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方法文章

H9c2 心肌细胞中电压依赖性钾电流的记录 通过 全细胞膜片钳技术

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DOI：

10.3791/64805

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2022年11月11日

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1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Techman Instrument Co., Ltd., 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了一种利用全细胞膜片钳技术在H9c2心肌细胞中实时、动态记录电压门控钾（Kv）通道电流的高效方法。

摘要

心肌细胞膜上的钾离子通道在调控细胞电生理活动中发挥着重要作用。作为主要的离子通道之一，电压门控钾通道（Kv通道）与某些严重的心脏疾病密切相关，例如药物引起的心肌损伤和心肌梗死。本研究采用全细胞膜片钳技术，检测了1.5 mM 4-氨基吡啶（4-AP，一种广谱钾通道抑制剂）和乌头碱（AC，25 µM、50 µM、100 µM 和 200 µM）对H9c2心肌细胞中Kv通道电流（IKv）的影响。结果显示，4-AP使IKv抑制约54%；而AC对IKv的抑制作用呈剂量依赖性趋势（25 µM无影响，50 µM时抑制率为30%，100 µM时抑制率为46%，200 µM时抑制率为54%）。由于该技术具有较高的敏感性和精确性，将有助于推动以离子通道为靶点的民族药物心脏毒性及药理作用的研究。

引言

离子通道是嵌入细胞膜脂质双分子层中的一类特殊整合蛋白。在激活剂存在的情况下，这类特殊整合蛋白的中心会形成高度选择性的亲水性孔道，允许特定大小和电荷的离子以被动运输的方式通过1。离子通道是细胞兴奋性和生物电活动的基础，在多种细胞活动中发挥关键作用2。心脏通过规律性收缩向其他器官供血，这种收缩由动作电位引发的兴奋-收缩耦联过程所驱动3。既往研究表明，心肌细胞动作电位的产生源于细胞内离子浓度的变化，而人类心肌细胞中Na+、Ca2+和K+离子通道的激活与失活按一定顺序进行，从而形成动作电位4,5,6。电压门控性钾通道（Kv）电流（IKv）的异常可改变正常心律，导致心律失常，而心律失常是导致死亡的主要原因之一。因此，记录IKv对于理解治疗危及生命的心律失常药物的作用机制至关重要7。

Kv 通道是钾通道的重要组成部分。Kv 通道的协调功能在哺乳动物心脏的电活动和心肌收缩力中起着重要作用8,9,10。在心肌细胞中，动作电位的幅度和持续时间取决于多种 Kv 通道亚型共同介导的外向 K+ 电流11。Kv 通道功能的调控对于心脏动作电位的正常复极化至关重要。即使 Kv 电导发生最轻微的变化，也会显著影响心脏复极化过程，并增加心律失常的发生风险12,13。

全细胞膜片钳记录技术是细胞电生理研究中的一种基本方法，通过施加负压，可在细胞膜的小区域与玻璃微电极尖端之间形成高阻封接。持续的负压使细胞膜与微电极尖端接触并贴附于电极内壁，从而形成完整的电气回路，使研究者能够记录细胞膜表面单个离子通道的电流14。该技术对细胞膜离子通道电流具有极高的灵敏度，可检测所有类型离子通道的电流，应用范围极为广泛15。此外，与荧光标记和放射性标记相比，膜片钳技术具有更高的权威性和准确性16。目前，全细胞膜片钳技术已被用于检测作用于Kv通道电流的中药成分17,18,19。例如，Wang等人采用全细胞膜片钳技术，证实莲子的有效成分可能通过阻断激活态通道实现对Kv4.3通道的抑制作用19。乌头碱（AC）是乌头属（Aconitum）植物（如川乌Aconitum carmichaeli Debx和草乌Aconitum pendulum Busch）中的有效活性成分之一。大量研究表明，AC过量使用可导致心律失常甚至心脏骤停20。AC与电压门控离子通道的相互作用会破坏细胞内离子稳态，这是其心脏毒性的关键机制21。因此，本研究采用全细胞膜片钳技术，测定AC对心肌细胞IKv电流的影响。

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方案

商业获取的H9c2大鼠心肌细胞（见材料表）在含10%热灭活胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2 的湿化环境中培养。随后采用全细胞膜片钳技术检测正常H9c2细胞以及经4-AP或AC处理的细胞中IKv的变化（图1和图2）。

