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基于RPA-CRISPR/Cas12a-SPM与深度学习的DNA病毒检测系统

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DOI：

10.3791/64833

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2024年5月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Precision Medicine and Healthcare, Tsinghua-Berkeley Shenzhen Institute, 2Institute of Biopharmaceutics and Health Engineering, Tsinghua Shenzhen International Graduate School

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们提出了一种将重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a系统相结合的方案，用于DNA病毒的痕量检测，并构建了便携式智能手机显微镜，结合人工智能辅助分类，实现现场DNA病毒检测。

摘要

我们报道了一种快速、易于实施、高灵敏度、序列特异性的即时检测（POC）DNA病毒检测系统，该系统结合了重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Cas12a技术，用于痕量DNA病毒的检测。目标DNA分别通过RPA和CRISPR/Cas12a进行扩增与识别，从而激活Cas12a的旁切活性，切割带有荧光基团-淬灭基团标记的DNA报告探针，产生荧光信号。为实现即时检测，系统构建了便携式智能手机显微镜以采集荧光图像。此外，系统内部署了用于阳性或阴性样本二分类的深度学习模型，具有高准确率。以蛙病毒3型（FV3，属Ranavirus，虹彩病毒科Iridoviridae）为例对该DNA病毒POC检测系统进行了测试，检测限（LoD）可在40分钟内达到10 aM。该便携式、微型化的RPA-CRISPR/Cas12a-SPM系统结合人工智能（AI）辅助分类，无需专业操作人员和大型仪器，展现出在DNA病毒即时检测中的巨大潜力，有助于防止此类病毒的传播。

引言

近年来，由不同病毒引起的传染病疫情频繁暴发，包括2014年1和2018年2的埃博拉病毒病（EVD）疫情、2015年的中东呼吸综合征（MERS）3、2015年的寨卡病毒病疫情4、由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）5，以及2022年持续发生的由猴痘病毒（MKPV）引起的猴痘疫情6。这些突发性传染病疫情导致大量人员死亡，并带来巨大的经济损失和社会动荡。因此，迫切需要建立一种快速且准确的检测系统，以实现对感染的快速诊断，并防止病毒进一步传播。

近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白（Cas）受到全球广泛关注，并在核酸检测方面展现出良好的应用前景7,8,9,10,11,12,13,14,15。CRISPR/Cas12a 蛋白在 CRISPR RNA（crRNA）的引导下，可结合并切割靶标 DNA。该活性会释放非特异性的单链 DNA（ssDNA），即反式切割效应，可用于增强核酸检测的检测信号。一些传统检测方法，如聚合酶链式反应（PCR）、定量实时 PCR（qPCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA），在即时检测（POC）中存在操作复杂、耗时长且成本高的问题。我们先前的研究已成功开发出一种基于 CRISPR/Cas12a 技术的自动化、集成化且成本效益高的非洲猪瘟病毒（ASFV）检测系统。在该系统中，我们在无需扩增的情况下，2 小时内实现了 1 pM 的检测限。该系统结合了 CRISPR/Cas12a 与重组酶聚合酶扩增（RPA）技术，以提高痕量 DNA 检测的灵敏度和特异性。与其他等温扩增技术相比，RPA 设计简单、操作便捷，因其反应时间较短，且无需复杂的温度控制设备。

为了实现对病原体的即时检测（POC），已开发出智能手机显微镜（SPM）、手持式荧光仪或侧向层析试纸条等设备用于结果读取16,17,18。智能手机显微镜通过摄像头捕获图像，并将其上传至特定移动应用程序以进行快速数据分析。此类显微技术构建了一种便携、低成本且微型化的信号采集系统，具有高灵敏度，已在检测H5N1、寨卡病毒和SARS-CoV-2等病原体方面展现出优势19,20。因此，我们构建了一套便携式智能手机显微镜系统，用于捕获由RPA-CRISPR/Cas12a对目标DNA病毒检测所触发的荧光信号。当CRISPR/Cas12a识别到目标DNA病毒时，连接了荧光基团与淬灭基团的单链DNA报告探针将被切割，荧光基团释放的荧光信号即可被智能手机显微镜捕获。

