体内完整背根神经节初级感觉神经元网络中神经元集群的钙成像

摘要

本方案描述了背根神经节（DRG）的手术暴露过程，随后在对同侧后爪施加多种刺激的同时，利用Pirt-GCaMP3小鼠对神经元集合进行GCaMP3（基因编码的Ca²⁺指示剂；绿色荧光蛋白-钙调蛋白-M13蛋白3）Ca²⁺成像。

摘要

Ca²⁺成像可作为细胞活动的间接指标，包括动作电位以及涉及Ca²⁺进入细胞质或细胞内Ca²⁺储存库释放的各种信号机制。基于Pirt-GCaMP3的小鼠背根神经节（DRG）初级感觉神经元Ca²⁺成像具有同时测量大量细胞的优势。最多可监测1,800个神经元，从而能够在正常生理环境下以群体水平在体（in vivo）整体研究神经元网络和躯体感觉过程。所监测的大量神经元使得能够检测到使用其他方法难以发现的活动模式。可通过刺激小鼠后足，直接研究刺激对DRG神经元群体的影响。产生Ca²⁺瞬变的神经元数量以及Ca²⁺瞬变的幅度反映了对特定感觉模态的敏感性。神经元的直径可提供被激活纤维类型的信息（无害机械性刺激纤维 vs. 有害性疼痛纤维，Aβ、Aδ和C纤维）。表达特定受体的神经元可通过td-Tomato和特异性Cre重组酶与Pirt-GCaMP联合进行遗传标记。因此，DRG的Pirt-GCaMP3 Ca²⁺成像为在群体水平上以整体方式分析特定感觉模态和神经元亚型提供了强有力的工具和模型，可用于研究疼痛、瘙痒、触觉及其他躯体感觉信号。

引言

初级感觉神经元直接支配皮肤，并将躯体感觉信息传回中枢神经系统^1,2。背根神经节（DRG）是包含10,000至15,000个初级感觉神经元胞体的细胞簇^3,4。DRG神经元在大小、髓鞘化程度以及基因和受体表达模式方面表现出多样性。直径较小的神经元包括感知疼痛的神经元，而直径较大的神经元通常对非伤害性机械刺激产生反应^5,6。初级感觉神经元的病变，如损伤、慢性炎症和周围神经病变，可使这些神经元对各种刺激变得敏感，从而导致慢性疼痛、异常性疼痛和痛觉过敏^7,8。因此，研究DRG神经元对于理解躯体感觉机制以及多种疼痛和瘙痒相关疾病具有重要意义。

神经元放电 体内 对于躯体感觉至关重要，但直到最近，仍缺乏用于研究完整神经节的工具 体内 仅限于相对少量的细胞⁹在此，我们介绍一种在群体水平上研究神经元动作电位或神经元活动的强大方法 体内

方案

本文所述所有操作均依照圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心机构动物照护与使用委员会批准的方案进行。

注意：动物手术（步骤1）和成像（步骤2）一旦开始，必须连续完成。数据分析（步骤3）可稍后进行。

1. 手术及固定动物以进行右侧L5背根神经节成像

注意：本研究使用了8周龄或以上的Pirt-GCaMP3 C57BL/6J小鼠，无论雄性或雌性。尽管两种性别的小鼠均可获得同样良好的成像效果，但由于较年轻小鼠的Pirt表达较弱或呈间歇性，因此小鼠年龄应至少为8周。Pirt-GCaMP3 C57BL/6J小鼠由约翰斯·霍普金斯大学研制¹⁴。可对任一侧背根神经节（DRG）进行成像，其他腰段DRG（例如腰4节段）也可用于成像。所给出的时间为经验丰富的外科操作者所需时间的估计值。偶尔出现的技术问题（如出血增加）可能会延长操作所需时间。

1. 配制含有40 mg/mL氯胺酮和6 mg/mL赛拉嗪的无菌生理盐水溶液。总体积应至少为 9 µL/g 手术和成像后安乐死时的体重。
   警告：氯胺酮若被注射、吞食或接触眼睛，可能造成伤害。请小心操作。
2. 确保所有外科手术器械均已 通过高压灭菌或其他经《美国国立卫生研究院实验动物照护与使用指南》批准的方法....

