本文介绍了一种从冻融后的卵巢皮质组织中分离人卵巢卵泡以进行基因表达分析的实验方案。
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摘要
摘要
卵巢是一种由多种细胞类型组成的异质性器官。为了研究卵泡发生过程中的分子机制，可在固定组织上进行蛋白质定位和基因表达分析。然而，要准确评估人卵泡中的基因表达水平，必须分离出这一复杂而精细的结构。因此，已参照Woodruff实验室先前描述的方法建立了一种改良方案，用于将卵泡（包括卵母细胞和颗粒细胞）从其周围环境中分离出来。首先通过手工处理卵巢皮质组织，利用组织切片器和组织切碎器两种工具将其切割成小片段。随后使用0.2%胶原酶和0.02% DNase进行酶消化，时间不少于40分钟。消化过程在37 °C、5% CO2条件下进行，并每隔10分钟用移液器对培养基进行机械吹打。孵育结束后，在显微镜放大条件下，使用校准的微毛细移液管手工收集分离的卵泡。若组织碎片中仍有残留卵泡，则需进一步通过手工显微解剖完成分离。收集的卵泡置于冰上保存于培养基中，并用磷酸盐缓冲液液滴清洗两次。该消化过程必须严格控制，以避免卵泡结构受损。一旦观察到卵泡结构出现破坏，或消化时间达到最长90分钟，应立即加入含10%胎牛血清的4 °C阻断液终止反应。为确保后续进行实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）时获得足量的总RNA，至少需收集20个分离的卵泡（直径小于75 µm）。提取后，20个卵泡的总RNA浓度平均可达5 ng/µL。随后将总RNA逆转录为cDNA，并利用RT-qPCR进一步分析目的基因的表达水平。
引言
卵巢是一个复杂的器官，由功能性和结构性单位组成，包括皮质内的卵泡和间质组织。卵泡发生是指卵泡从原始静止状态被激活、生长并成熟为能够受精并支持早期胚胎发育的成熟卵泡的过程，这一过程在科研领域被广泛研究1。揭示驱动这一现象的机制可能有助于改善女性的生育治疗2。对固定的人体组织进行分析，可评估卵巢功能单位内蛋白质表达和基因定位情况3,4。然而，需要特定的技术将卵泡从周围皮质中分离出来，以准确评估卵巢卵泡内的基因表达水平。因此，在先前的研究中，已开发出一种卵泡分离技术，以便直接从卵巢功能单位中进行基因表达分析5。目前已发展出多种方法，如酶消化法和/或机械分离法，以及激光捕获显微切割技术，可在组织切片中实现卵泡的分离6,7,8,9。卵泡分离技术被广泛应用于人或动物的卵巢组织，以评估各个发育阶段卵泡的基因表达谱10,11
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方案
该项目已获得比利时布鲁塞尔埃拉斯姆医院伦理委员会的批准。本研究方案中纳入的患者于2000年在开始化疗前接受了卵巢组织冷冻保存（OTC）以保留生育能力。该患者在冷冻保存期结束时签署书面知情同意书，同意将其剩余的冷冻组织捐赠用于科研。
1. 冷冻保存卵巢组织的解冻
- 准备一个6孔板，其中含有五种解冻溶液。第一孔包含5 mL冷冻保护剂溶液，由Leibovitz-15培养基、0.1 mol/L蔗糖、1.5 mol/L二甲基亚砜（DMSO）和1%人血清白蛋白（HSA）组成。接下来的孔中分别含有5 mL Leibovitz-15培养基，其中冷冻保护剂浓度依次降低：1 mol/L、0.5 mol/L和2 × 0 mol/L DMSO。
注意：冷冻保护剂溶液可能根据各生育诊所所采用的具体方案有所不同。 - 按照安全规范（佩戴防冻手套、防护眼镜和封闭式鞋具），从液氮中取出一支含有卵巢皮质组织片段的冻存管，并在室温下静置30秒。
- 在室温下将冻存管浸入双蒸水中轻轻振荡2分钟，随后在垂直层流罩下打开管盖，并立即将内容物转移至6孔板的第一孔（置于冰上）。
- 将组织片段依次转移至6孔板的每一孔中，每孔均含有5 mL Leibovitz-15培养基，且冷冻保护剂浓度逐级降低。每步均在冰上轻轻振荡组织5分钟。
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结果
通过该分离步骤，实验人员可从基质环境中获取卵泡，以进行特定的基因表达分析。根据卵泡的大小和形态，可以区分卵泡发育的不同阶段。实验人员可使用适配的微毛细移液管，依据卵泡大小选择感兴趣的卵泡。使用最大内径为75 µm的微毛细管，可将原始卵泡和初级卵泡与次级卵泡、腔状卵泡及成熟卵泡区分开来。此外，实验人员还可根据卵泡形态确认其发育阶段。在研究卵泡激活时，应选择静息状态和初级卵泡，大约需要20个卵泡才能获得约5 ng/µL的RNA浓度。
同一患者的两个均质化卵巢碎片（4 mm × 2 mm × 1 mm）按照本方案进行处理以分离卵泡图2）。经过1.5小时的分离操作后，根据发育阶段获取了两组卵泡，用于比较RNA数量并突出卵泡选择的重要性：20个卵泡的 <75 µm （试管1）和15个卵泡的 <200 µm （2号管）。随后进行RNA提取，获得4.8 ng/μLµL 来自1号管的总RNA和10.5 ng/µL 使用分光光度计对2号管中的总RNA进行定量表1）。使用该微量分光光度计系统，同时.......
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讨论