与通常用于从SPM21荧光图像中获取结果信息的专业软件相比，一些专家采用机器学习和深度学习方法，在获得荧光图像后对病毒DNA浓度进行量化22，但这种方法耗时更长。在医学图像分类方面，传统上常使用卷积神经网络（CNN）以端到端的方式直接从原始像素化图像中学习特征23,24,25,26。基于CNN的主流深度学习模型，如AlexNet、DenseNet-121和EfficientNet-B7，已在该领域成功应用27,28。然而，在特定领域获取大规模数据集往往具有挑战性，因此需要采用迁移学习29,30。该方法首先利用大规模数据集对深度学习模型进行预训练，然后将预训练模型作为小规模数据集新任务的起点。这种技术可减少对大规模数据集的需求，缓解过拟合问题，并缩短训练时间31。本文中，我们结合迁移学习的深度学习模型，对阳性与阴性样本的荧光图像进行二分类。

本方法将RPA与CRISPR/Cas12a系统相结合，用于DNA病毒的痕量检测。目标DNA分别通过RPA和CRISPR/Cas12a进行扩增和识别，从而激活Cas12a的旁切活性，切割带有荧光基团-淬灭基团标记的DNA报告分子，产生荧光信号。我们构建了一种便携式SPM装置用于采集荧光图像，实现即时检测（POC），并开发了深度学习模型用于二分类分析。所构建的POC检测系统的示意图见图1。该RPA-CRISPR/Cas12a-SPM系统结合人工智能（AI）辅助分类，无需专业操作人员和大型仪器，展现出在POC场景下检测DNA病毒的巨大潜力。

利用RPA扩增进行CRISPR/Cas12a DNA检测；示意图、荧光分析、深度学习。
图1：RPA-CRISPR/Cas12-SPM检测系统示意图，结合人工智能对采集图像进行分类。 动物来源样本中的核酸通过PINDBK释放。病毒的目标DNA由RPA-CRISPR/Cas12a系统特异性扩增并识别。CRISPR/Cas12a与crRNA结合，形成的Cas12a-crRNA复合物与目标DNA结合，从而触发CRISPR/Cas12a对ssDNA报告探针的附带切割。报告探针上的荧光基团被释放，荧光信号由商用酶标仪或我们构建的SPM检测。采用三种不同的深度学习模型——包括AlexNet、DenseNet-121和EfficientNet-B7，并结合迁移学习，对荧光图像进行分类。该图经Lei等35许可重用。请点击此处查看此图的放大版本。

方案

1. 样品处理

  1. 取蛙病毒3型（Frog Virus 3，FV3，属Ranavirus，科Iridoviridae），一种双链DNA病毒。选择其主要衣壳蛋白（mcp）基因为FV3的检测靶标，因为该基因高度保守，通常被视为蛙病毒属检测的靶标。所选靶序列见表1。
    注：本方案以蛙病毒3型为例。
  2. 为制备靶标DNA片段，使用来自FV3和传染性脾肾坏死病毒（Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus，ISKNV，另一种蛙病毒）的mcp基因DNA片段。
    注：在本研究中，靶标DNA片段通过商业途径从材料表中列出的公司获得，用作后续检测的靶标和对照。
名称序列
FV3 MCPNTS: 5’ …gtaacccggctttcGGGCAGCAGTTTCGGTCGGCGTtcccaggtcg… 3’ (240 bp)
TS: 5’ …ccgacctgggaACGCCGACCGAAACTGCTGCCCtgctgcccgaaagc… 3’ (240 bp)
ISKNV MCPNTS: 5’ …ggccatgccaatttTGGGCAGGAGTTTAGTGTGACGgtggcgaggg… 3’ (231 bp)
TS: 5’ …ccctcgccaccgtcACACTAAACTCCTGCCCAAAATtggcatggcc… 3’ (231 bp)

