本文介绍了一种从冻融后的卵巢皮质组织中分离人卵巢卵泡以进行基因表达分析的实验方案。
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摘要
摘要
卵巢是一种由多种细胞类型组成的异质性器官。为了研究卵泡发生过程中的分子机制，可在固定组织上进行蛋白质定位和基因表达分析。然而，要准确评估人卵泡中的基因表达水平，必须分离出这一复杂而精细的结构。因此，已参照Woodruff实验室先前描述的方法建立了一种改良方案，用于将卵泡（包括卵母细胞和颗粒细胞）从其周围环境中分离出来。首先通过手工处理卵巢皮质组织，利用组织切片器和组织切碎器两种工具将其切割成小片段。随后使用0.2%胶原酶和0.02% DNase进行酶消化，时间不少于40分钟。消化过程在37 °C、5% CO2条件下进行，并每隔10分钟用移液器对培养基进行机械吹打。孵育结束后，在显微镜放大条件下，使用校准的微毛细移液管手工收集分离的卵泡。若组织碎片中仍有残留卵泡，则需进一步通过手工显微解剖完成分离。收集的卵泡置于冰上保存于培养基中，并用磷酸盐缓冲液液滴清洗两次。该消化过程必须严格控制，以避免卵泡结构受损。一旦观察到卵泡结构出现破坏，或消化时间达到最长90分钟，应立即加入含10%胎牛血清的4 °C阻断液终止反应。为确保后续进行实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）时获得足量的总RNA，至少需收集20个分离的卵泡（直径小于75 µm）。提取后，20个卵泡的总RNA浓度平均可达5 ng/µL。随后将总RNA逆转录为cDNA，并利用RT-qPCR进一步分析目的基因的表达水平。
引言
卵巢是一个复杂的器官，由功能性和结构性单位组成，包括皮质内的卵泡和间质组织。卵泡发生是指卵泡从原始静止状态被激活、生长并成熟为能够受精并支持早期胚胎发育的成熟卵泡的过程，这一过程在科研领域被广泛研究1。揭示驱动这一现象的机制可能有助于改善女性的生育治疗2。对固定的人体组织进行分析，可评估卵巢功能单位内蛋白质表达和基因定位情况3,4。然而，需要特定的技术将卵泡从周围皮质中分离出来，以准确评估卵巢卵泡内的基因表达水平。因此，在先前的研究中，已开发出一种卵泡分离技术，以便直接从卵巢功能单位中进行基因表达分析5。目前已发展出多种方法，如酶消化法和/或机械分离法，以及激光捕获显微切割技术，可在组织切片中实现卵泡的分离6,7,8,9。卵泡分离技术被广泛应用于人或动物的卵巢组织，以评估各个发育阶段卵泡的基因表达谱10,11,12。然而，理想的分离流程应考虑到卵泡在致密皮质中的脆弱结构，因此操作时需格外小心，避免造成任何损伤7。本文描述了一种改进自Woodruff实验室所报道方案的操作流程，用于从冻融的人卵巢皮质组织中分离卵泡，以进行基因表达分析13。
从冻存的人类组织中分离卵巢卵泡的第一步是解冻过程。该过程依据先前所述的用于冻存卵巢组织移植的临床方案进行14,15。该过程旨在通过将卵巢皮质在逐渐降低浓度的培养基中洗涤，以去除冷冻保护剂。随后，在进行酶解和机械分离以获取卵泡前，需将组织切碎。可利用具有高倍放大率和高质量光学系统的体视显微镜区分处于不同发育阶段的卵泡，从而分离出目标卵泡。每个分离出的卵泡均使用显微镜内置的标尺进行测量，并可根据其发育阶段进行分类：原始卵泡（30 µm）、初级卵泡（60 µm）、次级卵泡（120–200 µm）以及窦状卵泡（>200 µm）16。还可根据卵泡的形态学特征进一步分类：原始卵泡具有一层扁平的颗粒细胞（GCs），初级卵泡具有一层立方形颗粒细胞，次级卵泡具有至少两层立方形颗粒细胞，而颗粒细胞之间出现空腔则标志着进入窦状卵泡阶段。在选定目标卵泡后，进行RNA提取。在进行实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）之前，需评估RNA的数量和质量（图1）。
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方案
该项目已获得比利时布鲁塞尔埃拉斯姆医院伦理委员会的批准。本研究方案中纳入的患者于2000年在开始化疗前接受了卵巢组织冷冻保存（OTC）以保留生育能力。该患者在冷冻保存期结束时签署书面知情同意书，同意将其剩余的冷冻组织捐赠用于科研。
