基于RPA-CRISPR/Cas12a-SPM与深度学习的DNA病毒检测系统

摘要

我们提出了一种将重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a系统相结合的方案，用于DNA病毒的痕量检测，并构建了便携式智能手机显微镜，结合人工智能辅助分类，实现现场DNA病毒检测。

摘要

我们报道了一种快速、易于实施、高灵敏度、序列特异性的即时检测（POC）DNA病毒检测系统，该系统结合了重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Cas12a技术，用于痕量DNA病毒的检测。目标DNA分别通过RPA和CRISPR/Cas12a进行扩增与识别，从而激活Cas12a的旁切活性，切割带有荧光基团-淬灭基团标记的DNA报告探针，产生荧光信号。为实现即时检测，系统构建了便携式智能手机显微镜以采集荧光图像。此外，系统内部署了用于阳性或阴性样本二分类的深度学习模型，具有高准确率。以蛙病毒3型（FV3，属Ranavirus，虹彩病毒科Iridoviridae）为例对该DNA病毒POC检测系统进行了测试，检测限（LoD）可在40分钟内达到10 aM。该便携式、微型化的RPA-CRISPR/Cas12a-SPM系统结合人工智能（AI）辅助分类，无需专业操作人员和大型仪器，展现出在DNA病毒即时检测中的巨大潜力，有助于防止此类病毒的传播。

引言

近年来，由不同病毒引起的传染病疫情频繁发生，包括2014年¹和2018年²的埃博拉病毒病（EVD）疫情、2015年的中东呼吸综合征（MERS）³、2015年的寨卡病毒病疫情⁴、由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）⁵，以及2022年持续发生的由猴痘病毒（MKPV）引起的猴痘疫情⁶。这些突发性传染病疫情造成了大量人员死亡，并带来了巨大的经济损失和社会动荡。因此，迫切需要建立一种快速且准确的检测系统，以实现对感染的快速诊断，并防止病毒进一步传播。

近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白（Cas）受到全球广泛关注，并在核酸检测方面展现出良好的应用前景^7,8,9,10,11,....

方案

1. 样品处理

1. 取蛙病毒3型（Frog Virus 3，FV3，属Ranavirus，科Iridoviridae），一种双链DNA病毒。选择主要衣壳蛋白（mcp）基因为FV3的检测靶标，因其高度保守，通常被视为蛙病毒检测的靶标。所选靶序列见表1。
   注意：本方案中以蛙病毒3型为例。
2. 对于靶DNA片段的制备，使用来自FV3和传染性脾肾坏死病毒（ISKNV，另一种蛙病毒）的mcp基因DNA片段。
   注意：本研究中，靶DNA片段通过商业途径获得，供应商列于材料表中。这些片段将作为后续检测的靶标和对照。

名称	序列
FV3 MCP	NTS: 5’ …gtaacccggctttcGGGCAGCAGTTTCGGTCGGCG....

结果

该方法聚焦于一种快速、易于实施、高灵敏度且适用于现场即时检测（POC）的DNA病毒检测系统。RPA反应的引物对设计以及CRISPR/Cas12a反应的crRNA设计是其中两个关键环节，因为它们将影响RPA-CRISPR/Cas12a反应的效率，并进而影响后续的检测与分型。

在此方法中，蛙病毒3型（FV3）被用作DNA病毒检测的示例。设计了若干对针对FV3的RPA引物，筛选出效率最高的一对，并通过凝胶电泳检测RPA扩增产物的条带亮度和大小（如步骤2.8所述）来确认其具有良好的扩增效率。同时，设计了CRISPR/Cas12a系统的crRNA，并根据在无RPA反应条件下CRISPR/Cas12a系统触发的荧光信号强度筛选出效率最高的crRNA。三对RPA正向引物、三对反向引物以及三条Cas12a crRNA的序列如下所示 表7根据琼脂糖凝胶电泳结果所示 图3，第6^th 一对引物具有更高的扩增效率（F2 和 R1），被选用于该方法。.......

讨论

在本方法中，我们开发了一种在人工智能辅助下的快速、易于实施、高灵敏度、序列特异性的即时检测（POC）DNA病毒检测系统。在获取样本后，首先采用RPA技术扩增目标序列，随后CRISPR/Cas12a可识别目标DNA并释放荧光信号，从而放大检测信号。通过构建便携式智能手机显微镜采集荧光图像，并利用结合迁移学习的深度学习模型对阳性与阴性样本的图像进行二分类判读。本方法以FV3作为阳性样本，从多个角度对其进行研究，以提升所提出系统的特异性和灵敏度。

第一种策略是设计特异性的RPA引物，并筛选出效率最高的引物。RPA反应的扩增效率受不同引物的影响³⁶。用于扩增DNA病毒株目标基因的引物特异性，可通过与核苷酸序列标准数据库进行比对（blast）来确认。由于目前尚无设计高效RPA引物对的指导原则，因此需要通过实验验证³⁷。

另一种方法是针对目标病毒设计用于CRISPR/Cas12a反应的crRNA，因为附带切割效率显著影响检测的灵敏度

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
20倍扩增	OLYMPUS	OPLN20X
532 nm 绿色激光器	Thorlabs	PL201	输出功率为 0.9 mW
535 nm 截止波长	chrome	AT535
6x DNA 上样缓冲液	Thermo scientific	R0611
96孔黑色微孔板	Corning Incorporated	3603	黑色，带透明平底
非球面透镜	Lubang	N/A
带通滤光片	SEMROCK	FF01-542/27-25
Bsu DNA 聚合酶	ATG Biotechnology	M103	大片段
crRNA	Sangon Biotech	N/A
DNA 片段	Sangon Biotech	N/A
二向色镜支架	Ruicage	N/A
二向色镜	SEMROCK	FF555-Di03-25x36	截止波长为 535 nm
E.Z.N.A 凝胶回收试剂盒	Omega Biotek	D2500-02
EnGen Lba Cas12a (Cpf1)	New England Biolabs (Beijing) LTD	M0653T
滤光片支架	Ruicage	N/A
荧光团-单链DNA-淬灭剂报告探针	Sangon Biotech	N/A	5'端使用 TAMRA（羧基四甲基罗丹明）作为荧光团；3'端使用 BHQ2（黑洞淬灭剂-2）作为淬灭剂
GP32	ATG Biotechnology	M104
ImageJ	开源软件	版本 1.53t 24	从 https://imagej.nih.gov/ij/  下载
微孔板读板仪	SPARK, TECAN	N/A
多模块梯度PCR仪	LongGene	N/A
NanoDrop 2000/2000c 分光光度计	Thermo Scientific	ND-2000
NEBuffer r2.1	New England Biolabs (Beijing) LTD	B6002S	10x CRISPR/Cas12a 反应缓冲液
氧气等离子体处理	Electro-Technic  Products	N/A
病原体灭活、无需核酸提取、直接用于PCR的蛋白酶K缓冲液（PINDBK）	Ebio	PINDBK -25mL
PCR引物对	Sangon Biotech	N/A
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
RPA引物对	Sangon Biotech	N/A
智能手机	Huawei	Mate10
平移台	Ruicage	N/A
透射式中性密度滤光片	Thorlabs	ND40A
三胶合消色差透镜	Thorlabs	TRH127-020-A
UvsX	ATG Biotechnology	M105
UvsY	ATG Biotechnology	M106