表1：本方法中选定的靶序列。

2. RPA 反应

  1. 针对目标序列设计并合成RPA引物对。RPA引物对的序列见表2。
  2. 配制5x RPA反应缓冲液（表3）和MgCl2（100 mM）。
  3. 将四种关键RPA酶（UvsX、UvsY、GP32、Bsu蛋白）与预先设计的引物一起加入1x RPA反应缓冲液中，具体成分见表4。
  4. 充分涡旋混匀混合物。
  5. 每个RPA反应中加入1 µL步骤1获得的目标样本，并再次涡旋充分混匀。
  6. 加入7 µL MgCl2（100 mM）以启动反应。每个RPA反应的终体积为50 µL。
  7. 在37 °C下反应30分钟。
  8. RPA产物可在4 °C保存数天。由于RPA产物会逐渐降解，建议尽快用于后续检测以获得更佳的诊断结果。
  9. [可选] 进行DNA琼脂糖凝胶电泳。
    1. 取5 µL RPA产物，加入适量6x DNA上样缓冲液，在Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液中进行DNA凝胶电泳。
    2. 在120 V电压下电泳约20分钟，直至上样缓冲液的条带迁移至凝胶底部。
    3. 通过比较样本条带与DNA标记物条带的大小，判断目标序列是否从样本中成功扩增。
名称序列
RPA 引物 FATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACA
RPA 引物 RGGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGG

表2：本方法中使用的RPA引物。

组分原始浓度添加量
PEG 20,000-114 mg
ATP100 mM125 μL
dNTPs25 mM48 μL
Tris-HCl1 M125 μL
DTT1 M125 μL
磷酸肌酸1 M250 μL
肌酸激酶10 μg/μL50 μL
ddH2O-277 μL
总体积-1 mL

表3：5x RPA 反应缓冲液（pH 7.5）的组成。

组分原始浓度添加量
5x RPA 反应缓冲液-10 μL
UvsX 蛋白5 mg/mL2.6 μL
UvsY 蛋白5 mg/mL0.9 μL
GP32 蛋白5 mg/mL2.54 μL
Bsu 蛋白5 mg/mL0.88 μL
正向引物100 μM0.25 μL
反向引物100 μM0.25 μL
ddH2O-24.58 μL
靶标-1 μL
*MgCl2100 mM7 μL
总体积50 μL
*MgCl2 需最后加入以启动 RPA 反应。

表4：RPA反应的组成。

3. 无需SPM的CRISPR/Cas12a检测

  1. 使用靶序列的crRNA（材料表）以及连接了荧光团和淬灭基团的单链DNA（ssDNA）报告探针进行CRISPR/Cas12a检测。此处，羧基四甲基罗丹明（TAMRA）作为荧光团连接在ssDNA报告探针的5'端，Black Hole Quencher-2（BHQ2）作为淬灭基团连接在3'端。crRNA与ssDNA报告探针的具体序列见表5。
  2. 准备Lachnospiraceae bacterium Cas12a（LbCas12a）蛋白及10倍浓度的CRISPR/Cas12a反应缓冲液。
  3. 将第2部分的1 µL RPA反应产物溶解于1倍浓度的CRISPR/Cas12a反应缓冲液中，加入LbCas12a-crRNA复合物和500 nM的ssDNA报告探针，总体积为100 µL。
  4. 将LbCas12a与crRNA混合后，静置至少5分钟以形成功能性复合物。孵育完成后，向反应体系中加入其余组分，并在37 °C下进行整个反应。每次CRISPR/Cas12a反应的终体积为100 µL。各组分在每次CRISPR/Cas12a反应中的具体浓度见表6。
  5. 在37 °C下进行100 µL的CRISPR/Cas12a检测反应，持续30分钟。
  6. 使用酶标仪持续检测荧光信号，激发波长为535 nm，发射波长为595 nm，增益设为60。
    注意：不同激发和发射波长的检测取决于先前设计的ssDNA报告探针中所选用的荧光团和淬灭基团。
  7. 对所采集的数据，以对照组数值除以阳性样本的测量值进行数据归一化处理，随后进行双样本t检验分析。
名称序列
LbCas12a 靶向 FV3 的 crRNAuaauuucuacuaaguguagauGGGCAGCAGTTTTCGGTCGGCGT
ssDNA 报告分子/5TAMRA/TTATT/3BHQ2

