测试 体外 和 在体 内 微流控混合法制备mRNA-脂质纳米颗粒的效率

摘要

此处介绍了一种制备包封编码萤火虫荧光素酶mRNA的脂质纳米颗粒（LNPs）的方案。这些LNPs已用于检测其效能 体外 在 HepG2 细胞中 体内 在 C57BL/6 小鼠中。

摘要

脂质纳米颗粒（LNPs）因莫德纳（Moderna）和辉瑞/拜恩泰科（Pfizer/BioNTech）成功开发新型冠状病毒mRNA疫苗而受到广泛关注。这些疫苗证实了mRNA-LNP疗法的有效性，并为未来的临床应用开辟了道路。在mRNA-LNP系统中，LNPs作为递送平台，可保护mRNA载荷免受核酸酶降解，并介导其进入细胞内。LNPs通常由四种组分构成：一种可电离脂质、一种磷脂、胆固醇以及一种脂质锚定的聚乙二醇（PEG）共轭物（脂质-PEG）。本文中，通过微流控混合技术将含有LNP脂质组分的有机相与含有编码萤火虫荧光素酶mRNA的水相混合，制备包封该mRNA的LNPs，随后对这些mRNA-LNPs进行测试 体外 通过基于生物发光的平板检测法评估其在HepG2细胞中的转染效率。此外，对mRNA-LNP进行评估 体内 在C57BL/6小鼠中经静脉注射后 通过 侧尾静脉。使用活体生物发光成像系统进行全身生物发光成像 体内 成像系统。展示了mRNA-LNP的特性、其在HepG2细胞中的转染效率以及C57BL/6小鼠中的总发光通量的代表性结果。

引言

脂质纳米颗粒（LNPs）近年来在非病毒基因治疗领域展现出巨大前景。2018年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了首个RNA干扰（RNAi）治疗药物Onpattro（由Alnylam公司研发），用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性^1,2,3,4这是脂质纳米颗粒和RNA疗法领域的一个重要进步。最近，Moderna以及Pfizer/BioNTech获得了美国食品药品监督管理局（FDA）对其针对SARS-CoV-2的mRNA-LNP疫苗的批准。^4,5在每种基于LNP的核酸疗法中，LNP均用于保护其载荷免受核酸酶降解，并促进高效的细胞内递送^6,7尽管脂质纳米颗粒（LNPs）已在RNA干扰疗法和疫苗应用中取得成功，mRNA-LNPs 也被探索用于蛋白质替代疗法。⁸ 以及用于共递送 Cas9 mRNA 和向导 RNA，以递送 CRISPR-Cas9 基因编辑系统⁹

方案

注意：配制 mRNA-LNP 时，务必保持无 RNase 环境，使用针对 RNase 和 DNA 的表面去污剂擦拭台面和设备。仅使用无 RNase 的枪头和试剂。

所有动物实验均按照宾夕法尼亚大学《实验动物护理与使用指南》以及经宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。

1. 处方前准备

1. 用一个洁净的 4 L 烧杯装入 200–300 mL 新鲜的 10x 磷酸盐缓冲液（PBS）。
   1. 用超纯水将烧杯中的 10x PBS 稀释 10 倍，得到 1x PBS 溶液。确保 1x PBS 的最终体积在 2–3 L 之间。
   2. 将适用于 LNP 配方的适当容量的透析夹（20 kDa 分子量截留值 [MWCO]）放入装满液体的烧杯中进行水合。
      注意：透析夹在使用前至少需要 2 分钟的水合时间。
   3. 将搅拌子放入烧杯中，并用铝箔覆盖烧杯。
   4. 将覆盖好的烧杯置于磁力搅拌器上。打开搅拌器，调节转速至 300–400 rpm。
2. 用超纯水将 100 mM 柠檬酸缓冲液原液（pH 3）稀释 10 倍，制备用于 mRNA 稀释的 10 mM 柠檬酸缓冲液。
3. 通过将每种脂质溶解于 100% 乙醇中，制备 C....

