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方法文章

IS200/IS605家族相关TnpB对转座子活性影响的实时定量分析

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DOI：

10.3791/64825

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2023年1月20日

 ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, University of California, 2Microbiology Program, University of California, 3Biophysics Program, University of California

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文概述了一种用于进行活细胞实时成像的实验方案，以定量分析辅助蛋白TnpB对单个活体大肠杆菌（Escherichia coli）细胞中转座动态的影响。

摘要

本文概述了一种利用与转座过程偶联的荧光报告系统，在活体细菌细胞中对转座元件活性进行活细胞实时成像的实验方案。具体而言，该方法展示了如何利用实时成像技术评估辅助蛋白TnpB对转座元件IS608（属于IS200/IS605家族）活性的影响。IS200/IS605家族转座元件是一类广泛存在的可移动遗传元件，与自然界中数量最为庞大的基因之一tnpB密切相关。序列同源性分析表明，TnpB蛋白可能是CRISPR/Cas9系统的进化前体。此外，TnpB近期重新受到关注，已被证实可作为一种类似Cas蛋白的RNA引导型DNA内切酶。本文定量分析了TnpB对IS608转座频率的影响，并证明与不表达TnpB的细胞相比，表达IS608来源TnpB的细胞中转座子活性提高了约5倍。

引言

转座元件（TEs）是一类能够在宿主基因组内通过切除或催化复制后重新整合的方式进行移动的遗传元件。TEs 存在于所有生命领域中，其转座过程会重构宿主基因组，导致编码区和调控区发生突变1。这会产生突变和多样性，在进化2,3、发育4,5以及多种人类疾病6（包括癌症7）中发挥重要作用。

通过使用将转座活性特征与荧光报告系统偶联的新型遗传构建体，我们先前的研究描述了一种基于细菌转座子IS608的实验系统，该转座子属于广泛存在的IS200/IS605转座子家族，可实现对单个活细胞中转座事件的实时可视化8（图1）。该转座子系统如图1A所示。该转座子包含转座酶编码序列tnpA，其两侧为左端（LE）和右端（RE）的不完全回文重复序列（IPs），这些序列是TnpA识别和切割的位点。tnpA的表达由启动子PLTetO1驱动，该启动子可被tet阻遏蛋白抑制，并可通过无水四环素（aTc）诱导表达9。该转座子插入在一个组成型PlacIQ1启动子10的-10和-35序列之间，从而中断了蓝色报告蛋白mCerulean311的表达。如图1C所示，当诱导tnpA表达后，转座子可被切除，从而恢复启动子的完整性，使细胞表达mCerulean3并发出蓝色荧光。TnpA的N端与黄色报告蛋白Venus12融合，因此可通过黄色荧光强度来检测TnpA的表达水平。

IS608 以及其他属于 IS200/IS605 转座子家族的成员通常还编码第二个功能迄今未知的基因 tnpB13。TnpB 蛋白是一类在多种细菌和古菌转座元件（TEs）中广泛存在但表征尚不充分的核酸酶家族14,15，这些转座元件常常仅包含 tnpB16。此外，最近的研究发现 TnpB 可作为类似 CRISPR/Cas 的可编程 RNA 引导内切核酸酶，在多种条件下引发双链 DNA（dsDNA）或单链 DNA（ssDNA）断裂，从而重新引起人们对 TnpB 的关注17,18。然而，TnpB 在调控转座过程中可能发挥的作用仍不明确。为了实时观察 TnpB 对 IS608 转座的影响，研究人员构建了一种转座子版本，其中包含 TnpB 的编码区，并在其N端融合了红色荧光蛋白 mCherry。

通过与Kuhlman实验室进行的更详细的群体水平研究19相互补充，本文展示了如何利用转座子活性的实时成像，定量揭示TnpB或其他任何辅助蛋白对转座动态的影响。通过将TnpB与mCherry融合，单个转座事件由蓝色荧光标识，并可与TnpA（黄色荧光）和TnpB（红色荧光）的表达水平进行关联分析。