表5：本方法中使用的CRISPR/Cas12a crRNA和ssDNA报告基因的序列。

组分原始浓度添加量
NEBuffer r2.1 -10 μL
Lba Cas12a (Cpf1)10 μM0.5 μL
crRNA10 μM0.625 μL
静置至少 5 分钟，使 LbCas12a/crRNA 复合物充分结合。
DNA 报告分子100 μM0.5 μL
ddH2O-87.375 μL
靶标-1 μL
总体积-100 μL

表6：CRISPR/Cas12a 反应体系的组成。

4. 扫描探针显微镜设置

  1. 在激发光路中，调节激光束使其通过中性密度（ND）滤光片，以衰减激光强度。
  2. 利用非球面透镜（以下简称L1）产生准直光束，并通过二向色镜（DM）将其反射。
  3. 将光束引导至放置样品的载玻片，经物镜（20倍）照射并激发样品的荧光。样品载物台可实现焦平面的精确调节，将光束导向物镜的后焦平面。上述步骤构成了SPM仪器的激发光路。
  4. 在发射光路中，放置一个外部透镜（以下简称L2），在物镜另一侧形成中间像。物镜同时用于照射样品并收集发射信号。
  5. 将智能手机置于发射光路末端，用于记录样品发出的荧光信号。使用稳定的支架以避免抖动。
  6. 在L1与智能手机摄像头之间设置一个带通滤光片，以滤除激发光，仅允许样品发射的光到达摄像头，从而优化检测效果。
  7. 将SPM装置固定于光学面包板上，便于便携式部署。
    注：基于RPA-CRISPR/Cas12a反应的荧光检测SPM装置的示意图及实物图见图2。CRISPR/Cas12a检测在下一步所述的预处理载玻片上进行。

用于光谱分析的手机摄像头光学装置；示意图显示激发和发射光路。
图 2：用于荧光检测的 SPM 装置的示意图及实物外观。（A）RPA-CRISPR/Cas12a 反应后用于荧光图像采集的 SPM 装置实物图。（B）基于 RPA-CRISPR/Cas12a 反应的 SPM 装置荧光检测示意图。该图经 Lei 等人35许可修改（调整了图像位置和颜色）。请点击此处查看此图的放大版本。

5. 原子力显微镜检测用玻片的处理

  1. 按10:1的比例混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）的基料与固化剂，制备PDMS，随后在80 °C的热板上烘烤2 h。
  2. 将PDMS和载玻片（长度：75 mm；高度：50 mm）均进行氧气等离子体处理120 s，然后将二者压合在一起。
  3. 将玻璃片/PDMS在95 °C下烘烤2 h；通过Si-O-Si键实现永久密封。PDMS具有高透明性且无自荧光，有利于SPM检测。载玻片与PDMS的处理方法参照He等32的方法进行。

6. 使用 SPM 进行 CRISPR/Cas12a 检测

  1. 使用靶序列的crRNA（材料表）以及连接了荧光基团和淬灭基团的单链DNA（ssDNA）报告探针进行CRISPR/Cas12a检测。在本方法中，四甲基罗丹明羧酸（TAMRA）作为荧光基团连接在ssDNA报告探针的5'端，Black Hole Quencher-2（BHQ2）作为淬灭基团连接在3'端。crRNA和ssDNA报告探针的具体序列见表5。
  2. 准备Lachnospiraceae bacterium Cas12a（LbCas12a）蛋白及10倍浓度的CRISPR/Cas12a反应缓冲液。
  3. 将第2部分的RPA反应产物1 µL溶解于1倍浓度的CRISPR/Cas12a反应缓冲液中，加入LbCas12a-crRNA复合物和500 nM的ssDNA报告探针，总体积为100 µL。
  4. 将LbCas12a与crRNA混合后，室温静置至少5分钟，以形成具有功能的复合物。孵育完成后，向反应体系中加入其余组分，并在37 °C完成反应。每次CRISPR/Cas12a反应的终体积为100 µL。各组分在每次CRISPR/Cas12a反应中的具体浓度见表6。
  5. 在预处理的载玻片上进行100 µL的CRISPR/Cas12a检测反应，并加盖盖玻片。将载玻片置于室温下孵育10分钟。
  6. 使用SPM测量荧光信号。将含有检测反应的载玻片放置在SPM的载物台上，保持适当距离，调节焦距和清晰度，然后寻找反应视野并聚焦以获取图像。
    ​注意：应首先建立标准曲线，以便将样品数据换算为近似的浓度范围。使用不同浓度的纯化靶标进行检测，包括10 nM、1 nM、100 pM和10 pM，并以另一种病毒作为阴性对照（RPA前）。

