测试 体外 和 在体 内 微流控混合法制备mRNA-脂质纳米颗粒的效率

摘要

此处介绍了一种制备包封编码萤火虫荧光素酶mRNA的脂质纳米颗粒（LNPs）的方案。这些LNPs已用于检测其效能 体外 在 HepG2 细胞中 体内 在 C57BL/6 小鼠中。

摘要

脂质纳米颗粒（LNPs）因莫德纳（Moderna）和辉瑞/拜恩泰科（Pfizer/BioNTech）成功开发新型冠状病毒mRNA疫苗而受到广泛关注。这些疫苗证实了mRNA-LNP疗法的有效性，并为未来的临床应用开辟了道路。在mRNA-LNP系统中，LNPs作为递送平台，可保护mRNA载荷免受核酸酶降解，并介导其进入细胞内。LNPs通常由四种组分构成：一种可电离脂质、一种磷脂、胆固醇以及一种脂质锚定的聚乙二醇（PEG）共轭物（脂质-PEG）。本文中，通过微流控混合技术将含有LNP脂质组分的有机相与含有编码萤火虫荧光素酶mRNA的水相混合，制备包封该mRNA的LNPs，随后对这些mRNA-LNPs进行测试 体外 通过基于生物发光的平板检测法评估其在HepG2细胞中的转染效率。此外，对mRNA-LNP进行评估 体内 在C57BL/6小鼠中经静脉注射后 通过 侧尾静脉。使用活体生物发光成像系统进行全身生物发光成像 体内 成像系统。展示了mRNA-LNP的特性、其在HepG2细胞中的转染效率以及C57BL/6小鼠中的总发光通量的代表性结果。

引言

脂质纳米颗粒（LNPs）近年来在非病毒基因治疗领域展现出巨大前景。2018年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了首个RNA干扰（RNAi）治疗药物Onpattro（由Alnylam公司研发），用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性^1,2,3,4这是脂质纳米颗粒和RNA疗法领域的一个重要进步。最近，Moderna以及Pfizer/BioNTech获得了美国食品药品监督管理局（FDA）对其针对SARS-CoV-2的mRNA-LNP疫苗的批准。^4,5在每种基于LNP的核酸疗法中，LNP均用于保护其载荷免受核酸酶降解，并促进高效的细胞内递送^6,7尽管脂质纳米颗粒（LNPs）已在RNA干扰疗法和疫苗应用中取得成功，mRNA-LNPs 也被探索用于蛋白质替代疗法。⁸ 以及用于共递送 Cas9 mRNA 和向导 RNA，以递送 CRISPR-Cas9 基因编辑系统⁹然而，并没有一种特定的配方适用于所有应用，脂质纳米颗粒（LNP）配方参数的细微变化都可能显著影响其效力和体内分布 体内^8,10,11因此，必须针对每种基于LNP的疗法分别开发和评估个体化的mRNA-LNPs，以确定其最佳制剂配方。

脂质纳米颗粒（LNPs）通常由四种脂质组分构成：一种可电离脂质、一种磷脂、胆固醇以及一种脂质锚定的聚乙二醇（PEG）缀合物（脂质-PEG）^11,12,13。LNPs 实现高效的细胞内递送在一定程度上依赖于其中的可电离脂质组分¹²。该组分在生理 pH 条件下呈中性，但在内体的酸性环境中会带正电荷¹¹。这种离子电荷的变化被认为对内体逃逸起着关键作用^12,14,15。除可电离脂质外，磷脂（辅助脂质）组分有助于提高载荷的包封效率并促进内体逃逸，胆固醇可提供稳定性并增强膜融合能力，而脂质-PEG 则可减少 LNP 在循环过程中的聚集和调理作用^10,11,14,16。在制备 LNP 时，这些脂质组分被溶于有机相（通常为乙醇）中，并与含有核酸载荷的水相混合。LNP 的制备过程具有高度灵活性，允许不同组分之间进行简便替换，并以不同的摩尔比例组合，从而制备出多种具有不同理化性质的 LNP 制剂 ^10,17。然而，在探索如此多样的 LNP 类型时，至关重要的是采用标准化的流程对每一种制剂进行评估，以准确测量其在表征参数和性能方面的差异。