1. 冷冻保存卵巢组织的解冻
- 准备一个6孔板，其中含有五种解冻溶液。第一孔包含5 mL冷冻保护剂溶液，由Leibovitz-15培养基、0.1 mol/L蔗糖、1.5 mol/L二甲基亚砜（DMSO）和1%人血清白蛋白（HSA）组成。接下来的孔中分别含有5 mL Leibovitz-15培养基，其中冷冻保护剂浓度依次降低：1 mol/L、0.5 mol/L和2 × 0 mol/L DMSO。
注意：冷冻保护剂溶液可能根据各生育诊所所采用的具体方案有所不同。 - 按照安全规范（佩戴防冻手套、防护眼镜和封闭式鞋具），从液氮中取出一支含有卵巢皮质组织片段的冻存管，并在室温下静置30秒。
- 在室温下将冻存管浸入双蒸水中轻轻振荡2分钟，随后在垂直层流罩下打开管盖，并立即将内容物转移至6孔板的第一孔（置于冰上）。
- 将组织片段依次转移至6孔板的每一孔中，每孔均含有5 mL Leibovitz-15培养基，且冷冻保护剂浓度逐级降低。每步均在冰上轻轻振荡组织5分钟。
2. 卵泡分离
注意：所有实验均使用无 RNase 材料并在垂直层流罩内进行。
- 将解冻的组织转移至一个装有10 mL解离培养基（Leibovitz-15培养基、丙酮酸钠[2 mmol/L]、L-谷氨酰胺[2 mmol/L]、人血清白蛋白[HSA, 0.3%]、青霉素G[30 µg/mL]和链霉素[50 µg/mL]）的2 mm网格化培养皿中。如有必要，使用解剖刀调整组织大小。
注意：根据临床操作规程，冷冻组织的尺寸可能在8 mm × 4 mm × 1 mm至4 mm × 2 mm × 1 mm之间变化。本实验方案中使用了两段4 mm × 2 mm × 1 mm的组织。 - 将组织切片器的三个部件叠放，将组织碎片置于两块夹具之间，用刀片沿夹具滑动将组织切为两半，获得两块厚度为0.5 mm的组织碎片。
- 使用组织切碎器将组织碎片进一步切碎。如有必要，可使用解剖刀手动切割剩余组织，直至组织完全破碎。
- 将破碎后的组织转移至一个装有7 mL消化培养基（培养基[McCoy's 5A培养基，3 mmol/L谷氨酰胺，0.1% HSA，30 µg/mL青霉素G，50 µg/mL链霉素，2.5 µg/mL转铁蛋白，4 ng/mL硒，50 µg/mL抗坏血酸]，补充0.2%胶原酶和0.02% DNase）的网格化培养皿中。
- 将培养皿放入含5% CO2、37 °C的培养箱中。每隔10分钟，将培养皿取出，用1 mL移液器反复吹打组织进行冲洗。
- 在消化培养基中孵育45分钟后，将培养皿置于体视显微镜（放大倍数5x–6.3x）下，使用微毛细移液管回收卵泡。选择目标卵泡，并用口吸移液管将其吸出进行分离。
注意：口吸移液操作应谨慎进行，以避免材料损失至管道中或造成污染。 - 若卵泡仍附着于皮质组织碎片中，使用两支27 G注射器针头通过机械方式分离：用针头尖端撕开皮质组织，使卵泡从基质中释放。
注意：避免用注射器针头直接接触卵泡，以防损伤。 - 使用微毛细移液管将卵泡转移至含有15 µL经校准的培养基液滴的4孔板中，每滴覆盖500 µL培养用油（每滴含1至10个卵泡）。此步骤可在收集过程中维持卵泡的活性。操作结束后，将卵泡在冰上用两滴各15 µL的磷酸盐缓冲液（PBS）各冲洗5秒，共两次，每次一滴，均覆盖500 µL培养用油。
- 使用口吸移液管在冰上将约20个卵泡连同极少量PBS（最多10 µL）收集至一个空离心管中，并将离心管保持在冰上。
注意：为保证RNA稳定性，步骤2.8和2.9必须在冰上操作。约20个卵泡（<75 µm）即可提供足够进行标准RT-qPCR（SYBR Green法）的RNA量。 - 在消化培养基中孵育最长不超过90分钟后，向培养皿中加入过量的冷（4 °C）阻断液（7.5 mL，含10%胎牛血清[FBS]的培养基），以终止酶反应。
注意：一旦观察到卵泡粘附于培养皿或出现形态不对称、颜色变深等损伤迹象，应立即加入阻断液。建议在最长2.5小时内完成卵泡分离操作，以避免卵泡损伤，并在分离后立即进行RNA提取。
3. RNA 提取
注意：RNA 提取按照 RNA 提取试剂盒提供的说明书进行操作，并调整洗脱体积。
- 在通风橱内，向含有卵泡的离心管中加入100 µL RNA提取试剂盒提供的裂解液，高速涡旋（2,500 rpm/min）以破坏卵泡结构。向管中加入50 µL乙醇（100%），短暂高速涡旋。