1. 溶液配制

  1. 配制含有10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM细胞培养基（参见材料表）。
  2. 将14.1165 mg的4-AP加入100 µL DMSO溶液中，配制1.5 M的4-AP溶液（参见材料表）。通过加入细胞外液（步骤1.5）将1.5 M 4-AP稀释至1.5 mM。
  3. 将5 mg AC加入19.36 µL DMSO溶液中，配制400 mM AC（参见材料表）。
    注意：上述所有溶液均储存于4 °C冰箱中，DMSO的终浓度不得超过0.1%（v/v）。
  4. 在50 mL双蒸水中加入0.4100 g KCl（110.0 mM）、0.0120 g MgCl2 （1.2 mM）、0.1270 g Na2 ATP（5.0 mM）、0.1190 g HEPES（10.0 mM）和0.1900 g EGTA（10.0 mM），配制50 mL细胞内液（参见表1和材料表）。
    注意：使用1 M KOH将细胞内液的pH值调节至7.2，并分装成小体积（1.5–2 mL）后于−20 °C保存。
  5. 在50 mL双蒸水中加入0.0185 g KCl（5.0 mM）、0.3945 g NaCl（135.0 mM）、0.0203 g MgCl2·6H2O（2.0 mM）、0.0595 g HEPES（5.0 mM）和0.0990 g D-葡萄糖（10.0 mM），配制50 mL细胞外液（参见表1和材料表）。
    注意：细胞外液需现配现用，并使用1 M NaOH将pH值调节至7.4。

2. 细胞培养

  1. 当 H9c2 培养皿细胞融合度达到 80% 时，用 0.25% 胰蛋白酶消化 30 秒。
  2. 将细胞以 2 × 105 个/mL 的密度接种于铺有玻璃片的 35 mm 培养皿中，加入普通培养基或含药培养基（含 25 µM、50 µM、100 µM 和 200 µM AC），在 37 °C、5% CO2 、相对湿度 70% 至 80% 的条件下培养 24 小时（参见 材料表）。

3. 微量移液管的制备

  1. 打开微电极拉制仪（参见材料表），预热30分钟。
  2. 将一根带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管（外径：1.5 mm，内径：1.10 mm，长度：10 cm）安装到微电极拉制仪上。选择步骤3.3中设定的程序，然后点击控制面板上的Enter。点击右上角的Ramp程序，以确定玻璃毛细管的"Heat"值。
  3. 根据"Ramp"测试确定的数值编写电极拉制程序，并按以下步骤操作："Heat"值 = "Ramp"值，Pull = 0，Vel = 拉杆移动速度，Time = 200–250。点击Pull开始制备微电极毛细管。
    注意：使用前观察微电极拉制仪密封容器中干燥剂的颜色。若颜色由蓝色变为粉红色，则必须更换干燥剂。为防止电极尖端污染，在制备毛细管过程中应尽量避免触碰玻璃毛细管的中部。随后小心取下制得的毛细管，并将其放入密闭容器中保存。

4. 仪器设置

  1. 按以下顺序开启相应仪器：数模转换器、信号放大器、显微操作器、显微镜和相机（参见材料表）。
  2. 依次打开成像应用程序、信号放大器软件和数据采集软件（参见材料表）。
    注意：仪器必须按顺序开启；否则，打开软件后将出现"Demo Digitizer"状态。