本文概述了mRNA-LNP制剂的完整工作流程，及其在细胞和动物中性能评估的方法。

方案

注意：配制 mRNA-LNP 时，务必保持无 RNase 环境，使用针对 RNase 和 DNA 的表面去污剂擦拭台面和设备。仅使用无 RNase 的枪头和试剂。

所有动物实验均按照宾夕法尼亚大学《实验动物护理与使用指南》以及经宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。

1. 处方前准备

1. 用一个洁净的 4 L 烧杯装入 200–300 mL 新鲜的 10x 磷酸盐缓冲液（PBS）。
   1. 用超纯水将烧杯中的 10x PBS 稀释 10 倍，得到 1x PBS 溶液。确保 1x PBS 的最终体积在 2–3 L 之间。
   2. 将适用于 LNP 配方的适当容量的透析夹（20 kDa 分子量截留值 [MWCO]）放入装满液体的烧杯中进行水合。
      注意：透析夹在使用前至少需要 2 分钟的水合时间。
   3. 将搅拌子放入烧杯中，并用铝箔覆盖烧杯。
   4. 将覆盖好的烧杯置于磁力搅拌器上。打开搅拌器，调节转速至 300–400 rpm。
2. 用超纯水将 100 mM 柠檬酸缓冲液原液（pH 3）稀释 10 倍，制备用于 mRNA 稀释的 10 mM 柠檬酸缓冲液。
3. 通过将每种脂质溶解于 100% 乙醇中，制备 C12-200 可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和脂质锚定 PEG（脂质-PEG）的储备溶液。各脂质组分的浓度详见 表 1。
   1. 在 37 °C 下加热并混合储备溶液，以确保其完全溶解。

2. 脂质和核酸混合物的制备

1. 根据所需的摩尔比以及可电离脂质与 mRNA 的质量比（表 1），计算所需离子型脂质、辅助脂质、胆固醇和脂质-PEG 的体积。配制时，有机相的总体积需额外准备 10%，以补偿注射器中的死体积。
   1. 将计算好的各种脂质组分体积加入一个锥形管中。
   2. 用 100% 乙醇将脂质稀释至最终体积 V，该体积占 LNP 最终体积的 25%。
2. 根据可电离脂质与 mRNA 的质量比以及所需 mRNA-LNP 的总体积，计算配方所需的 mRNA 量（表 1）。
   1. 将编码萤光素酶的 mRNA 在冰上解冻。
   2. 将 mRNA 用 10 mM 柠檬酸缓冲液稀释至最终体积 3V，即有机相体积的三倍。
      ​注意：每一体积的脂质溶液 V 必须含有足量的可电离脂质，以包载稀释在 3V 体积中的 mRNA，此比例对应于目标的可电离脂质与 mRNA 质量比。

3. mRNA-LNP 的微流控制剂

1. 使用一种可去除RNase和DNA的表面去污剂喷洒无绒布，彻底擦拭微流控仪器的内部。
   1. 打开一个新的微流控芯片，将其插入时使进样通道朝下并远离操作者。
   2. 确保锥形管支架上装有两个15 mL离心管，并位于最右侧的位置。
   3. 在支架上放置两个无菌的15 mL离心管，管盖取下。
2. 用含有溶于10 mM柠檬酸缓冲液中的mRNA溶液填充一个5 mL注射器。
   1. 用含有溶于纯100%乙醇中的脂质溶液填充一个3 mL注射器。
   2. 将微流控装置上的芯片支架向上翻起。
   3. 将不含针头的5 mL mRNA注射器插入芯片的左侧进样口。
   4. 将不含针头的3 mL脂质注射器插入芯片的右侧进样口。
   5. 将芯片支架翻回原位，并关闭微流控仪器的盖子。
3. 通过仪器背面的开关打开微流控仪器。
   1. 选择 快速运行。
   2. 为已插入的5 mL和3 mL注射器选择正确的注射器类型。
   3. 按照 表2 中所述，输入mRNA-LNP制剂的参数，水相与有机相流速比为3:1。
   4. 按下 下一步 按钮进入下一个界面。
   5. 确认已正确输入参数。
   6. 按下 开始 按钮以制备mRNA-LNP。

