使用摆动桶转子离心机）。
12. 在生物安全柜中，使用10 mL移液器吸除上清液。用P200移液器吸除残留培养基。将类器官沉淀重悬于小鼠单层培养基中。每孔需接种的类器官碎片加入75 µL培养基。
13. 将75 µL类器官悬液加至每个细胞培养小室的中央。在吸取75 µL悬液前，应先轻轻吹打1-2次，以确保接种均匀。
14. 将带有细胞培养小室的24孔板置于旋转平台上旋转10分钟，以促进类器官在小室膜上均匀分布。
15. 将培养板放入37°C、5% CO₂无菌培养箱中继续培养。
16. 次日（第1天），使用P200移液器将培养基上下吹打3-5次，使未贴壁的类器官碎片脱落。移液时将吸头轻轻置于细胞培养小室内壁旁，避免扰动已贴壁的肠上皮细胞。操作过程中避免产生气泡，否则会影响未贴壁碎片的清除。
17. 立即吸除培养基与类器官混合物。重复操作，直至所有细胞培养小室均被清洗干净。
18. 向每个细胞培养小室的顶面轻轻加入150 µL预温的小鼠单层培养基。向新的24孔板每孔加入400 µL预温的小鼠单层培养基。使用无菌镊子夹住小室的突起，将细胞培养小室转移至新板中。每隔一天更换一次培养基，直至细胞融合。
    ​注意：类器官碎片通常在接种后3-5天形成融合的单层细胞。

7. 在单层培养的第3至第5天使用伏特-欧姆计测量上皮单层的净电阻

注意：筷子式电极呈镊子状，且长度不对称。探针较长的一臂为基底外侧电极，较短的一臂为顶端电极。将探针插入细胞培养小室的内部与外部之间时可能较为困难。插入时可先将探针倾斜一定角度，随后将其垂直扶正，以避免探针卡住。务必在相似的角度下读取每个细胞培养小室的净电阻值，因为角度差异可能影响测量结果。

1. 将伏特欧姆表和所有试剂放入生物安全柜内。
   1. 将伏特欧姆表插入最近的交流电源插座，并将电极探头的塑料模块连接器插入前面板上的INPUT插孔。
   2. 为使伏特欧姆表呈45°角放置，将设备背面的金属臂向外展开，直至其锁定到位。
   3. 现在，将前面板上的电源开关向上拨动以打开伏特欧姆表。最后，将开关向上拨至OHMS档，以该单位显示读数。
2. 从37°C、5% CO₂培养箱中取出24孔板，并将其平放在生物安全柜内。跨上皮电阻（TEER）对温度敏感，仅在测量TEER前立即取出培养板。
3. 将电极探头在预热的70%乙醇中灭菌30秒至1分钟。取出探头，倒置并轻弹一至两次以去除多余乙醇。让探头在空气中干燥约30秒。
4. 用预热的小鼠洗涤培养基清洗探头上残留的乙醇。
   警告：切勿让探头较高部位残留的乙醇液滴落入细胞培养小室中。用培养基清洗乙醇时，切勿让培养基液面超过无菌乙醇区域，否则可能导致污染的培养基进入细胞培养小室。
5. 将探头垂直于细胞培养小室持握。将基底外侧电极（探头较长的一端）插入细胞培养小室外侧，直至接触24孔板底部。将顶端电极（探头较短的一端）滑入细胞培养小室内。不同孔之间应保持两个电极的距离一致，否则会影响TEER测量结果。
6. 在读取TEER之前，确认顶端电极未接触细胞培养小室底部。从背景对照的细胞培养小室开始，记录读数。数值将自动以数字形式显示在伏特欧姆表的前面板上。
7. 对每个细胞培养小室重复步骤7.5–7.6。
   注：若不同细胞培养小室之间存在不同的实验条件，则在更换条件之间需对探头进行灭菌。从步骤7.1开始，按顺序依次执行后续步骤。
8. 完成所有TEER测量后，将24孔板放回培养箱中。
9. 净电阻值达到或超过350 Ω时，表明已形成单层细胞。在后续几天重复测量，直至达到单层细胞形成的标准。
   ​注：通常在第3天可测得1,000 Ω或更高的数值，但随着时间推移，所有数值最终会趋近于约350 Ω的较低水平。

