方法文章

基于行为学与网络药理学的蒙药匝迪-5在大鼠抑郁模型中的分析

DOI：

10.3791/64832

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2023年2月24日

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1Faculty of Mongolian Medicine, Inner Mongolia Medical University, 2Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本实验方案描述了一种行为学测试验证及生物信息学预测传统蒙古药Zadi-5在抑郁症中治疗功效的方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

匝地-5 是一种传统蒙古药，广泛用于治疗抑郁症及烦躁症状。尽管既往临床研究已提示匝地-5 对抑郁症具有治疗作用，但该药物中活性药用成分的种类及其作用机制尚未完全阐明。 本研究采用网络药理学方法预测药物组成，并鉴定匝地-5 丸剂中的治疗活性成分。我们建立了慢性不可预知性轻度应激（CUMS）大鼠模型，并开展旷场实验（OFT）、Morris水迷宫（MWM）分析及蔗糖消耗实验（SCT），以探讨匝地-5 在抑郁症中的潜在治疗效果。本研究旨在验证匝地-5 对抑郁症的治疗作用，并预测其抗抑郁作用的关键通路。与未经治疗的CUMS模型组大鼠相比，氟西汀（阳性对照组）和匝地-5 组的垂直运动评分和水平运动评分（OFT）、SCT值以及穿越区域次数均显著升高（P < 0.05）。根据网络药理学分析结果，PI3K-AKT 通路在匝地-5 的抗抑郁效应中起关键作用。

引言

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抑郁症，也称为重度抑郁症（MDD），是一种严重的神经精神疾病，给社会带来了日益加重的医疗和经济负担。由于其相关的复杂性、发病率和死亡率，已有大量研究致力于寻找该疾病的治疗方法1,2。根据世界卫生组织的一项心理健康调查，目前全球约有3.5亿人正遭受抑郁症及其相关症状的困扰。预计到2030年，抑郁症将超过癌症和心血管疾病，成为全球疾病负担的首要原因。因此，抑郁症的预防和治疗将在不久的将来成为全球卫生的优先事项3。MDD的发病机制尚未完全阐明，但通常归因于以下因素：遗传易感性、下丘脑-垂体-肾上腺轴功能障碍、神经递质分泌减少、神经免疫失调引发的神经炎症、细胞凋亡以及细胞增殖减少4,5。

在这些因素中，神经免疫失调引发的神经炎症以及神经营养因子分泌的改变因其在抑郁症及许多其他精神疾病发生中的作用而受到特别关注6。过去十年中，学者们已证实海马体是神经再生功能的主要作用部位，并参与情绪和认知的调节。因此，海马神经元被视为正在研发的抗抑郁药物的新型治疗靶点7,8。此外，海马体还被报道参与学习过程中短期和长期记忆的形成与巩固。具体而言，海马体CA1区锥体神经元的缺失可导致逆行性和顺行性遗忘9。一种典型的抗抑郁治疗策略旨在增强海马齿状回中的细胞增殖和神经发生。来源于天然产物的化合物以及基于药物化学技术合成的小分子被认为是开发多种神经精神疾病创新治疗药物的主要来源。

传统蒙古医药源自蒙古高原的游牧民族，具有悠久的历史和完善的理论医学体系。由于含有多种药用成分，这些药物可通过多靶点、多通路的协同作用发挥疗效。扎迪-5是其中一种经典方剂，最早记载于杰出蒙古族临床医生高氏医生（1790–1876）所著的《高氏医生临床经验》一书中。在蒙古地区，该药丸长期用于临床治疗烦躁、心悸、易怒及心前区刺痛等症状10,11。此外，已有研究表明扎迪-5对中风后抑郁患者具有明确的改善作用12。近期针对CUMS模型的实验研究显示，扎迪-5可通过调节中枢神经递质水平缓解抑郁症状13；事实上，在抑郁大鼠模型中使用扎迪-5后，脑源性神经营养因子（BDNF）和酪氨酸激酶受体B（TrkB）的表达水平升高，并与学习和记忆能力的改善相关14。然而，扎迪-5缓解抑郁症状的具体作用机制尚未阐明。

本研究旨在通过行为学实验验证扎迪-5对大鼠抑郁症的治疗效果，并利用中医药系统药理学数据库（TCMSP）和Swiss Target Prediction技术鉴定扎迪-5的化学成分，进而预测传统蒙药扎迪-5治疗抑郁症的潜在作用机制。

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方案

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所有实验方案均经内蒙古医科大学动物实验伦理与护理委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院关于动物护理和伦理的指南。8周龄雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（体重200 g ± 20 g）被饲养在温度（22 °C ± 2 °C）和湿度（55% ± 15%）受控的环境中，光照/黑暗周期为12小时/12小时，适应1周。网络药理学分析的工作流程见图1。