4. mRNA-LNP 制剂的后续处理与表征

1. 将收集在右侧锥形管中的 mRNA-LNP 加载到先前已水化的透析盒中。
   注意：加载 mRNA-LNP 时，切勿刺破或损坏透析盒的膜。若膜受损，加载时将导致 mRNA-LNP 损失。
   1. 将含有 mRNA-LNP 的透析盒放回盛有 1× PBS 的烧杯中，透析至少 2 小时。
   2. 透析完成后，将含有 mRNA-LNP 的透析盒转移至无菌生物安全柜中，使用带针头的注射器取出 mRNA-LNP。
   3. 使用 0.22 µm 注射式滤器对 mRNA-LNP 进行无菌过滤，并收集至无菌锥形管中。
   4. 取 65 µL mRNA-LNP 溶液置于 1.5 mL 微量离心管中，用于表征分析。
2. 在比色皿中，将 10 µL mRNA-LNP 用 990 µL 1× PBS 稀释 100 倍，用于通过动态光散射法测定其流体动力学粒径和多分散指数。
3. 使用荧光检测法（如 RiboGreen 法）评估 mRNA-LNP 的浓度和包封效率。
   1. 通过将 20× TE 缓冲液用分子生物学用水稀释，配制 1× TE 缓冲液的储备液。
   2. 通过将 Triton X-100 用 1× TE 缓冲液稀释，配制 1% Triton X-100 缓冲液的储备液。
   3. 将荧光试剂储备液用 1× TE 缓冲液按 1:200 比例稀释，配制荧光工作液。
   4. 在黑色侧壁、黑色底板的 96 孔板中，将 mRNA-LNP 用 1× TE 缓冲液和 1% Triton X-100 缓冲液按 1:100 比例稀释，每孔体积为 100 µL。
   5. 根据试剂盒说明书稀释 RNA 标准品，制备低浓度范围标准曲线，并将标准品点样至 96 孔板中。
   6. 向每孔含稀释后 mRNA-LNP 或稀释后标准品的孔中加入 100 µL 稀释后的荧光工作液。
   7. 将 96 孔板放入酶标仪中，振荡 1 分钟，随后静置 4 分钟。
   8. 根据试剂盒说明书，在激发波长/发射波长 480 nm/520 nm 条件下测定各孔的荧光强度。
4. 利用标准曲线将荧光值转换为浓度。
   1. 根据公式 4.4，通过从 1% Triton X-100 缓冲液稀释 LNP 所得值（总 mRNA）中减去 TE 缓冲液稀释 LNP 所得值（未包封 mRNA），再除以 1% Triton X-100 缓冲液稀释 LNP 所得值，计算包封效率。
   2. 通过从 1% Triton X-100 缓冲液稀释 LNP 所得值（总 mRNA）中减去 TE 缓冲液稀释 LNP 所得值（未包封 mRNA），计算用于细胞和动物实验的 mRNA-LNP 浓度。
5. 通过 6-(对甲苯氨基)-2-萘磺酰氯（TNS）检测法测定 mRNA-LNP 的 pK_a。
   1. 将 TNS 溶于超纯水中，配制 0.16 mM 的 TNS 试剂溶液。
      注意：使用该试剂时，务必将其置于冰上并避光保存，以防降解。
   2. 配制含 150 mM 氯化钠、20 mM 磷酸钠、25 mM 柠檬酸铵和 20 mM 醋酸铵的缓冲溶液，并调节 pH 值至 2 至 12 范围内，以 0.5 为间隔梯度设置。
   3. 在黑色侧壁、黑色底板的 96 孔板中，向每种 pH 值调节后的缓冲溶液中加入 2.5 µL LNP。
   4. 向每孔加入 TNS 试剂，使最终 TNS 浓度为 6 µM。
   5. 将 96 孔板置于避光环境中孵育 5 分钟。
   6. 使用荧光酶标仪在激发波长/发射波长 322 nm/431 nm 条件下测定荧光强度。
   7. 将数据拟合为 S 形曲线，并利用拟合方程计算荧光强度达到最大值 50% 时对应的 pH 值，即为 pK_a。
6. mRNA-LNP 的流体动力学粒径、PDI、包封效率和 pK_a 的代表性结果见表 3。