8. 使用伏特计测量的净电阻值计算TEER

注意：结肠类器官单层成功形成后，其跨上皮电阻（TEER）测量值将大于 115 Ω·cm²。

1. 获取各个净电阻值，并从背景孔中减去净电阻。涂有基底膜基质的细胞培养小室的净读数约为 100 Ω。
2. 取背景校正后的净电阻测量值，乘以细胞培养小室的表面积。24 孔细胞培养小室的表面积为 0.33 cm²。
3. 如果数值达到或超过 115 Ω·cm²，则进行后续实验分析。

9. 使用炎性介质诱导上皮单层细胞的炎症反应

1. 单层细胞成功形成后，在培养物的基底侧加入炎性介质。按照步骤1.9所述方法制备含炎性介质的单层培养基，并向新的24孔板中每孔加入400 μL。
2. 移除细胞培养小室顶端侧的培养基，加入150 μL不含Y-27632的小鼠单层培养基。此侧不添加炎性介质。然而，若观察到细胞死亡过多，可保留培养基中的Y-27632。此决定需由最终使用者根据实际情况判断。
3. 将细胞培养小室转移至新的24孔板中，并将其放入已添加含炎性介质单层培养基的孔中。
4. 根据实验需求，使用炎性介质刺激单层细胞24–72小时。
5. 若需利用此炎性模型检测药物反应，可在细胞培养小室的顶端侧培养基中加入待测药物。药物可在实验过程中的任意时间点添加，具体取决于药物的作用机制及拟评估的下游指标。

结果

三维肠道类器官培养系统是研究肠上皮在肠道黏膜稳态中内在作用的宝贵工具。本方案详细描述了如何从8周龄C57BL/6J（WT）小鼠中分离隐窝，并建立可长期培养的结肠类器官体系，该体系可用于多种下游应用。将隐窝分离后接种于基底膜基质中，通过明场显微镜观察，可见隐窝结构致密且呈多细胞形态。其形状可为球形，或呈伸长的圆柱状，类似于体内正常存在的单个隐窝样结构。 体内 肠道结构图1A）。到第1天，大多数隐窝形成一个紧凑的球形结构，少数结肠类器官开始发育出无上皮细胞的内部腔隙（空腔）。图1B）。在接下来的数天中，随着类器官持续生长，结肠类器官的直径继续增大，其管腔结构也变得更加清晰（图1C）。到第5天，每个结肠类器官直径约为100–250 µm，形成一个较大的明显腔体，周围由一层薄薄的上皮干细胞环绕（图1D）。此时，类器官需通过酶消化和机械法进行消化传代。经过两次传代后，可用于后续实验。

...

讨论

类器官的开发彻底改变了科学界在体外研究器官系统的方式，能够在培养皿中部分重现动物或人类的细胞结构与功能。in vitro 此外，源自患病患者的类器官系统为个性化医疗提供了有前景的工具，可指导治疗决策。本文 介绍了一种效果良好的隐窝分离方案，并阐述了在接种前清除分离过程中多余碎片的关键步骤。此外，我们还解释了该过程中常被忽视的一个关键细节——准确计数隐窝以用于接种。在结肠类器官建立后，我们概述了若干关键操作步骤，可实现其细胞分化或形成单层结构，从而增强研究炎症性肠病（IBD）期间肠上皮变化的能力。