5. IKv 参数设置

  1. 按照以下步骤编辑记录 IKv 的实验方案。
    1. 点击 编辑，然后在数据采集软件中选择 编辑实验方案（参见材料表）。
    2. 在 "波形" 界面中编辑程序：A 时段（初始电平 = −60 mV，电平变化值 = 0 mV，初始持续时间 = 20 ms，持续时间变化值 = 0 ms）；B 时段（初始电平 = −40 mV，电平变化值 = 10 mV，初始持续时间 = 150 ms，持续时间变化值 = 0 ms）；C 时段（初始电平 = −60 mV，电平变化值 = 0 mV，初始持续时间 = 30 ms，持续时间变化值 = 0 ms）。
    3. 然后点击 模式/频率 界面，设置 "试验层级" 数据：试验延迟时间 = 0 s，运行次数 = 1，扫描次数 = 11，单次扫描持续时间 = 0.22 s22,23。
      注：在对照条件下，于 −60 mV 的钳制电位下，施加从 −40 mV 至 +60 mV、步长为 10 mV、持续 150 ms 的去极化脉冲，以记录 IKv 通道电流。该实验方案的总时间必须大于 "波形" 程序中设定的时间。
  2. 编辑 P/N 漏电流减除程序：点击 编辑实验方案 以选择 刺激 按钮，并在 P/N 漏电流减除 对话框中设置漏电流减除程序：减除扫描次数 = 2–8（本研究中为 4），稳定时间 = 100–1,000 ms（本研究中为 200 ms），"极性" = "与波形相反"，钳制电平 = −80 mV。
    注：P/N 漏电流减除的钳制电平必须低于 "初始钳制电平"（−60 mV）。

6. 电压钳模式下全细胞膜片钳记录 IKv

  1. 建立数据存储路径：单击 文件，并选择 设置数据文件名称 在数据采集软件中。打开已建立的 IKv 方案（步骤 5.1）中通过选择 编辑 并点击 开放实验方案 在数据采集软件中。最后，单击 工具 选项，并选择 膜片钳测试 开始运行实验方案。
  2. 将细胞外液（步骤1.5）加入全细胞膜片钳装置的细胞浴中（参见 材料表），将盖玻片细胞面向上，放入浴槽中，盖玻片上的H9c2细胞为第2.1步中培养的细胞。
  3. 用细胞外液填充移液管（步骤3中制备）体积的30%，并将移液管安装到膜片钳装置集成的记录电极夹持器上。使用O形橡胶垫圈和塑料垫片拧紧移液管。随后，通过显微操作器将移液管放入浴液中。点击 移液偏移量 信号放大器软件的界面（参见 材料表) 以维持 IKv 0 pA 的当前基线。
    注意：细胞内液（步骤 1.4）必须与银丝的 AgCl/Ag 部分接触，且银丝不得靠近移液管内壁。移液管的电阻需为 2–6 MΩ。为避免移液管尖端堵塞，必须通过连接记录电极夹持器的 1.0 mL 注射器持续向移液管施加正压。 通过 塑料管24.
  4. 使用1.0 mL注射器通过塑料管连接记录电极 holder，手动施加适当的正压。通过三维调节显微操作器，轻微移动移液管，使其接触细胞。
  5. 当移液管接触细胞膜后，若膜测试方波下降至原来的1/3至1/2，即刻撤去正压，并手动施加适当的负压，随后点击 贴片 数据采集软件界面以形成吉欧姆（GΩ）封接。使用 "Cp 快速" 和 "Cp 缓慢" 在细胞封接过程中使用信号放大软件以补偿快速和慢速电容。
    注意：当膜电阻测试值 ≥1 GΩ 时，移液管尖端与细胞之间形成细胞贴附式构型。
  6. 施加短暂的负压脉冲以破裂细胞膜的一小片区域。
    注意：膜电阻急剧下降是成功形成全细胞记录模式的特征。如果接入电阻（Ra) ≥30 MΩ 时，必须重新选择细胞进行步骤 6.3–6.6。为确保记录的 IKv 数据表明，细胞膜破裂后必须解除负压。
  7. 通过点击执行全细胞膜电容补偿 全细胞 信号放大器软件上的按钮。最后，通过点击保存并记录数据 数据记录 按钮
  8. 打开已保存的 IKv 使用数据分析软件处理数据。保存电流-电压（I−V）关系：点击 分析 选择 统计学 执行以下操作：选择 范围 作为 库索斯 1,2 用于数据分析；点击 峰值振幅 和 平均值 按钮，然后单击 好的 以查看数据中的 结果 页。最后，复制 I 列Kv 将平均数据输入函数绘图软件（参见 材料表）以进行进一步分析。
  9. 保存代表性 IKv 电流迹线：单击 编辑 选择 转移痕迹；然后，选择 完整追踪 在 待转移区域；接下来，点击 选择 在 轨迹选择，并选择 IN 0 (pA) 在 信号；最后，单击 好的 以查看数据中的 "结果" 页面，并将全部数据复制到函数绘图软件中，以绘制电流轨迹。
  10. 保存 IKv 方案：单击 编辑 选择 创建刺激波形信号，并选择 好的然后，重新执行步骤6.9，但选择除外 A0 # 0 (mA) 在 "信号".