5. 体外 HepG2细胞转染

注意：可使用其他多种细胞系（如 HeLa 细胞或 HEK-293T 细胞）评估脂质纳米颗粒（LNP）的转染效率 体外所有细胞在进行LNP转染研究前均应检测支原体呈阴性。

1. 在96孔白色壁透明底板的每个孔中加入100 µL完全培养基（DMEM，添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素），接种5,000个HepG2细胞。
   1. 将细胞置于37 °C、5% CO₂的恒温CO₂培养箱中过夜，使其贴壁。
2. 用完全培养基稀释mRNA-LNP，使总剂量在100 µL体积中加入。
   1. 吸去各孔中的完全培养基。
   2. 向细胞中加入经完全培养基稀释至所需剂量的mRNA-LNP，或仅加入完全培养基（对照组）。
   3. 将含有处理后细胞的96孔板重新放回恒温CO₂培养箱中，继续培养24小时。
3. 通过荧光素酶检测评估转染效率。
   1. 根据制造商说明书配制荧光素酶检测试剂和1×细胞裂解缓冲液。
   2. 从培养箱中取出含细胞的96孔板，转移至生物安全柜中。
   3. 吸去96孔板中每个孔的细胞培养基。
   4. 向每孔加入20 µL 1×裂解缓冲液，随后加入100 µL预先配制的荧光素酶检测试剂。
   5. 避光孵育，然后将板放入酶标仪中检测每孔的生物发光信号。
      ​注：使用先前配制的C12-200 mRNA-LNP处理HepG2细胞的代表性结果见图1。

6. 尾静脉注射后在小鼠体内对 mRNA-LNP 进行 体内 评价

1. 用无菌的1×PBS稀释mRNA-LNP溶液，使100 µL尾静脉注射体积中含有2 µg总mRNA，相当于体重剂量约为0.1 mg/kg（以20 g小鼠计）。
2. 使用经批准的方法固定每只小鼠，并用浸有70%酒精的棉垫擦拭尾部。
   1. 用一支29 G胰岛素注射器吸取100 µL mRNA-LNP（2 µg）或100 µL 1×PBS。排除注射器中的气泡。
   2. 将针头斜面向上插入小鼠尾侧静脉，缓慢注射 100 µL mRNA-LNP 或 1x PBS。
   3. 移除针头并按压至止血。
3. 注射后6小时，在无菌1×PBS中配制15 mg/mL的D-荧光素钾盐储备液。
   1. 打开 体内 成像系统（IVIS）并打开成像软件。
   2. 按压 初始化 为数据采集准备仪器。
   3. 勾选发光成像选项，并将曝光时间设为自动。确保根据成像小鼠的数量选择正确的视野范围。
   4. 向经预处理的小鼠腹腔注射 200 µL D-荧光素钠（荧光素剂量为每千克体重 150 mg）。
   5. 将小鼠放入麻醉舱，设置异氟烷浓度为2.5%，氧气流速为2.0 L/min。
   6. 等待10分钟，待荧光素酶信号稳定后，对mRNA-LNP处理的小鼠进行成像。
   7. 确保小鼠已完全麻醉，并调整麻醉管路以给予异氟烷 通过 成像室内的鼻锥
   8. 将小鼠转移至鼻罩，确保其仰卧且腹部暴露。
   9. 关闭培养箱门，然后单击 获取 单击软件中的按钮以获取生物发光图像。
      注：以下展示了经 mRNA-LNP 或 1X PBS 处理后小鼠全身成像的代表性结果 图2.