注意：由于裂解液含有2-巯基乙醇和硫氰酸，此步骤必须在通风橱内谨慎操作。 - 将管中全部液体（约160 µL）转移至由柱子和收集管组成的微滤柱组件中，在4 °C条件下以16,363 × g离心10秒。用试剂盒提供的180 µL洗涤液1清洗柱子，并在4 °C条件下以16,363 × g离心10秒。
- 向柱中加入试剂盒提供的180 µL洗涤液2/3，在4 °C条件下以16,363 × g离心10秒。重复此步骤一次。最后再离心1分钟以干燥滤膜，并在滤柱下方放置一个新的收集管。
- 分两步进行核酸洗脱：
- 首先，向滤膜上加入8 µL预热的洗脱液（75 °C），室温静置1分钟，然后在4 °C条件下以16,363 × g离心30秒。
- 用7 µL洗脱液重复此步骤。
注意：含有洗脱核酸的管子必须置于冰上。为避免DNA污染，强烈建议进行额外的DNA降解步骤——步骤3.5。
- 在37 °C条件下，用2 IU DNase和1× DNase缓冲液孵育管子20分钟。在室温下用1/10体积的DNase失活试剂处理2分钟以终止酶活性。
- 在4 °C条件下以16,363 × g离心1.5分钟。最后收集含有RNA的上清液，并转移至新管中。
- 使用分光光度计（NanoDrop 2000软件 > 核酸 > RNA）测定样品中RNA的含量。以1 µL洗脱液作为空白对照，用1 µL溶液测定从分离卵泡中提取的RNA量。
- 检查RNA纯度的260/280比值（约为2.0）。将样品储存在−80 °C，或直接进行逆转录以进行RT-qPCR。
注意：为评估RNA完整性，可在−80 °C冷冻前或后使用高分辨率自动电泳系统处理样品。本研究中，在逆转录后，RT-qPCR采用以下循环程序：
孵育阶段：50 °C保持20秒，95 °C保持10分钟
40 个PCR循环：95 °C变性15秒，60 °C退火延伸1分钟
熔解曲线阶段：95 °C 15秒，60 °C 1分钟，95 °C 30秒，60 °C 15秒
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结果
通过该分离步骤，实验人员可从基质环境中获取卵泡，以进行特定的基因表达分析。根据卵泡的大小和形态，可以区分卵泡发育的不同阶段。实验人员可使用适配的微毛细移液管，依据卵泡大小选择感兴趣的卵泡。使用最大内径为75 µm的微毛细管，可将原始卵泡和初级卵泡与次级卵泡、腔状卵泡及成熟卵泡区分开来。此外，实验人员还可根据卵泡形态确认其发育阶段。在研究卵泡激活时，应选择静息状态和初级卵泡，大约需要20个卵泡才能获得约5 ng/µL的RNA浓度。
同一患者的两个均质化卵巢碎片（4 mm × 2 mm × 1 mm）按照本方案进行处理以分离卵泡图2）。经过1.5小时的分离操作后，根据发育阶段获取了两组卵泡，用于比较RNA数量并突出卵泡选择的重要性：20个卵泡的 <75 µm （试管1）和15个卵泡的 <200 µm （2号管）。随后进行RNA提取，获得4.8 ng/μLµL 来自1号管的总RNA和10.5 ng/µL 使用分光光度计对2号管中的总RNA进行定量表1）。使用该微量分光光度计系统，同时...
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讨论
卵巢组织冷冻保存是保留癌症患者生育能力的一种有前景的方法。在临床实践中，患者缓解后将解冻的皮质组织重新移植回体内，从而恢复卵巢功能和生育能力19,20除了临床应用外，剩余的卵巢组织碎片在储存期结束后还可捐赠用于研究，以探讨调控卵泡发生机制的相关问题。此外，当移植不可行时，此类组织在开发替代移植方法方面尤为有用，例如 体外 培养系统或人工卵巢。然而，患者间及患者自身的差异限制了实验的可行性、可重复性以及结果的解读。事实上，卵泡密度随年龄增长而显著下降，且卵泡在组织碎片间的分布并不均匀。21由于可用的组织样本数量有限，需采用前沿技术来利用人体组织。多种技术如免疫组织化学和免疫荧光，以及 原位 杂交可在固定组织上进行，以评估蛋白质和基因的定位3,18为了研究卵巢功能单位在不同发育阶段调控卵泡发生的分子机制，需要分离卵泡。
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