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结果

本方案根据全细胞膜片钳技术设定的参数，实现了对IKv的记录。IKv通过在−60 mV钳制电位下施加持续150 ms、从−40 mV至+60 mV的去极化脉冲刺激而诱发（图3A）。H9c2大鼠心肌细胞的IKv在约−20 mV时首次出现，随后随着进一步去极化，电流幅度逐渐增大。根据测得的电流幅值，计算出IKv与膜电位之间的平均关系。结果表明，与对照组相比，经1.5 mM 4-AP处理5 min后，IKv幅值明显降低（图3B）。此外，在24 h交流电（AC）处理后，IKv在10 mV至60 mV膜电位范围内的电流显著减小，且呈剂量依赖性（图3C-F）。

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讨论

膜片钳电生理技术主要用于记录和反映细胞膜上离子通道的电活动及功能特性25。目前，膜片钳技术的主要记录方法包括单通道记录和全细胞记录26。在全细胞记录模式中，利用玻璃微电极和负压在细胞膜的一小片区域与移液管尖端之间形成高阻封接27。当持续的负压导致移液管尖端破裂细胞膜，并使膜贴附于移液管内壁时，移液管与细胞之间即形成完整的电路，从而可记录细胞膜表面单个离子通道的电流密度26,27。近年来，全细胞膜片钳技术已广泛应用于靶向离子通道相关疾病的药物研究。尽管该技术对操作者要求较高，但仍被公认为离子通道研究的"金标准"28。此外，穿孔膜片钳技术可通过抗生素在细胞膜上形成通透性孔道，从而在相对稳定的细胞内环境中长时间记录靶离子通道的电流变化29,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢国家自然科学基金（82130113）和重点研发计划&D 和科学转化项目 & 青海省科技厅（2020-SF-C33）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4-氨基吡啶SigmaMKCJ2184
乌头碱成都乐美天医药科技有限公司DSTDW000602
放大器Axon InstrumentMultiClamp 700B
分析天平Sartorius124S-CW
ATP Na2Solarbio416O022
含丝硼硅酸盐玻璃毛细管（外径：1.5 mm，内径：1.10 mm，长度：10 cm） Sutter Instrument163225-5
细胞培养皿（100 mm）浙江索法生命科学研究有限公司1192022
细胞培养皿（35 mm）浙江索法生命科学研究有限公司3012022
Clampex 软件Molecular Devices, LLC.Version 10.5
Clampfit 软件Molecular Devices, LLC.Version 10.6.0.13数据采集软件
D-(+)-葡萄糖RhawnRH289133
数码相机HamamatsuC11440
数模转换器Axon InstrumentAxon digidata 1550B
DMSO武汉博士德生物工程有限公司PYG0040
杜尔贝科改良伊格尔培养基（1x）Gibco8121587
EGTABiofroxxEZ6789D115
胎牛血清Gibco2166090RP
Flaming/Brown 微电极拉制仪Sutter InstrumentModel P-1000
H9c2 细胞湖南丰晖生物科技有限公司CL0111
HCImageLiveHamamatsu4.5.0.0
HCl四川西陇科学有限公司2106081
HEPES西亚化学科技（山东）有限公司20210221
KCl成都科龙化工试剂厂2020082501
KOH成都科龙化工试剂厂2020112601
MgCl2天津市光复精细化工研究所20160408
MgCl2·6H2O成都科龙化工试剂厂2021020101
显微操作器Sutter InstrumentMP-285A
显微镜OlympusIX73
显微镜盖玻片（20 × 20 mm）江苏启东市西拓实验设备有限公司80340-0630
Milli-Q 超纯水系统成都生物科技有限公司Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B 控制软件Axon InstrumentMultiClamp commander 2.0信号放大器软件 
OriginPro 8 软件OriginLab Corporationv8.0724(B724)
青霉素-链霉素（100x）武汉博士德生物工程有限公司17C18B16
PH 计 Mettler ToledoS201K
磷酸盐缓冲液（1x）Gibco8120485
胰蛋白酶 0.25%（1x）HyCloneJ210045

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