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从先导化合物鉴定到验证的小分子筛选策略

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10.3791/64811

2023年1月20日

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摘要

文章讨论:

Festa, F., Labaer, J. 自组装人蛋白质微阵列中的激酶抑制剂筛选。可视化实验杂志。152, e59886 (2019)。

Stockman, B. J. et al. 基于 NMR 的活性测定,用于测定核苷核糖水解酶的化合物抑制、IC50 值、人为活性和全细胞活性。可视化实验杂志。148, e59928 (2019).

Gao, S. et al.一种通过秀丽隐杆线虫的自动表型分析来预测化学毒性的高通量测定法。可视化实验杂志。 145, e59082 (2019 年)。

Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. 使用高内涵成像量化贴壁细胞中的靶标结合。可视化实验杂志。141, e58670 (2018)。

乔巴,JS,加尔文,AM,肖卡特,KM一种高通量荧光素酶测定法,用于评估单周转蛋白酶 PCSK9 的蛋白水解。可视化实验杂志。138, e58265 (2018)。

Sullivan, C. et al. 使用人甲型流感病毒感染的斑马鱼模型筛选抗病毒药物并表征宿主免疫细胞反应。可视化实验杂志。119, e55235 (2017)。

Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. 通过抗体阵列询问信号转导通路来评估对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性。可视化实验杂志。139, e57779 (2018)。

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A.NADH 偶联 ATP 酶测定的半高通量改编,用于筛选小分子抑制剂。可视化实验杂志。150, e60017 (2019).

Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. 通过 REPLACE 开发蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂:应用于设计和开发非 ATP 竞争性 CDK 抑制剂。可视化实验杂志。104, e52441 (2015)。

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. 通过筛选化学抑制剂文库鉴定 T 细胞受体信号传导的介质。可视化实验杂志。143, e58946 (2019)。

Takakusagi, Y. 基于生物传感器的高通量生物淘选和生物信息学分析策略,用于药物-蛋白质相互作用的全球验证。可视化实验杂志。166, e61873 (2020)。

Riching, KM, Mahan, SD, Urh, M., Daniels, DL 使用 HiBiT CRISPR 细胞系对靶向蛋白质降解化合物进行高通量细胞分析。可视化实验杂志。165, e61787 (2020)。

社论

基因组学革命带来了关于遗传扰动与不同疾病表型之间关联的大量知识1。这导致了许多蛋白质作为潜在药物靶点的注释,并激发了人们对发现和开发抑制这些靶点的化合物的兴趣2。在此背景下,不同的筛选策略已成为命中化合物发现、靶点验证、测量结合亲和力、选择性、毒性和细胞内靶点参与以及化合物反应性、稳定性和药代动力学特性的重要方法。该系列捕捉了该领域的一些方法学进步,目的是展示可用于筛选和评估小分子生化和/或生物活性的多种策略。

蛋白激酶代表了一个拥有 500 多个成员的大酶家族。这些酶是所有细胞过程的关键调节剂,它们的功能障碍与许多疾病有关3.因此,它们一直是药物发现乃至方法开发的浓厚兴趣焦点。因此,本集中的四篇文章报告了该领域的进展。Festa等人描述了一种使用自组装核酸可编程蛋白阵列(NAPPA)4的激酶抑制剂发现筛选平台。这些阵列显示全长人激酶,并允许对大型激酶集合中的化合物进行多重筛选,因此不仅可以识别命中,还可以分析选择性。Tieman等人描述了一种基于磷酸抗体微阵列的方法,该方法用于筛选细胞范围内磷酸化状态的变化,作为激酶抑制剂活性的读数5。这可以深入了解对抑制产生耐药性的途径的性质,这是与了解药物反应和疗效相关的重要参数。Chen 等人描述了一种流式细胞术测定,用于筛选激酶抑制剂集合,以识别影响 T 细胞受体 (TCR) 信号传导的化合物6。这一策略导致了参与 TCR 信号传导的激酶的快速鉴定,表明它们作为免疫治疗药物开发靶点的潜力。最后,许多激酶的活性通过蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 进行调节,这表明靶向这些 PPI 的化合物可能令人感兴趣。Nandha Premnath等人描述了一种称为REPLACE(使用计算富集用部分配体替代品替换)的方法,该方法可用于通过将肽结合剂的特征转化为与相同结合表面的小分子来开发激酶的非ATP竞争性PPI7

