本研究详细描述了建立类似慢性兔肩袖（RC）损伤的操作步骤。具体而言，该损伤在肩胛下肌（SSC）肌腱/肌腱结合部（myotendinous unit）处造成，以模拟人类肩袖的解剖结构和病理生理特征，包括严重的肌肉脂肪变性（FD）。本方案可用于研究肩袖损伤并评估再生治疗方法。
本文内容
摘要
摘要
兔肩袖（RC）的病理生理学变化可导致其相关肌肉和肌腱发生进行性且高度退行性的改变，这些改变对临床相关参数产生负面影响，例如肌肉-肌腱/肌腱连接单元的肌力和回缩程度，最终导致肩关节功能丧失，并对肩袖修复效果产生不利影响。能够模拟人类肩袖解剖结构和病理生理特征的动物模型，对于深入理解损伤进展的机制，以及开发基于组织工程和再生医学的有效治疗手段至关重要。
在此背景下，兔肩胛下肌（SSC）模型较为合适，原因如下：（i）其解剖结构与人体最常受损的冈上肌（SSP）骨-肌腱-肌肉单元相似；（ii）在纤维化及肌肉脂肪变性（FD）方面，其病理生理过程与人类具有相似性；（iii）该模型适用于开展外科手术操作。因此，本研究旨在描述诱导SSC肩袖（RC）损伤的手术技术。简而言之，该操作包括通过识别喙肱肌来分离肩胛下肌，随后在肌腱连接处进行全层横断，并使用硅胶材质的彭罗斯引流管包裹肌腱断端，以防止自发性再附着。术后4周采用苏木精-伊红（H&E）染色和马松三色染色进行组织学评估，以监测肌肉脂肪变性的进展情况。
在切断肩胛上肌肌腱连接处4周后，肌肉萎缩和脂肪变性（FD）已明显出现，这与人类肩袖（RC）的病理生理状况相似。本方案展示了成功建立慢性样兔肩胛上肌RC损伤模型的步骤，该模型可作为研究与RC病理生理相关的骨骼肌变化的有力工具，并有助于开发针对慢性样RC撕裂的新型治疗策略。
引言
慢性肩袖（RC）撕裂的特征是肌肉和肌腱发生退行性改变，包括肌肉萎缩、脂肪组织积聚以及纤维化，这些变化可能影响肩袖修复的效果，并最终导致肩部疼痛和功能障碍1,2,3,4,5。为了更好地理解肩袖撕裂的发病机制并改善手术效果，建立能够模拟人类肩袖解剖结构和病理生理特征的合适动物模型至关重要。具体而言，肩袖损伤模型应满足以下标准：（i）损伤后无自发愈合；（ii）存在明显的纤维化、肌肉萎缩和脂肪组织积聚；（iii）损伤范围足够大，以便应用与人类相似的外科技术进行修复6。
在此背景下，兔肩胛下肌（SSC）可作为研究肩袖病理生理学的准确且可靠的动物模型，这得益于其独特的解剖结构、病理生理反应及生物力学特性7。事实上，兔SSC肩袖的解剖结构与人类冈上肌（SSP）肩袖相似，而SSP肌腱单元正是最常因过度使用导致损伤的部位8,9。具体而言，兔SSC肌腱复合体穿过一个骨性通道，并位于喙肱肌下方，这种情况类似于人类SSP肌腱复合体穿过肩峰下骨性通道并位于喙肩韧带下方的结构7。这种解剖学上的相似性使得兔SSC在运动过程中经历与人类SSP相似的肌肉骨骼运动，即在肱骨抬高和外展时，肌腱在肩峰下移动7,10。
此外，在兔肩袖撕裂后观察到的病理组织学改变与人类肩袖撕裂相似11。具体而言，肌肉腹发生严重的脂肪变性（FD），表现为肌肉质量显著丧失、肌纤维横截面积减小以及脂肪浸润增加。此外，Otarodifard 等人评估了兔肩袖在（1）单排、（2）双排以及（3）经骨等效修复技术后的生物力学特性，发现这些修复方式的初始生物力学特性与在尸体标本上实施的人类冈上肌肩袖修复结果相似12。因此，兔肩袖在解剖学、生理学和生物力学方面与人类冈上肌具有高度相似性，适用于建立肩袖损伤的动物模型。