本工作由科学卓越基金（EOS）资助（项目编号：30443682）。I.D. 是比利时国家科学基金会（FNRS）的副研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2 mm 带网格的培养皿 | Corning | 430196 | |
| 2100 生物分析仪 | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert 软件 | Agilent | 版本 B.02.08.SI648 | |
| 4 孔板 | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6 孔板 | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent 总 RNA 6000 pico 试剂盒 | Agilent | 5067-1513 | |
| 抗坏血酸 | Sigma Aldrich | A4403 | |
| 微毛细移液管用吸管组件 | Sigma Aldrich | A5177 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5424R | |
| 胶原酶 IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript 逆转录酶 | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + 碳酸氢盐 + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain 组织切片机 | Stoelting | 51350 | |
| 微毛细管 RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| 微毛细管 RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c 操作软件 | ThermoFisher | 版本 1.6 | |
| NanoDrop 分光光度计 | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| 青霉素 G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR Green 主混合液 | ThermoFisher | A46109 | |
| 引物：GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| 引物：HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| 引物：Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| 实时定量 PCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro 总 RNA 提取试剂盒 | ThermoFisher | AM1931 | |
| 硒 | Sigma Aldrich | S9133 | |
| 丙酮酸钠 | Sigma Aldrich | S8636 | |
| 体视显微镜 | Nikon | SMZ800 | |
| 硫酸链霉素 | Sigma Aldrich | S1277 | |
| 蔗糖 | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II 水套式 CO2 培养箱 | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs 组织切片器 | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| 转铁蛋白 | Roche | 10652202001 |
参考文献
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重印与许可