除了激酶之外,许多其他酶在疾病中也发挥作用,并已在药物发现中得到研究。因此,针对激酶以外的酶优化的方法也令人感兴趣。例如,Stockman等人描述了基于核磁共振(NMR)波谱的活性测定,以发现和评估来自寄生虫阴道毛滴虫8的核苷核水解酶抑制剂。这些测定也可用于测定 IC50 值。为了筛选ATP酶抑制剂,Radnai等人开发了一种半高通量筛选方法,该方法使用涉及两种酶(丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶)的偶联酶测定形式,最终将ATP酶活性转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的内在荧光作为读数9。与迄今为止描述的所有过程酶和催化多步骤酶不同,前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9 型 (PCSK9) 是一种单周转蛋白酶,被其底物自身抑制。这使得筛选 PCSK9 抑制剂具有挑战性,Chorba 等人描述了一种基于细胞的高通量方法,该方法将 PCSK9 切割活性与分泌的荧光素酶活性联系起来作为读数,从而能够筛选抑制剂10

除了寻找抑制各种靶标活性的化合物外,确认该化合物在细胞中与其预期靶标结合的测定也引起了人们的高度关注。Axelsson等人描述了一种验证贴壁细胞靶点参与的策略,该策略基于结合免疫荧光抗体的高内涵成像和细胞热位移测定(CETSA)11。该测定对用大量化合物集合处理的细胞进行等温热挑战,以鉴定稳定化合物。Riching等人开发了一种可以评估降解剂分子的靶标结合和活性的方法,使用HiBiT / LgBiT标记技术产生发光蛋白并通过发光降低 监测降解参数12。最后,Takakusagi等人描述了一种验证蛋白质-药物相互作用的方法,该方法基于使用基于噬菌体的肽显示来筛选药物结合肽基序和小分子之间的结合13。多肽显示屏结合生物信息学分析,验证靶标结合。

小分子验证的另一层是表征它们在动物模型中的影响。该集合包括两种这样的方法,一种使用人类甲型流感病毒感染的斑马鱼(Danio rerio)模型来评估具有抗病毒活性的化合物的功效,以及宿主免疫反应14,另一种使用 秀丽隐杆线虫 作为分析化合物毒性的模型15。这两项研究都强调需要优化方法来评估 体内疗效和毒性。

总之,药物发现和开发是一个艰巨的过程,存在许多瓶颈、挑战和失败的可能性很高。此外,无论是在耐药病原体数量以惊人的速度增长的传染病领域,还是在慢性病和与人口老龄化相关的疾病患病率不断增加的领域,持续的疾病负担都需要我们集中关注和采取行动。该集合重点介绍了几种旨在加速药物发现、验证和表征的方法。展望未来,我们预计该领域将出现进一步的创新,特别是那些旨在提高筛选通量、增加化学文库多样性以及开发与高通量筛选 (HTS) 兼容的 体内 模型的创新。此外,在更快、更小的规模上提供效力、选择性、特异性、功效和毒性的整体视图的工作流程可能特别有利。

披露

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致谢

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参考文献

  1. Vincent, F., et al. Phenotypic drug discovery: recent successes, lessons learned and new directions. Nature Reviews Drug Discovery. , (2022).
  2. Ha, J., Park, H., Park, J., Park, S. B. Recent advances in identifying protein targets in drug discovery. Cell Chemical Biology. 28, 394-423 (2021).
  3. Attwood, M. M., et al. Trends in kinase drug discovery: targets, indications and inhibitor design. Nature Reviews. Drug Discovery. 20, 839-861 (2021).
  4. Festa, F., Labaer, J. Kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays. Journal of Visualized Experiments. (152), e59886(2019).
  5. Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. Assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays. Journal of Visualized Experiments. (139), e57779(2018).
  6. Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of mediators of T-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries. Journal of Visualized Experiments. (143), e58946(2019).
  7. Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Development of inhibitors of protein-protein interactions through REPLACE: Application to the design and development non-ATP competitive CDK inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (104), e52441(2015).
  8. Stockman, B. J., et al. NMR-Based activity assays for determining compound inhibition, IC50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases. Journal of Visualized Experiments. (148), e59928(2019).
  9. Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A semi-high-throughput adaptation of the NADH-coupled ATPase assay for screening small molecule inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (150), e60017(2019).
  10. Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. A high-throughput luciferase assay to evaluate proteolysis of the single-turnover protease PCSK9. Journal of Visualized Experiments. (138), e58265(2018).
  11. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (141), e58670(2018).
  12. Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. High-Throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using HiBiT CRISPR cell lines. Journal of Visualized Experiments. (165), e61787(2020).
  13. Takakusagi, Y. Biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions. Journal of Visualized Experiments. (166), e61873(2020).
  14. Sullivan, C., et al. Using zebrafish models of human influenza A virus infections to screen antiviral drugs and characterize host immune cell responses. Journal of Visualized Experiments. (119), e55235(2017).
  15. Gao, S., et al. A high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by Automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (145), e59082(2019).

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