尽管已有多种动物物种 （包括大鼠、小鼠、犬和绵羊）被用于肩袖疾病及其修复的研究6,13,14,15，但损伤的慢性程度是一个关键考量因素。这是因为肩袖撕裂可能无症状，常在撕裂扩大并转为慢性后才被诊断，此时肌腱和肌肉均已出现严重退变16,17,18。然而，大多数肩袖修复模型采用的是急性损伤模型，即对健康肌腱进行切断后立即修复19,20,21,22。这主要是出于操作便利性和技术简便性的考虑，导致极少有研究在类似慢性的条件下探讨肩袖的病理生理过程。此外，一些动物模型可能存在某些特性，限制了其在慢性肩袖研究中的应用。
例如，尽管大鼠已被广泛用于模拟肩袖撕裂及其干预措施，但其损伤后缺乏明显的脂肪积聚，这与人类情况存在差异，且其体型较小，使得重复手术操作具有挑战性23。此外，尽管 Gerber 等人利用绵羊的冈下肌研究慢性肩袖撕裂后的肌肉萎缩和脂肪浸润24，但绵羊冈下肌与人类肩袖肩胛上肌（SSP）在解剖结构上存在一定差异，同时饲养和研究这种大型动物模型还面临诸多后勤挑战。另外，Gerber 等人通过松解冈下肌肌腱的浅层部分，建立了一种绵羊延迟性肩袖损伤模型，以模拟慢性肩袖撕裂的特征，并在术后4至6周评估不同肌腱修复技术的效果。然而，这种类似慢性的绵羊模型存在局限性，即在第二次手术过程中，被松解的肌腱末端已无法与瘢痕组织区分25。
Coleman 等人还通过在初次手术时用合成膜覆盖横断的肌腱末端，建立了绵羊的慢性肩袖撕裂模型，该方法允许营养物质扩散，并有效减少损伤组织周围的瘢痕组织形成，同时改善了肌腱与瘢痕组织之间的区分度26。与此同时，Turner 等人提出，延迟修复应在4周内进行，因为在大规模肌腱回缩的情况下，直接重新附着极为罕见27。这些研究共同推动了可重复且可靠的实验方案的发展，成功建立了类似慢性的兔肩袖肌腱复合体（SSC RC）损伤模型。
在本方案中，建立了一种类似慢性的兔桡侧腕长伸肌损伤模型，周期为4周，可用于研究与纤维化及FD介导的肌肉萎缩相关的病理变化 通过 组织学评估。特别是，在初次手术时使用硅胶材质的Penrose引流管包裹肌腱结合部的游离端，可在二次手术过程中清晰识别肩袖组织，从而便于进行可靠的修复，以研究使用或不使用支架增强条件下的肩袖愈合情况。总体而言，一种类似慢性的兔肩袖撕裂模型能更好地模拟肩袖疾病的病理生理过程，且技术与操作要求较低。
方案
所有操作均须在经适当配备、专用于动物手术的房间内，按照机构动物实验伦理委员会批准的方案，采用无菌外科技术进行。本研究中的兔手术操作均遵循香港中文大学动物实验伦理委员会批准的方案进行。
1. 手术操作
- 为准备手术区域，预先加热保温垫，并在其上覆盖无菌手术单，以维持兔子的体温。随后，摆放已灭菌的手术器械和用品（具体见下文所述） 材料表）并根据外科医生的偏好进行整理。
- 诱导麻醉 通过 对中国新西兰白兔（体重3.5至4.5 kg，年龄约5-6.5个月；本研究使用两只雄性与一只雌性兔子）进行肌内注射，剂量为35 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg赛拉嗪。随后通过足垫和/或尾部夹捏试验确认麻醉效果。
- 如需维持手术麻醉水平，可追加给予10 mg/kg氯胺酮和3 mg/kg赛拉嗪 通过耳缘静脉静脉注射28 并以5-10分钟为间隔定期监测动物的呼吸频率。
- 为制备手术窗口，剃除预定切口部位（位于头夹肌-肌腱单位浅层的皮肤区域），并用聚维酮碘和70%酒精交替擦拭三次进行消毒。使用棉签以环形方式（由内向外）涂抹聚维酮碘和70%酒精。使用眼药膏保持兔眼湿润和润滑。肌肉注射20 mg/kg头孢氨苄作为抗感染药物。
- 在锁骨下方做3-4 cm的皮肤切口，使用手术刀片11号切开三角肌胸大肌间隙 手术刀，并牵开以暴露肩部（图1A，B).