哺乳动物结肠上皮中的隐窝-绒毛轴是一种复杂的结构，由具有不同功能的多种细胞类型组成。该轴的维持依赖于内在和外在的细胞因子，这些因子共同作用以维持上皮稳态¹⁸我们注意到，在传统培养基中培养的小鼠结肠类器官主要反映的是干细胞，而非干细胞与终末分化细胞的混合群体，后者在体内可见 体内此外，以这种方式培养和维持的小鼠结肠类器官呈圆形结构，而非扁平的单层细胞。这些差异可能对我们研究肠道疾病的努力产生影响 <...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.4-μM 透明 Transwell，24 孔	Greiner Bio-one	662-641
15 mL 锥形管	Thermo Fisher	12-565-269
50 mL 锥形管	Thermo Fisher	12-565-271
70-μM 细胞筛	VWR	76327-100
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	储存浓度 (1x)；终浓度 (1x)
B-27 添加剂	Invitrogen	12587-010	储存浓度 (50x)；终浓度 (1x)
EVO 用筷子电极组	World Precision Instruments	STX2
Corning Matrigel GFR 膜混合液	Corning	354-230	储存浓度 (100%)；终浓度 (100%)
二硫苏糖醇 (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-5G	储存浓度 (1 M)；终浓度 (1.5 mM)；溶剂（超纯水）
高糖 DMEM	Thermo Fisher	11960-069	储存浓度 (1x)；终浓度 (1x)
不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液 (Dulbecco's phosphate-buffered saline)	Gibco	14190-144	储存浓度 (1x)；终浓度 (1x)
乙二胺四乙酸 (EDTA)	Sigma-Aldrich	E7889	储存浓度 (0.5 M)；终浓度 (30 mM)
胎牛血清	Bio-Techne	S11150H	储存浓度 (100%)；终浓度 (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片，白色，25 × 75 mm	Thermo Fisher	12-550-15
G418	InvivoGen	ant-ga-1	终浓度 (400 µg/µL)
庆大霉素试剂	Gibco/Fisher	15750-060	储存浓度 (50 mg/mL)；终浓度 (250 μg/mL)
GlutaMAX-1	Fisher Scientific	35050-061	储存浓度 (100x)；终浓度 (1x)
HEPES 1 M	Gibco	15630-080	储存浓度 (1 M)；终浓度 (10 mM)
hIFNγ	R&D Systems	285-IF	储存浓度 (1000 ng/µL)；终浓度 (10 ng/mL)；溶剂（超纯水）
hIL-1β	R&D Systems	201-LB	储存浓度 (10 ng/µL)；终浓度 (20 ng/mL)；溶剂（超纯水）
hTNFα	R&D Systems	210-TA	储存浓度 (10 ng/µL)；终浓度 (40 ng/mL)；溶剂（超纯水）
过氧化氢	Sigma	H1009	储存浓度 (30%)；终浓度 (0.003%)；溶剂（小鼠洗涤培养基）
Hygromycin B Gold	InvivoGen	ant-hg-1	终浓度 (400 µg/µL)
L-WRN 细胞系	ATCC	CRL-3276
mEGF	Novus	NBP2-35176	储存浓度 (0.5 µg/µL)；终浓度 (50 ng/mL)；溶剂（D-PBS + 1% BSA）
N-2 添加剂	Invitrogen	17502-048	储存浓度 (100x)；终浓度 (1x)
N-乙酰-L-半胱氨酸	Sigma	A9165-5G	储存浓度 (500 mM)；终浓度 (1 mM)；溶剂（超纯水）
Noggin	Peprotech	250-38	储存浓度 (0.1 ng/µL)；终浓度 (100 ng/mL)；溶剂（超纯水 + 0.1% BSA）
青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122	储存浓度 (100x)；终浓度 (1x)
培养皿（灭菌；100 mm × 15 mm）聚苯乙烯一次性使用	VWR	25384-342
聚苯乙烯微孔板，24 孔，组织培养处理，无菌	Greiner Bio-one	5666-2160
R-Spondin	R&D Systems	3474-RS-050	储存浓度 (0.25 µg/µL)；终浓度 (500 ng/mL)；溶剂（D-PBS + 1% BSA）
Tryp LE Express	Thermo Fisher	12604-013	储存浓度 (10x)；终浓度 (1x)；溶剂 (1 mM EDTA)
超纯水	Invitrogen	10977-023	储存浓度 (1x)；终浓度 (1x)
Y-27632 二盐酸盐	Abcam	ab120129	储存浓度 (10 mM)；终浓度 (10 µM)；溶剂（超纯水）