结果

图4Pirt-GCaMP3 小鼠 L5 背根神经节的代表性图像 (A,D) 显示了 Pirt-GCaMP3 小鼠 L5 背根神经节的单帧高分辨率扫描图像。 (B，E). 无刺激条件下，分别来自图A和图D的Pirt-GCaMP3 L5背根神经节15帧图像的平均强度投影。部分神经元表现出自发性Ca²⁺ 瞬变信号用黄色箭头标出。C) Pirt-GCaMP3视网膜神经节细胞在100 g后爪按压刺激期间，刺激前两帧及刺激过程中全部五帧的平均强度投影（来自A图）。某些神经元在刺激期间产生了Ca²⁺ 刺激期间的瞬时反应用黄色箭头标出.......

讨论

持续性疼痛存在于多种疾病中，影响约8%的人群，导致功能丧失和/或生活质量下降²⁹。初级感觉神经元可检测皮肤上的有害刺激，其可塑性参与了持续性疼痛的发生⁸。虽然神经元可以在细胞培养和组织外植体中进行研究，但这些方法使其脱离了正常的生理环境。通过手术暴露背根神经节（DRG），结合Pirt-GCaMP3的Ca²⁺成像技术，可在对后爪施加刺激的情况下，在正常生理环境中研究初级感觉神经元。该Ca²⁺成像方法的主要优势在于能够同时监测大量神经元。该方法可在群体水平上分析感觉模式、神经元直径以及偶联激活等罕见现象^{10,11,12,13,14,}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
阿法沙龙注射液（赛拉嗪）	Covetrus, Akorn	33197
C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC	卡尔蔡司	422642-9900-000
棉签	麦克森	24-106-1S
弯止血钳	精细科学工具	13007-12
直流温度控制器	FHC	40-90-8D
直流温度控制器加热垫	FHC	40-90-2-05
杜蒙陶瓷涂层镊子	精细科学工具	11252-50
FHC 直流温度控制器	FHC	40-90-8D
氟瑞索（异氟烷）	MWI 动物健康，皮拉美尔集团	501017
弗里德曼-皮尔逊咬骨钳	精细科学工具	16221-14
明胶海绵（GelFoam）	辉瑞	09-0353-01
凯他捷（氯胺酮）	硕腾	KET-00002R2
发光绿色载物台胶带	JSITON/亚马逊	B803YW8ZWL
Matrx VIP 3000 异氟烷蒸发器	Midmark	91305430
显微解剖剪刀	罗博兹	RS-5882
显微解剖弹簧剪刀	精细科学工具	15023-10
显微解剖弹簧剪刀	罗博兹	RS-5677
迷你直肠热敏电阻探头	FHC	40-90-5D-02
手术剪刀	罗博兹	RS-6812
Pirt-GCaMP3 C57BL/6J 小鼠	约翰斯·霍普金斯大学	N/A	两种性别的小鼠均可同等良好地进行成像。由于较年轻小鼠中 Pirt 启动子表达较弱或间歇性，因此小鼠年龄应至少为 8 周。
SMALGO 小动物痛觉测量仪	Bioseb 体内研究仪器公司	BIO-SMALGO
立体定位仪	Kopf 型号 923-B	923-B
td-Tomato C57BL/6J 小鼠	杰克逊实验室	7909
顶板，6 英寸 × 10 英寸	纽波特	290-TP
TrpV1-Cre C57BL/6J 小鼠	杰克逊实验室	17769
蔡司 LSM 800 共聚焦显微镜	卡尔蔡司	LSM800
蔡司 Zen 2.6 蓝色版软件	卡尔蔡司	Zen (Blue Edition) 2.6