- 为了定位肩胛下肌肌腱单位，首先辨认喙肱肌（作为覆盖肩胛下肌腱附着点的组织）并将其分开。随后，辨认肩胛下肌腱，并插入直角钳以充分暴露止于肱骨小结节处的整个肩胛下肌腱图1C).
- 在造成损伤之前，分离SSC肌肉-肌腱图1D）并在截断部位附近局部注射术中麻醉剂（0.2 mg/kg 的 0.5% 布比卡因）。用硅胶基彭罗斯导管包裹 SSC 肌腱单元 (图1E以防止与周围组织发生不期望的粘连，并有助于后续组织的取出。
- 为诱导损伤，使用手术刀11号在肌腱连接处进行全层横断。 手术刀（图1F必要时，用纱布按压止血，并根据需要使用生理盐水冲洗伤口。
- 使用4-0聚乙醇酸（PGA）缝线缝合三角肌组织以关闭切口图1G）以及4-0尼龙缝线缝合皮肤伤口（图1H).
- 通过皮下注射0.03 mg/kg的布托啡诺作为镇痛剂，提供术后护理（术后立即注射一次，随后48小时内每日两次）29).
- 将兔子置于带覆盖物的加热垫上使其恢复，并佩戴软质颈圈以防止出现自残、舔舐手术部位和撕扯缝线等不良行为（图1I).
- 监测动物的体重和行为变化。若动物体重下降超过10%，或出现无法控制的严重疼痛（根据五种行为表现进行评估：眼眶收缩、面颊扁平、鼻孔形态改变、胡须位置改变以及耳朵形态和位置改变），应及时报告兽医，以确定是否需要干预措施，例如提前实施安乐死。
2. 标本采集
- 在损伤后4周处死兔子。先将兔子麻醉，然后注射致死剂量的戊巴比妥钠（超过60 mg/kg）。通过开胸术确认死亡。
- 识别肱骨头，并在保留大结节和小结节以及所有软组织附着的前提下进行手术切除。在4 °C条件下用4%多聚甲醛（PFA）固定72小时，随后转移至10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中，在室温下脱钙1个月（每72小时更换一次溶液）。
- 脱钙完成后，对样本进行常规组织学处理，包括梯度乙醇脱水、石蜡包埋、组织切片（切片厚度为8 µm），并使用苏木精-伊红（H&E）和马松三色染色液进行染色30,31,32。
- 使用正置显微镜在10倍放大倍数下采集图像。
- 通过测量肌肉、纤维组织和脂肪在肌肉内的面积及所占百分比，对H&E和马松三色染色图像进行半定量分析，方法如前所述33,34，可选用任意图形设计软件。本示例中使用Adobe Photoshop软件（https://www.adobe.com）。
- 使用魔棒工具选择代表特定组织类型的特定颜色区域（红色为肌肉组织，蓝色为纤维化区域，白色代表脂肪）。
- 依次点击菜单项选择 | 反选 | 保存选区 | 命名该区域。
- 通过点击菜单项窗口 | 测量日志 | 记录测量值，统计标记区域内像素数量以记录这些像素值，并手动计算所选组织类型的百分比。
3. 统计分析
- 对于组织学数据，使用选定的分析软件进行统计分析。采用学生t检验对对照组与损伤组之间的两个独立样本进行比较。
- 数据以均值 ± 均值标准误表示。<0.05 的p值被认为具有统计学意义。
结果
为评估肩袖肌肉-肌腱单位横断后肩袖病变的慢性程度，对整体组织形态学特征和细胞变化进行了表征 通过 大体评估与组织学分析（H&E染色和Masson三色染色），于损伤后4周图2, 图3，和 图4）。代表性的大体组织形态学图像显示，在受损的SSC肌肉中出现了类似白色脂肪组织的结构，而对照组中则无此现象（图2）。H&E染色证实，与对照组相比，损伤的SSC肌肉中肌细胞的数量和组织结构丧失，并被大量脂肪细胞所取代（脂肪细胞表现为由薄层胞质包围的空泡状结构，胞质内含有受压的细胞核）。图3A).