大鼠行为学测试

  1. 建立CUMS大鼠模型
    1. 除对照组外，对所有大鼠施加以下刺激并结合单笼饲养28天：光照/黑暗周期颠倒24小时、禁食24小时、禁水24小时、水平高速摇晃15分钟（一次/秒）、夹尾2分钟、在冷水中（4 °C）游泳5分钟、45 °C热刺激以及潮湿垫料饲养24小时（表1）。将大鼠饲养在单独的笼子中。
      注意：避免相同类型的刺激连续多日重复使用。上述建立CUMS大鼠模型的程序已获得动物伦理委员会批准，并已有先前文献描述15。
  2. 药物配制
    1. 将Zadi-5药丸在研磨机中研碎，并用蒸馏水配制成1.16 g/mL的溶液。另用蒸馏水单独配制浓度为0.36 mg/mL的氟西汀溶液。
  3. 给药处理
    1. 将大鼠随机分为六组（n = 10）：对照组（CON）、模型组（MOD）、Zadi-5组（Zadi-5，1.6 g Zadi-5/kg16）、氟西汀组（Fluoxetine，3.6 mg 氟西汀/kg）。每日一次，连续28天，通过灌胃方式给予每只大鼠1 mL/g相应药物溶液；对照组和模型组给予等体积的蒸馏水。
      注意：所有组别的灌胃处理从建模开始时即同步启动。
  4. 敞箱实验（OFT）
    1. 将一个黑色箱子（50 cm × 50 cm × 30 cm）均分为九个面积相等的方形区域，并配备视频追踪分析系统。末次灌胃后一天，将大鼠置于中央方格内，记录其3分钟内的水平和垂直活动情况。
    2. 以四爪均进入的方格数量记为水平活动得分，以直立和理毛行为记为垂直活动得分。每次测试结束后，使用75%酒精清洁箱子，以消除大鼠气味，避免对后续测试造成干扰17。
  5. 蔗糖消耗实验（SCT）
    1. 分别称量大鼠饮用前后两个瓶子的重量，利用公式（1）计算第0天、第7天、第14天、第21天和第28天的60分钟内蔗糖偏好率：
      ​蔗糖消耗量 = 营养学研究中使用的蔗糖偏好公式，表示蔗糖水摄入量占总摄入量的比例。 × 100%     (1)
  6. 莫里斯水迷宫实验（MWM）
    1. 将水池均分为四个象限，依次编号为第一至第四象限，并将隐藏平台置于第三象限，位于水面下1 cm处。
    2. 将大鼠从不同象限放入迷宫中，寻找平台，持续120秒，使用莫里斯水迷宫视频轨迹分析系统记录其逃避潜伏期。
    3. 将大鼠从水池中固定位置放入。若大鼠在120秒内未能找到隐藏平台，则记录其潜伏期为120秒。
    4. 随后移除平台，将大鼠放入水中，在120秒内记录其穿越目标区域的次数。
    5. 向水池中加入牛奶以达到一定程度的不透明性。实验期间维持水温为23 °C ± 1 °C。