7. 数据集与数据增强

  1. 将第6节检测实验中的荧光图像作为数据集进行收集。每个样本至少重复三次平行检测，以确保数据的平行性。
    1. 可采用一些适当的方法来提高平行性。例如，在采集每个样本的荧光图像时，手动对焦并寻找相对明亮的视野进行成像；同时，对每个样本在五个以上不同位置拍摄图像，以获取更全面的荧光信号。
  2. 使用ImageJ软件测量每幅图像的平均灰度值，并计算同一浓度组内平均灰度值的标准差。
  3. 设定一个强度范围 [中位数 - 标准差, 中位数 + 标准差]，用于数据清洗。
    ​注意：在前期步骤获得的图像中，可能存在差异较大的图像，因此有必要对图像进行筛选。若图像的强度超出设定阈值范围，则应视为异常值并予以剔除。
  4. 将目标物在浓度递增条件下的纯化样本图像，按浓度由低到高分别标记为0–6。
  5. 为增强系统的鲁棒性并防止过拟合，可通过Python中的变换函数实施图像增强技术，如水平翻转、垂直翻转和添加随机噪声，从而在数据集中引入更多变异。

8. 迁移学习

  1. 采用深度学习模型 AlexNet33 作为骨干网络进行分类。
  2. 为满足第7节中预训练模型的约束条件，通过 Python 中的变换函数将输入图像重塑为 224 像素 × 224 像素 × 3 通道（高度和宽度均为 224 像素，深度为红、绿、蓝三色通道的 3 个通道）。
    注意：此步骤是迁移学习中对异构数据进行变换等操作的常见预处理方法。
  3. 使用在 ImageNet 数据集上预训练的骨干网络提取特征，同时利用其中间隐藏层已学习到的权重。
  4. 在荧光分类任务中，将神经网络原有的全连接输出层（最初包含 1000 个神经元，对应 ImageNet 任务）替换为包含 2 个或 7 个神经元的全连接层。
  5. 根据 Lawton 和 Viriri34 的方法，采用一系列指标（包括混淆矩阵、准确率、精确率、召回率和 F1 分数）评估所构建训练模型的性能。

结果

该方法专注于一种快速、易于实施、高灵敏度且适用于现场检测（POC）的DNA病毒检测系统。RPA反应的引物对设计以及CRISPR/Cas12a反应的crRNA设计是其中两个关键环节，因为它们将影响RPA-CRISPR/Cas12a反应的效率，并进而影响后续的检测与分型。

在此方法中，蛙病毒3型（FV3）被用作DNA病毒检测的示例。设计了若干对针对FV3的RPA引物，从中筛选出效率最高的一对，并通过凝胶电泳检测RPA扩增产物的条带亮度和大小（如步骤2.8所述）来确认其具有良好的扩增效率。同时，设计了CRISPR/Cas12a系统的crRNA，并根据在无RPA反应条件下CRISPR/Cas12a系统触发的荧光信号强度，选择效率最高的crRNA。三对RPA正向引物、三对反向引物以及三条Cas12a crRNA的序列如下所示 表7根据琼脂糖凝胶电泳结果所示 图3，第6th 一对引物具有更高的扩增效率（F2 和 R1），被选用于该方法。如图所示 图4，crRNA-3 在附带切割效应中效率最高，因此在本方法中被选用。