与对照组（0.69% ± 0.18%）相比，H&E染色图像的半定量评估显示，损伤的肩袖肌肉（SSC）中存在大量肌内脂肪细胞（36.5% ± 8.5%）（图3B）。Masson三色染色也证实，与对照组相比，损伤的SSC肌肉出现肌肉萎缩以及胶原纤维排列紊乱（图4A）。对Masson三色染色图像的半定量评估显示，损伤的SSC肌肉细胞密度（41.3% ± 2.6%）较对照组（99.2% ± 0.16%）显著降低（图4B）。尽管进一步的半定量评估未显示损伤的SSC肌肉（22.3% ± 13.1%）与对照组（0.07% ± 0.05%）在纤维化组织形成方面存在显著差异，但在损伤的SSC肌肉中仍观察到明显的纤维化程度（图4C）。综上所述，大体组织形态学和组织学分析表明，损伤的兔肩袖肌腱表现出严重的肌肉萎缩、脂肪积聚和纤维化，这些均为慢性肩袖病变生理学的典型特征。
图1：模拟慢性 SSC 肌腱-肌肉损伤模型的手术操作流程。（A）建立手术视野，通过触诊识别肱骨、肱骨头和锁骨等解剖标志。（B）在锁骨下方做一条3.0 cm的皮肤切口。（C）切开喙肱肌以暴露肩胛下肌（SSC）。（D）分离肩胛下肌-肌腱单元。（E）使用硅胶材质的彭罗斯引流管包裹肩胛下肌-肌腱组织。（F）横断肩胛下肌-肌腱。（G）使用聚乙醇酸（PGA）缝线重新对合喙肱肌。（H）使用尼龙缝线关闭皮肤切口。（I）术后为兔子佩戴软质颈圈。缩写：SSC = subscapularis；PGA = poly glycolic acid。请点击此处查看该图的放大版本。
图2代表性SSC肌肉的大体形态学。 黑色 箭头表示白色脂肪组织。缩写：SSC = 肩胛下肌。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图3：类慢性肩袖损伤模型在术后4周的组织学分析。（A）代表性苏木精-伊红（H&E）染色组织学图像显示肌纤维萎缩及脂肪细胞积聚。（B）损伤肌肉脂肪积聚百分比的定量分析。n = 3只兔。误差条表示标准误（SEM）。*，具有统计学显著性（p ≤ 0.05）。比例尺 = 5,000 µm（A，左列），600 µm（A，右列）。缩写：SSC = subscapularis；RC = rotator cuff；H&E = hematoxylin and eosin。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：模拟慢性RC损伤模型在4周时的组织学分析。（A）Masson三色染色图像显示明显的纤维化。纤维性结缔组织呈蓝色。（B）肌肉组织比例的定量分析，以及（C）纤维化组织的比例定量。n = 3只兔子。误差条表示标准误（SEM）。*，具有统计学显著性（p ≤ 0.05）。比例尺 = 5,000 µm（A，左列），200 µm（A，右列）。缩写：SSC = 肩胛下肌；RC = 肩袖。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
可重复且具有生理相关性的动物模型有助于深入理解疾病发病机制、评估临床治疗效果，并改进和进一步发展外科治疗方法35。本研究建立了一种可靠且精确的兔肩袖撕裂（SSC）模型，该模型模拟了人类肩袖（RC）解剖结构和病理生理特征。肩袖撕裂与进行性且可能不可逆的肌肉退行性改变相关，导致愈合潜力下降。例如，Ko 等人研究表明，兔肩袖上肌（SSP）在撕裂6周后重新修复，在随后的6周内并未逆转肌肉萎缩或脂肪浸润（FD）。这种由脂肪浸润介导的肌肉萎缩会影响多个重要的临床参数，包括肌腱-肌肉强度和关节活动范围，从而可能影响手术疗效36,37。