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方案

1. 细菌培养物的制备

  1. 在含有适当抗生素（25 µg/mL 卡那霉素，参见材料表）的 LB 培养基中，于 37 °C 过夜培养携带质粒转座子构建体的大肠杆菌（E. coli）菌株 MG1655（此前在 Kim 等人8中已有描述）。
    注意：所用构建体及其相关序列已在 GenBank20 中注册，登录号分别为 OP581959、OP581957、OP581958、OP717084 和 OP717085。
  2. 为获得稳态对数生长期的菌体，将菌液以至少 100 倍稀释度接种至 M63 培养基（含 100 mM KH2PO4、1 mM MgSO4、1.8 µM FeSO4、15 mM (NH4)2SO4、0.5 µg/mL 硫胺素 [维生素 B1]），并添加碳源（本实验使用 0.5% w/v 葡萄糖）及适当的抗生素（参见材料表）。
  3. 于 37 °C 培养菌液，直至 600 nm 处的光密度（OD600）达到约 0.2。此时菌液即可用于后续实验。

2. 载玻片制备

  1. 通过将M63培养基与0.5% w/v葡萄糖和1.5% w/v琼脂糖在微波炉中加热至沸腾，使琼脂糖完全融化并充分混匀，制备载玻片用凝胶。
  2. 待混合物冷却至约55 °C后，加入抗生素和诱导剂（25 µg/mL卡那霉素和10 ng/µL无水四环素[aTc]，参见材料表）。
  3. 将一块显微镜载玻片放置在工作台上。在第一块载玻片上垂直叠加另外两块载玻片，并在顶部平行放置第四块载玻片，确保底部与顶部载玻片之间留有一个载玻片厚度的间隙。缓慢将约1 mL M63琼脂糖混合液加入此间隙中，形成一个小的凝胶方块。
  4. 待凝胶完全凝固（约10–15分钟）后，轻轻移开顶部的载玻片，并用剃刀或刀片修整琼脂糖垫。然后加入2.5 µL菌液（步骤1.3），并在其上放置盖玻片。
  5. 用环氧树脂密封载玻片与盖玻片之间的缝隙（参见材料表）。将样品在37 °C下静置至少1小时，使环氧树脂干燥并让细胞沉降附着于琼脂糖垫上。

3. 延时荧光显微镜观察

  1. 将制备好的样品（步骤 1.3）置于荧光显微镜（参见材料表）上，并在 37 °C 恒温环境中进行观察。
    1. 根据用于图像采集的相机设置合适的曝光时间。调节照明强度以最小化光漂白。
      注意：本研究中每个波长的曝光时间为 2 秒。
    2. 针对每个波长，选择一个荧光信号最弱的视野（FOV）。采集用于后续分析中背景扣除的图像。
  2. 建立一个在不同波长下以规则时间间隔进行网格化图像采集的方案。
    1. 将延时摄影程序编入采集方案中。将采集频率设为所需的时间间隔（本实验为 20 分钟），总延时持续时间设为所需长度（24 小时）。
    2. 根据所使用的荧光蛋白构建体，在方案中设定相应的波长。
      注意：mCherry 的激发峰为 587 nm，发射峰为 610 nm21；mVenus 的激发峰为 515 nm，发射峰为 527 nm12；mCerulean3 的激发峰为 433 nm，发射峰为 475 nm11。
    3. 设置网格大小，以覆盖所需的视野数量。
      ​注意：本示例数据使用了 8 × 8 个视野。

4. 图像分析

  1. 使用步骤 3.1.2 中获取的相应背景图像，对每个颜色通道进行背景减除。在所有分析步骤中，我们使用开源平台 Fiji22 中的标准模块（参见材料表）。
  2. 通过对 mCerulean 通道进行阈值分割，并将阈值区域除以平均细胞面积，来估算每个时间点的总细胞群体数量。
  3. 为了计数独立的切除事件，取 mCerulean3 通道的时间导数。可通过连续减去 mCerulean3 通道中的相邻图像来实现。切除事件将在时间导数图像中表现为荧光的短暂亮斑。
    1. 对切除事件的图像序列进行阈值分割，以消除不需要的荧光信号。注意，此过程可能会将切除事件本身的部分信号也去除。为解决此问题，需对图像进行膨胀处理，以恢复切除事件至其原始大小。
      注：也可对其他荧光通道采用类似的阈值分割和图像分析技术进行分析（例如，将切除事件与转座酶 TnpA [黄色 Venus 荧光] 和 TnpB [红色 mCherry 荧光] 的表达水平相关联）。

