本方案介绍了一种利用全细胞膜片钳技术在H9c2心肌细胞中实时、动态记录电压门控钾（Kv）通道电流的高效方法。
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方法文章
H9c2 心肌细胞中电压依赖性钾电流的记录 通过 全细胞膜片钳技术
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
心肌细胞膜上的钾离子通道在调控细胞电生理活动中发挥着重要作用。作为主要的离子通道之一，电压门控钾通道（Kv通道）与某些严重的心脏疾病密切相关，例如药物引起的心肌损伤和心肌梗死。本研究采用全细胞膜片钳技术，检测了1.5 mM 4-氨基吡啶（4-AP，一种广谱钾通道抑制剂）和乌头碱（AC，25 µM、50 µM、100 µM 和 200 µM）对H9c2心肌细胞中Kv通道电流（IKv）的影响。结果显示，4-AP使IKv抑制约54%；而AC对IKv的抑制作用呈剂量依赖性趋势（25 µM无影响，50 µM时抑制率为30%，100 µM时抑制率为46%，200 µM时抑制率为54%）。由于该技术具有较高的敏感性和精确性，将有助于推动以离子通道为靶点的民族药物心脏毒性及药理作用的研究。
引言
离子通道是嵌入细胞膜脂质双分子层中的一类特殊整合蛋白。在激活剂存在的情况下，这类特殊整合蛋白的中心会形成高度选择性的亲水性孔道，允许特定大小和电荷的离子以被动运输的方式通过1。离子通道是细胞兴奋性和生物电活动的基础，在多种细胞活动中发挥关键作用2。心脏通过规律性收缩向其他器官供血，这种收缩由动作电位引发的兴奋-收缩耦联过程所驱动3。既往研究表明，心肌细胞动作电位的产生源于细胞内离子浓度的变化，而人类心肌细胞中Na+、Ca2+和K+离子通道的激活与失活按一定顺序进行，从而形成动作电位4,5,6。电压门控性钾通道（Kv）电流（IKv）的异常可改变正常心律，导致心律失常，而心律失常是导致死亡的主要原因之一。因此，记录IKv对于理解治疗危及生命的心律失常药物的作用机制至关重要7。
Kv 通道是钾通道的重要组成部分。Kv 通道的协调功能在哺乳动物心脏的电活动和心肌收缩力中起着重要作用
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方案
商业获取的H9c2大鼠心肌细胞（见材料表）在含10%热灭活胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2 的湿化环境中培养。随后采用全细胞膜片钳技术检测正常H9c2细胞以及经4-AP或AC处理的细胞中IKv的变化（图1和图2）。
1. 溶液配制
- 配制含有10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM细胞培养基（参见材料表）。
- 将14.1165 mg的4-AP加入100 µL DMSO溶液中，配制1.5 M的4-AP溶液（参见材料表）。通过加入细胞外液（步骤1.5）将1.5 M 4-AP稀释至1.5 mM。
- 将5 mg AC加入19.36 µL DMSO溶液中，配制400 mM AC（参见材料表）。
注意：上述所有溶液均储存于4 °C冰箱中，DMSO的终浓度不得超过0.1%（v/v）。 - 在50 mL双蒸水中加入0.4100 g KCl（110.0 mM）、0.0120 g MgCl2&#....