本方案在横断SSC肌腱单位后表现出显著的慢性样特征。具体而言，这些变化包括肌肉质量明显减少，以及脂肪含量和纤维组织增加（图2, 图3，以及 图 4这些发现与人类肩袖撕裂中报道的退行性改变一致38近年来，由于大鼠与人类在解剖结构上具有高度相似性，且大鼠的肩袖肌腱（SSP）在肩峰下走行的路径与人类相似，因此大鼠已成为研究肩袖（RC）疾病与损伤最为广泛使用的动物模型之一。38,39,40然而，需要注意的是，大鼠的肩胛上横韧带（SSP）穿过肩峰弓的部分为肌性结构，而在人类中则为腱性结构。41最重要的是，Barton 等人发现大鼠 SSP 肌腱离断后并未出现明显的脂肪积聚23，这与人类的状况形成鲜明对比42因此，研究人员认为，兔SSC复合体可能为模拟人类慢性RC撕裂提供一个合适的模型。
为确保该模型的可重复性，在执行本方案时需注意两点。首先，在切断肌腱单位后，被切断的肌腱游离端可能容易形成粘连，从而给后续操作中的肌腱取回带来困难。为避免此问题，可在切断后使用不可吸收的硅胶管包裹肌腱-肌肉连接处的游离端，以防止其与周围组织自发粘连以及自发愈合（图1E）。此外，在后续干预手术（即进行牢固修复；数据未显示）时，通过在初次手术时对损伤组织末端进行包裹，可清晰识别被切断的肌腱-肌肉单位。该技术经济、有效，且易于在手术中实施43。第二，兔子是一种高度敏感的物种，术后可能出现有害行为。为避免此类问题，强烈建议使用软质颈圈，以防止自残、舔舐手术部位及撕扯缝线等不良行为（图1I）。与市售的刚性塑料E型颈圈相比，自制软质颈圈不会造成皮肤损伤或其他影响动物福利和科研质量的副作用。综上所述，这些步骤对于建立准确可重复的兔肩袖损伤模型至关重要，并为研究再生修复策略提供了可能。
为了在动物模型中研究肌腱的病理生理学及愈合过程，必须建立一种明确且可重复的损伤模型，并仔细选择研究的时间点。目前绝大多数关于肌腱损伤与修复的研究均采用完全切断动物肌腱的方法44，因为切断操作简便、可重复性高，且能较好地模拟临床情况45,46。Huegel 等人研究表明，部分切断肌腱所造成的损伤程度轻于完全切断，且制动会对肌腱力学性能产生不利影响，包括导致关节僵硬程度增加47。为了评估在巨大肩袖撕裂情况下所出现的肌肉萎缩和脂肪浸润（FD），明确定义实验中特征性的时间点至关重要。Gupta 等人建立并验证了雄性兔的肩袖损伤模型，发现在术后2周和6周时均出现肌肉萎缩，且随着时间延长脂肪含量增加（2周时脂肪含量低于5%，6周时超过10%），这与人类肩袖撕裂中观察到的病理过程一致11。在本研究中，通过对雄性和雌性新西兰白兔的肩胛下肌（SSC）肌腱单位进行切断以建立巨大肩袖撕裂模型，持续4周后导致SSC肌肉发生脂肪浸润（脂肪含量为36.5%）。因此，4周的时间点适用于在雄性和雌性新西兰白兔中诱导SSC肌肉脂肪浸润。
本研究存在若干局限性，包括：（i）动物模型构建相关的步骤，例如用于模拟慢性样损伤的相对较短的时间点以及可能具有炎症性的材料（基于硅胶的彭罗斯引流管）；（ii）动物模型的表征与分析，例如缺乏步态分析和肌电图检测，无法评估关节运动学及肌肉收缩力的产生；（iii）动物模型的比较，例如缺乏与其他肩袖损伤部位的对比研究。
在模型构建方面，人类肩袖损伤通常涉及进行性肌肉萎缩和脂肪变性，这一过程可能持续数年，时间相对较长，而本研究报道的时间点为4周。这种情况被认为是可接受的，因为能够在相对较短时间内产生约36.5%肌内脂肪的动物模型在实验操作上更为便利，且如有需要，可延长观察时间。此外，基于硅胶的植入材料（如彭罗斯引流管）的生物相容性长期以来存在争议，已有文献报道其可引发细胞免疫反应和炎症47；因此，若开展与炎症相关的肩袖研究，可选用聚乙二醇（PEG）等惰性材料替代硅胶包裹切除后的肌腱。
在动物模型的表征与分析方面，缺乏步态分析49和肌电图研究50可能使本研究的结果局限于定性的组织学数据。未来的研究可通过采用视频运动分析51和表面肌电图50来获取肩关节运动学及肩袖肌肉功能的定量数据，以弥补上述不足。
在模型比较方面，由于兔的肩胛下肌腱和冈下肌腱也已广泛用于肩袖研究，未来比较这些不同损伤部位的损伤严重程度（包括纤维化程度）将有助于确定更多可用于模型优化的部位。
综上所述，本研究建立了一种用于模拟雄性和雌性兔慢性样肩袖（RC）损伤的实验方案。该模型操作简便（横断术），诱导慢性病变所需时间相对较短（4周），并能产生较大量（36.5%）的肌内脂肪变性（FD），便于研究人员使用。因此，该方案有望帮助研究人员深入研究肩袖疾病的病理生理机制，并促进肌肉-肌腱修复与再生新型治疗方法的开发。