结果

使用微流控仪器制备了mRNA-LNPs，其平均流体动力学直径为76.16 nm，多分散指数为0.098。通过TNS测定法测得mRNA-LNPs的pK_a为5.75¹⁸。采用改进的荧光测定法并结合公式4.4，计算得出这些mRNA-LNPs的包封效率为92.3%。用于细胞处理和动物给药的总体RNA浓度为40.24 ng/µL。该数值来源于改进的荧光测定法¹⁹，具体是通过将LNPs用1% Triton X-100和1×TE缓冲液稀释至特定浓度后测得的荧光值，进而换算出所包封mRNA的含量而获得。

公式 4.4

讨论

通过该工作流程，可制备并测试多种mRNA-LNP，以评估其 体外 和 体内 效率。通过更换和组合不同的可电离脂质与辅料，并以不同的摩尔比以及不同的可电离脂质与mRNA质量比进行配制，可制备出具有不同理化特性的mRNA-LNP。²²在此，我们以35/16/46.5/2.5（可电离脂质：辅助脂质：胆固醇：脂质-PEG）的摩尔比配制了C12-200 mRNA-LNP，可电离脂质与mRNA的质量比为10:1。这些LNPs被用于转染效率的检测。 体外 在 HepG2 细胞中 体内 在C57BL/6小鼠中。C12-200 mRNA-LNP通过商用微流控仪器采用微流控混合法合成。尽管可使用其他配方方法制备LNP，例如移液混合法或T型接头混合法。⁴微流控混合制备的mRNA-LNP通常尺寸更小、多分散性更低，且包封效率更高^4,13,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1 M 盐酸	Sigma	7647-01-0
0.22 μm 注射器滤器	Genesee	25-243
1 mL BD 滑动接头注射器	BD	309659
1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]（铵盐）（C14-PEG2000）	Avanti Polar Lipids	880150P
1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）	Avanti Polar Lipids	850725P
1.5 mL Eppendorf 管	Fisher Scientific	05-408-129
15 mL 圆底离心管	Fisher Scientific	14-959-70C
200 proof 乙醇	Decon Labs	2716
23G 针头	Fisher Scientific	14-826-6C
3 mL BD 一次性带鲁尔锁扣接头的注射器	Fisher Scientific	14-823-435
3 mL 透析盒	Thermo Scientific	A52976
96 孔黑色侧壁黑色底板	Fisher Scientific	07-000-135
96 孔白色/透明底板，组织培养表面	Thermo Scientific	165306
乙酸铵，1 千克	Research Products International	631-61-8
二碱式柠檬酸铵	SIgma	3012-65-5
BD 鲁尔锁扣注射器，无菌，一次性使用，5 mL	BD	309646
C12-200 可电离脂质	Cayman Chemical	36699
C57BL/6 小鼠	Jackson Laboratory	000664
胆固醇	Sigma	57-88-5
CleanCap FLuc mRNA（5moU）	TriLink Biotechnologies	L-7202
一次性比色皿	Fisher Scientific	14955129
D-荧光素钾盐	Thermo Scientific	L2916
DMEM，高糖	Thermofisher Scientific	11965-084
Exel 胰岛素注射器 - 0.5 mL	Fisher Scientific	1484132
胎牛血清	Corning	35-010-CV
Hep G2 [HEPG2]	ATCC	HB-8065
HyPure 分子生物学级水	Cytiva	SH30538.03
Infinite 200 PRO 酶标仪	Tecan	N/A
IVIS Spectrum 活体成像系统	Perkin Elmer	N/A
大号 Kimwipes 擦镜纸	Fisher Scientific	06-666-11D
荧光素酶检测试剂盒	Promega	E4550
NanoAssemblr Ignite 羧化盒 - 经典型 - 100 个装	Precision Nanosystems	NIN0065
NanoAssemblr Ignite 仪器	Precision Nanosystems	NIN0001
PBS - 磷酸盐缓冲液（10x），pH 7.4，无 RNase	Thermo Scientific	AM9624
青霉素-链霉素	Thermofisher Scientific	15140122
QB 柠檬酸盐缓冲液（100 mM 柠檬酸盐），pH 3.0	Teknova	Q2442
Quant-it RiboGreen RNA 定量检测试剂盒	Thermo Scientific	R11490
报告基因裂解 5x 缓冲液	Promega	E3971
RNase Away 表面去污剂	Thermofisher Scientific	7000TS1
氯化钠	Sigma	7647-14-5
氢氧化钠	Sigma	1310-73-2
磷酸钠	Sigma	7601-54-9
TNS 试剂（6-(对-甲苯氨基)-2-萘磺酸钠盐）	Sigma	T9792
吐温 X-100	Sigma	9036-19-5
Zetasizer	Malvern Panalytical	NanoZS