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结果
本方案根据全细胞膜片钳技术设定的参数，实现了对IKv的记录。IKv通过在−60 mV钳制电位下施加持续150 ms、从−40 mV至+60 mV的去极化脉冲刺激而诱发（图3A）。H9c2大鼠心肌细胞的IKv在约−20 mV时首次出现，随后随着进一步去极化，电流幅度逐渐增大。根据测得的电流幅值，计算出IKv与膜电位之间的平均关系。结果表明，与对照组相比，经1.5 mM 4-AP处理5 min后，IKv幅值明显降低（图3B）。此外，在24 h交流电（AC）处理后，IKv在10 mV至60 mV膜电位范围内的电流显著减小，且呈剂量依赖性（图3C-F）。
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讨论
膜片钳电生理技术主要用于记录和反映细胞膜上离子通道的电活动及功能特性25。目前，膜片钳技术的主要记录方法包括单通道记录和全细胞记录26。在全细胞记录模式中，利用玻璃微电极和负压在细胞膜的一小片区域与移液管尖端之间形成高阻封接27。当持续的负压导致移液管尖端破裂细胞膜，并使膜贴附于移液管内壁时，移液管与细胞之间即形成完整的电路，从而可记录细胞膜表面单个离子通道的电流密度26,27。近年来，全细胞膜片钳技术已广泛应用于靶向离子通道相关疾病的药物研究。尽管该技术对操作者要求较高，但仍被公认为离子通道研究的"金标准"28。此外，穿孔膜片钳技术可通过抗生素在细胞膜上形成通透性孔道，从而在相对稳定的细胞内环境中长时间记录靶离子通道的电流变化29,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢国家自然科学基金（82130113）和重点研发计划&D 和科学转化项目 & 青海省科技厅（2020-SF-C33）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4-氨基吡啶 | Sigma | MKCJ2184 | |
| 乌头碱 | 成都乐美天医药科技有限公司 | DSTDW000602 | |
| 放大器 | Axon Instrument | MultiClamp 700B | |
| 分析天平 | Sartorius | 124S-CW | |
| ATP Na2 | Solarbio | 416O022 | |
| 含丝硼硅酸盐玻璃毛细管（外径：1.5 mm，内径：1.10 mm，长度：10 cm） | Sutter Instrument | 163225-5 | |
| 细胞培养皿（100 mm） | 浙江索法生命科学研究有限公司 | 1192022 | |
| 细胞培养皿（35 mm） | 浙江索法生命科学研究有限公司 | 3012022 | |
| Clampex 软件 | Molecular Devices, LLC. | Version 10.5 | |
| Clampfit 软件 | Molecular Devices, LLC. | Version 10.6.0.13 | 数据采集软件 |
| D-(+)-葡萄糖 | Rhawn | RH289133 | |
| 数码相机 | Hamamatsu | C11440 | |
| 数模转换器 | Axon Instrument | Axon digidata 1550B | |
| DMSO | 武汉博士德生物工程有限公司 | PYG0040 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（1x） | Gibco | 8121587 | |
| EGTA | Biofroxx | EZ6789D115 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 2166090RP | |
| Flaming/Brown 微电极拉制仪 | Sutter Instrument | Model P-1000 | |
| H9c2 细胞 | 湖南丰晖生物科技有限公司 | CL0111 | |
| HCImageLive | Hamamatsu | 4.5.0.0 | |
| HCl | 四川西陇科学有限公司 | 2106081 | |
| HEPES | 西亚化学科技（山东）有限公司 | 20210221 | |
| KCl | 成都科龙化工试剂厂 | 2020082501 | |
| KOH | 成都科龙化工试剂厂 | 2020112601 | |
| MgCl2 | 天津市光复精细化工研究所 | 20160408 | |
| MgCl2·6H2O | 成都科龙化工试剂厂 | 2021020101 | |
| 显微操作器 | Sutter Instrument | MP-285A | |
| 显微镜 | Olympus | IX73 | |
| 显微镜盖玻片（20 × 20 mm） | 江苏启东市西拓实验设备有限公司 | 80340-0630 | |
| Milli-Q 超纯水系统 | 成都生物科技有限公司 | Milli-Q IQ 7005 | |
| MultiClamp 700B 控制软件 | Axon Instrument | MultiClamp commander 2.0 | 信号放大器软件 |
| OriginPro 8 软件 | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| 青霉素-链霉素（100x） | 武汉博士德生物工程有限公司 | 17C18B16 | |
| PH 计 | Mettler Toledo | S201K | |
| 磷酸盐缓冲液（1x） | Gibco | 8120485 | |
| 胰蛋白酶 0.25%（1x） | HyClone | J210045 |
参考文献
- Luan, Q. H. Passive transport and ion channels in biofilms. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).
- Lei, M., Sun, S. Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease. <....
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重印与许可
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