结果

使用微流控仪器制备了mRNA-LNPs，其平均流体动力学直径为76.16 nm，多分散指数为0.098。通过TNS测定法测得mRNA-LNPs的pK_a为5.75¹⁸。采用改进的荧光测定法并结合公式4.4，计算得出这些mRNA-LNPs的包封效率为92.3%。用于细胞处理和动物给药的总体RNA浓度为40.24 ng/µL。该数值来源于改进的荧光测定法¹⁹，具体是通过将LNPs用1% Triton X-100和1×TE缓冲液稀释至特定浓度后测得的荧光值，进而换算出所包封mRNA的含量而获得。

公式 4.4

讨论

通过该工作流程，可制备并测试多种mRNA-LNP，以评估其 体外 和 体内 效率。通过更换和组合不同的可电离脂质与辅料，并以不同的摩尔比以及不同的可电离脂质与mRNA质量比进行配制，可制备出具有不同理化特性的mRNA-LNP。²²在此，我们以35/16/46.5/2.5（可电离脂质：辅助脂质：胆固醇：脂质-PEG）的摩尔比配制了C12-200 mRNA-LNP，可电离脂质与mRNA的质量比为10:1。这些LNPs被用于转染效率的检测。 体外 在 HepG2 细胞中 体内 在C57BL/6小鼠中。C12-200 mRNA-LNP通过商用微流控仪器采用微流控混合法合成。尽管可使用其他配方方法制备LNP，例如移液混合法或T型接头混合法。⁴微流控混合制备的mRNA-LNP通常尺寸更小、多分散性更低，且包封效率更高^4,13,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1 M 盐酸	Sigma	7647-01-0
0.22 μm 注射器滤器	Genesee	25-243
1 mL BD 滑动接头注射器	BD	309659
1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]（铵盐）（C14-PEG2000）	Avanti Polar Lipids	880150P
1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）	Avanti Polar Lipids	850725P
1.5 mL Eppendorf 管	Fisher Scientific	05-408-129
15 mL 圆底离心管	Fisher Scientific	14-959-70C
200 proof 乙醇	Decon Labs	2716
23G 针头	Fisher Scientific	14-826-6C
3 mL BD 一次性带鲁尔锁扣接头的注射器	Fisher Scientific	14-823-435
3 mL 透析盒	Thermo Scientific	A52976
96 孔黑色侧壁黑色底板	Fisher Scientific	07-000-135
96 孔白色/透明底板，组织培养表面	Thermo Scientific	165306
乙酸铵，1 千克	Research Products International	631-61-8
二碱式柠檬酸铵	SIgma	3012-65-5
BD 鲁尔锁扣注射器，无菌，一次性使用，5 mL	BD	309646
C12-200 可电离脂质	Cayman Chemical	36699
C57BL/6 小鼠	Jackson Laboratory	000664
胆固醇	Sigma	57-88-5
CleanCap FLuc mRNA（5moU）	TriLink Biotechnologies	L-7202
一次性比色皿	Fisher Scientific	14955129
D-荧光素钾盐	Thermo Scientific	L2916
DMEM，高糖	Thermofisher Scientific	11965-084
Exel 胰岛素注射器 - 0.5 mL	Fisher Scientific	1484132
胎牛血清	Corning	35-010-CV
Hep G2 [HEPG2]	ATCC	HB-8065
HyPure 分子生物学级水	Cytiva	SH30538.03
Infinite 200 PRO 酶标仪	Tecan	N/A
IVIS Spectrum 活体成像系统	Perkin Elmer	N/A
大号 Kimwipes 擦镜纸	Fisher Scientific	06-666-11D
荧光素酶检测试剂盒	Promega	E4550
NanoAssemblr Ignite 羧化盒 - 经典型 - 100 个装	Precision Nanosystems	NIN0065
NanoAssemblr Ignite 仪器	Precision Nanosystems	NIN0001
PBS - 磷酸盐缓冲液（10x），pH 7.4，无 RNase	Thermo Scientific	AM9624
青霉素-链霉素	Thermofisher Scientific	15140122
QB 柠檬酸盐缓冲液（100 mM 柠檬酸盐），pH 3.0	Teknova	Q2442
Quant-it RiboGreen RNA 定量检测试剂盒	Thermo Scientific	R11490
报告基因裂解 5x 缓冲液	Promega	E3971
RNase Away 表面去污剂	Thermofisher Scientific	7000TS1
氯化钠	Sigma	7647-14-5
氢氧化钠	Sigma	1310-73-2
磷酸钠	Sigma	7601-54-9
TNS 试剂（6-(对-甲苯氨基)-2-萘磺酸钠盐）	Sigma	T9792
吐温 X-100	Sigma	9036-19-5
Zetasizer	Malvern Panalytical	NanoZS