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结果

通过荧光显微镜对活细胞中的转座子活性进行可视化观察，尽管其通量低于群体荧光测量，但能够直接观察单个活细胞中的转座子活性。转座子切除事件导致mCerulean3的启动子恢复（图1），从而可通过明亮的蓝色荧光识别发生转座子活性的细胞（图2，TnpB+：补充视频1，TnpB-：补充视频2）。

研究发现，表达辅助蛋白 TnpB 的细胞（图 3，橙色）中转座子活性水平比不表达 TnpB 的细胞（图 3，蓝色）高出 4-5 倍，这与之前更为详细的群体水平研究结果一致19。这一现象尤为显著，因为引入 mCherry-tnpB 的编码序列使转座子长度增加了约 2,000 bp，而先前研究表明，IS608 转座子的...

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讨论

本文介绍的用于活细胞中转座元件活性实时成像的独特方法是一种灵敏的检测手段，可直接在活细胞中实时检测转座事件，并将该活性与辅助蛋白的表达相关联。尽管通量低于群体性方法所能达到的水平，但该方法能够对单个活细胞中的转座元件活性和蛋白表达进行详细测量。

可采用多种工具和技术在显微镜下直接培养细胞，以实现实时成像。本文所使用的方法是在琼脂糖垫上培养细胞，其优点是快速、经济且操作简便。一个可能的缺点是，取决于所关注的细胞生长状态，琼脂糖垫中支持细胞生长的资源有限，因此细胞在相对较短的时间内（12–24 小时）会自然耗尽这些资源并停止生长。因此，必须小心地将处于稳态生长的细胞以足够低的密度接种到琼脂糖垫上，以确保有充足的时间进行测量。微流控技术可用于长期维持细胞处于稳态指数生长期24，但这些方法需要额外的专业知识、设备和设置才能有效实施。

除了Kuhlman实验室更详细的研究工作19之外，本文进一步表明，与IS200/I...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究的经费支持来自加利福尼亚大学的启动资金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2 吨透明环氧树脂Devcon31345
琼脂糖Sigma-Aldrich5066
硫酸铵Sigma-AldrichAX1385-1
盐酸无水四环素Sigma-Aldrich37919
氩离子激光器Melles Griot35-IMA-840-015
蓝色滤光片组Chroma激发光：Z457/10X，发射光：ET485/30M
D(+)葡萄糖Sigma-AldrichG7021
Eclipse Ti-E 显微镜Nikon已停产
Eppendorf epTIPS 吸头盒及补充盒，体积：0.1 至 10 µL，长度：3.4 cm，1.33 in.，PP（聚丙烯）Eppendorf North America Biotools22491504
Eppendorf epTIPS 吸头盒及补充盒，体积：50 至 1000 µL，长度：7.1 cm，2.79 in.，PP（聚丙烯）Eppendorf North America Biotools22491555
硫酸亚铁 ACS 级，500 gFisher Scientific706834
FijiFiji（imagej.net）
Fisher BioReagents LB 肉汤，Miller 型（颗粒状）Fisher ScientificBP9723-2 
玻璃盖玻片Fisher Scientific12-542B 
硫酸卡那霉素Sigma-Aldrich1355006
硫酸镁，分析纯Fisher ScientificXXM63SP3KG
显微镜加热装置World Precision Instruments96810-1
磷酸二氢钾Fisher Scientific17001H
ProScan III 载物台Prior
红色滤光片组Chroma激发光：ET560/40X，发射光：ET645/75M
Sapphire 561 LP 激光器Coherent1170412
显微镜载玻片Fisher Scientific125535B
盐酸硫胺素Sigma-Aldrich (SIAL)T1270-100G
Ti-LU4 激光发射装置Nikon
黄色滤光片组Chroma激发光：Z514/10X，发射光：ET535/30M

参考文献

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