卵巢组织冷冻保存是保留癌症患者生育能力的一种有前景的方法。在临床实践中，患者缓解后将解冻的皮质组织重新移植回体内，从而恢复卵巢功能和生育能力19,20除了临床应用外，剩余的卵巢组织碎片在储存期结束后还可捐赠用于研究，以探讨调控卵泡发生机制的相关问题。此外，当移植不可行时，此类组织在开发替代移植方法方面尤为有用，例如 体外 培养系统或人工卵巢。然而，患者间及患者自身的差异限制了实验的可行性、可重复性以及结果的解读。事实上，卵泡密度随年龄增长而显著下降，且卵泡在组织碎片间的分布并不均匀。21由于可用的组织样本数量有限，需采用前沿技术来利用人体组织。多种技术如免疫组织化学和免疫荧光，以及 原位 杂交可在固定组织上进行，以评估蛋白质和基因的定位3,18为了研究卵巢功能单位在不同发育阶段调控卵泡发生的分子机制，需要分离卵泡。
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
本工作由科学卓越基金（EOS）资助（项目编号：30443682）。I.D. 是比利时国家科学基金会（FNRS）的副研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2 mm 带网格的培养皿 | Corning | 430196 | |
| 2100 生物分析仪 | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert 软件 | Agilent | 版本 B.02.08.SI648 | |
| 4 孔板 | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6 孔板 | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent 总 RNA 6000 pico 试剂盒 | Agilent | 5067-1513 | |
| 抗坏血酸 | Sigma Aldrich | A4403 | |
| 微毛细移液管用吸管组件 | Sigma Aldrich | A5177 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5424R | |
| 胶原酶 IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript 逆转录酶 | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + 碳酸氢盐 + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain 组织切片机 | Stoelting | 51350 | |
| 微毛细管 RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| 微毛细管 RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c 操作软件 | ThermoFisher | 版本 1.6 | |
| NanoDrop 分光光度计 | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| 青霉素 G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR Green 主混合液 | ThermoFisher | A46109 | |
| 引物：GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| 引物：HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| 引物：Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| 实时定量 PCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro 总 RNA 提取试剂盒 | ThermoFisher | AM1931 | |
| 硒 | Sigma Aldrich | S9133 | |
| 丙酮酸钠 | Sigma Aldrich | S8636 | |
| 体视显微镜 | Nikon | SMZ800 | |
| 硫酸链霉素 | Sigma Aldrich | S1277 | |
| 蔗糖 | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II 水套式 CO2 培养箱 | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs 组织切片器 | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| 转铁蛋白 | Roche | 10652202001 |
参考文献
- Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
- Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z.
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