披露
作者声明无竞争利益。
致谢
Dai Fei Elmer Ker 的研究得到了中国香港特别行政区食物及卫生局（医疗卫生研究基金：08190466）、中国香港特别行政区政府创新及科技局（第三层级资助：ITS/090/18；Health@InnoHK 计划）、中国香港特别行政区研究资助局（早期职业计划资助：24201720 及一般研究资助：14213922）以及香港中文大学（ Faculty Innovation Award：FIA2018/A/01）的资助。Dan Wang 的研究得到了中国香港特别行政区食物及卫生局（医疗卫生研究基金：07180686）、中国香港特别行政区政府创新及科技局（第三层级资助：ITS/333/18；Health@InnoHK 计划）以及中国香港特别行政区研究资助局（一般研究资助：14118620 和 14121121）的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 手术器械 | |||
| 4-0 聚乙醇酸（PGA） | e-Sutures | GBK884 | |
| 带齿Adson镊 | 淘宝，中国 | ||
| 精细剪刀 | 淘宝，中国 | ||
| 止血钳 | 淘宝，中国 | ||
| 持针器 | 淘宝，中国 | ||
| 带手柄手术刀 | 淘宝，中国 | 11号刀片 | |
| 缝线（4-0 尼龙） | 淘宝，中国 | 19054 | 皮肤缝合可使用尼龙或丝线缝线。每种缝线各有优缺点，建议使用者根据个人偏好选择。 |
| 手术辅料 | |||
| 棉球 | 淘宝，中国 | ||
| 纱布 | 淘宝，中国 | ||
| 剃刀 | 淘宝，中国 | ||
| 手术加热垫 | 淘宝，中国 | ||
| 手术灯 | |||
| 带针注射器 | 淘宝，中国 | 1 mL、5 mL、10 mL | |
| 药品 | |||
| 丁丙诺啡 | LASEC, CUHK | 0.12 mg/kg | |
| 布比卡因 | Sigma-Aldrich | b5274-5g | 1-2 mg/kg |
| 头孢氨苄 | Santa Cruz Biotechnology | sc-487556 | 20 mg/kg |
| 氯胺酮 | LASEC, CUHK | 35 mg/kg | |
| 戊巴比妥钠 | LASEC, CUHK | 超过60 mg/kg | |
| 赛拉嗪 | LASEC, CUHK | 5 mg/kg | |
| 设备 | |||
| Nikon Ni-U Eclipse 直立显微镜 | Nikon Instruments Inc, USA | ||
| 软件 | |||
| Adobe Photoshop 20.01 | Adobe Inc, USA | ||
| 其他试剂 | |||
| 聚维酮碘 | 淘宝，中国 | 5% | |
| 乙醇 | 淘宝，中国 | 70% | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | 10% |
| 多聚甲醛（PFA） | Electron Microscopy Sciences | 15713 | 4% |
| 硅胶管 | Easy Thru, 中国 | ISO13485 | |
| 生理盐水 | 淘宝，中国 | ||
| 组织学染色试剂 | |||
| 伊红染色液 | Sigma-Aldrich | R03040 | 5% 水溶液 |
| 苏木精染色液 | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| 三色染色试剂盒 （Masson） | Sigma-Aldrich | HT15 |
参考文献
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