2. 网络药理学预测

  1. 筛选Zadi-5中的活性成分。
    1. 浏览中药系统药理学数据库（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），并输入“肉豆蔻种子 种子，木香 根，“和”胡椒果实 在“草药名称”部分输入以获取化学物质的名称。设置 口服生物利用度药代动力学指标 (OB) 以成为 >30% 以及 类药性（DL）指数 是 >0.18 (补充文件 1).
    2. 搜索“肉豆蔻” (Myristica fragrans Houtt），"土木香"（Inula helenium L.)，“木香”（云木香）、“广造”（Choerospondias axillaris Roxb. Burtt Hill）和“Bi Ba”（Piper longum L.) 在《中国药典》（http://www.zhongyaocai360.com/zhongguoyaodian/）中鉴定各组分的化学名称。
    3. 在 PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索已鉴定的化学名称，以查找其异构体 SMILES 或 InChIKey
  2. 鉴定Zadi-5中活性成分的作用靶蛋白
    1. 使用活性成分的同分异构体SMILES或InChIKey，通过SEA（http://sea.bkslab.org/）、BATMAN（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）和Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）鉴定靶蛋白，并找出重叠的靶蛋白。
    2. 使用蛋白质数据库 UniProt（http://www.uniprot.org/uploadlists/）将鉴定出的靶标转换为统一的基因名称。
  3. 寻找抑郁症的靶蛋白。
    1. 使用关键词“depression”和“depressive disorder”在Genecards（https://www.genecards.org/）、Disgenet（https://www.disgenet.org/）和Drugbank（https://www.drugbank.com/）中搜索并鉴定抑郁症的潜在蛋白质靶点。
  4. 找到目标基因。
    1. 浏览维恩图工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），将Zadi-5活性成分的作用靶点上传至列表1，将抑郁症相关靶点上传至列表2，然后提交。获取维恩图结果，并筛选出重叠的潜在靶点。
  5. 构建网络。
    1. 创建一个名为“类型与网络”的电子表格（补充文件 2“类型”是网络的特征，“网络”则描述了各符号之间的关系。
    2. 将“Type and Network”导出至 Cytoscape v3.9.0，以构建“Zadi-5 herbs-ingredients-disease targets”网络。
  6. 分析目标候选蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。
    1. 在 STRING 数据库（https://cn.string-db.org/）中设置共同靶点以分析它们之间的相互作用。设置 蛋白类型 作为“homo sapiens设置 相互作用阈值 值 0.9，并仅选择经过实验验证的类型。不显示孤立的岛屿节点。
  7. 对与靶点相关的通路进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体（GO）富集分析。
    1. 将Zadi-5的86个潜在抗抑郁靶点导入 开始分析 在DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）中使用括号功能，通过基因本体（Gene Ontology, GO）功能分析（包括生物过程、细胞组分和分子功能）以及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析，研究相关信号通路。
      注意：KEGG 通路通过在线工具 IMageGP（http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/）以气泡图形式展示。气泡大小表示在指定通路中富集的靶点数量，气泡颜色表示富集程度的显著性。P-值
  8. 构建网络以展示Zadi-5中与PI3K-AKT信号通路相互作用的活性化合物。
    1. 下载 KEGG 通路文件，从富集分析中选择 PI3K-AKT 通路的相关基因，并将其粘贴至电子表格中，构建“类型与网络”文档。
    2. 将“Type and Network”文件导出至Cytoscape，以生成“PI3K-AKT可视化化合物-靶点-通路网络”补充文件 3).
      注意：“类型”是网络的特征，“网络”则描述了各特征之间的相互关系。

3. 统计分析

  1. 采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行邓肯（Duncan）事后检验，以确定生化指标和基因表达参数之间的显著差异。计算均值 ± 标准差（SD），并对数据进行可视化。将 P < 0.05 视为具有统计学显著性。

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结果

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动物行为学实验
CUMS诱导的大鼠抑郁模型中行为学实验结果
在CUMS刺激前，各检测组在开放旷场实验（OFT）评分、蔗糖消耗量及莫里斯水迷宫（MWM）分析方面均无显著差异。CUMS模型建立后，MOD组的竖直和水平评分均低于CON组（P < 0.05）。与MOD组相比，POS组和Zadi-5组的竖直和水平评分显著升高（P < 0.05）（图2A、B）。

在第0天，各测试组的蔗糖消耗量（%）无显著差异。在第28天，Zadi-5组和POS组的蔗糖消耗量（%）高于MOD组（图2C）。

与CON组相比，MOD组大鼠在MWM中找到平台的潜伏期显著延长（P < 0.01）。POS组的潜伏期明显低于MOD组。Zadi-5组大鼠的潜伏期低于MOD组，但差异无...

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讨论

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抑郁症是一种以情绪低落、快感缺失和精力不足为特征的精神疾病。该疾病常伴有注意力分散、认知功能障碍、社交退缩、失眠、性功能障碍以及胃肠道疾病。18,19在抑郁症研究中，建立动物模型对于理解其病理机制及新药疗效至关重要。本研究通过第2节方案中所述的刺激方法，建立了CUMS诱导的大鼠抑郁模型。 表1 通过模拟来自社会、家庭和工作等方面的压力、攻击和挫败感来建立抑郁模型。刺激源的适当顺序及其强度的合理调整对于构建该抑郁模型至关重要。此外，每次进行敞箱实验（OFT）后，必须立即清洁实验箱，以避免前一只大鼠的痕迹影响后续大鼠的行为。慢性不可预知性温和应激（CUMS）结合隔离饲养能有效建立稳定可靠的大鼠抑郁模型20 模拟人类患者抑郁症状及生物化学征象的模型。该模型已被广泛用于探索抑郁症的病理生理机制，并评估处于研发阶段的抗抑郁药物21,22...

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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我们感谢中国内蒙古医科大学蒙医药学院提供的仪器设备和实验室条件。本研究得到中国国家自然科学基金（81760762）和中国内蒙古自治区卫生健康委员会科学技术计划项目（202201300）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Cytoscape 软件 版本 3.7.0
氟西汀礼来苏州制药有限公司J20160029
莫里斯水迷宫视频轨迹分析系统 太盟科技有限公司WMT-200
Sprague Dawley 大鼠中国北京生物技术有限公司 SCXK (京) 2016-0002
 视频追踪系统太盟科技有限公司ZH-ZFT
扎迪-5 号药丸中国内蒙古国际蒙医医院制剂中心M1301006

参考文献

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Zadi 5 PI3K AKT

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