RPA 引物 F1ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACAAG
RPA 引物 F2ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACA
RPA 引物 F3TCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACAAGTGGT
RPA 引物 R1GGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGG
RPA 引物 R2GGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGGAA
RPA 引物 R3CGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGGAACG
LbCas12a crRNA-1uaauuucuacuaaguguagauATCGACTTGGCCACTTATGACAA
LbCas12a crRNA-2uaauuucuacuaaguguagauTCAAGGAGCACTACCCCGTGGGG
LbCas12a crRNA-3uaauuucuacuaaguguagauGGGCAGCAGTTTTCGGTCGGCGT

表7：用于反应优化的RPA引物和crRNA序列。

DNA电泳结果，凝胶条带显示以碱基对表示的DNA大小标记；分子生物学方法。
图3：RPA扩增效率评估的琼脂糖凝胶电泳结果。 RPA反应在相同条件下使用不同引物组合进行，目标模板浓度为1 nM的纯化DNA。编号1代表RPA-F3与RPA-R3的组合，2为RPA-F3与RPA-R2，3为RPA-F3与RPA-R1，4为RPA-F2与RPA-R3，5为RPA-F2与RPA-R2，6为RPA-F2与RPA-R1，7为RPA-F1与RPA-R3，8为RPA-F1与RPA-R2，9为RPA-F1与RPA-R1。请点击此处查看该图的放大版本。

随时间（分钟）变化的crRNA-1、crRNA-2和crRNA-3归一化信号强度图。
图4：利用CRISPR/Cas12a系统通过三种不同crRNA检测FV3靶标片段。 检测中使用的纯化片段浓度范围为10 nM至100 pM靶标DNA，对照DNA浓度为10 nM，孵育时间为30分钟。本图经Lei等35许可重用。 请点击此处查看此图的放大版本。

为了生成图5中的数据，我们采用了优化后的RPA引物、crRNA以及SPM装置。为了更准确地评估样品中的浓度，我们利用PCR扩增试剂盒对蛙病毒3型（FV3）和传染性脾肾坏死病毒（ISKNV，Iridoviridae科）高度保守的主要衣壳蛋白（MCP）基因的240 bp DNA片段进行扩增，分别作为检测靶标和对照，具体操作步骤如表8所示。通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增DNA的大小，并从凝胶中回收纯化双链DNA靶标和对照片段。使用NanoDrop 2000分光光度计对纯化的DNA片段进行定量。

细胞观察对照与100 pM样品的显微镜图像比较，33 µm比例尺。
图5：纯化的目标DNA与对照DNA的荧光图像。（A）阴性对照。（B）纯化的目标DNA（100 pM）。本图经Lei等35许可重用。请点击此处查看此图的放大版本。

阶段温度 (°C)时间循环次数
热启动955 分钟1
变性9530 秒35
退火6045 秒
延伸7230 秒
最终延伸725 分钟1
保存4--

表8：PCR扩增步骤。

作为参考，数据清洗后获得了一个包含 162 张荧光图像的数据集。为进一步分析，需要扩大荧光图像的数量，因此我们分别使用 337 张荧光图像进行二分类训练，以及 398 张图像进行多分类训练。

我们在约40分钟内完成了检测，其中包括30分钟的RPA扩增和RPA后10分钟的LbCas12a检测。使用所开发的检测系统配合选定的RPA引物和crRNA时，10 aM FV3与对照组的信号强度表现出显著差异，如补充图1所示。

补充图1：使用不同浓度纯化片段进行RPA-LbCas12a反应所采集荧光图像的信号强度统计结果。*：p < 0.05；**：p < 0.01；***：p < 0.001；****：p < 0.0001；F：FV3，I：ISKNV；a.u.：吸光度单位。本图经Lei等35许可重复使用。请点击此处下载该文件。

讨论

在本方法中，我们开发了一种在人工智能辅助下的快速、易于实施、高灵敏度、序列特异性的即时检测（POC）DNA病毒检测系统。在获取样本后，首先采用RPA技术扩增目标序列，随后CRISPR/Cas12a可识别目标DNA并释放荧光信号，从而放大检测信号。通过构建便携式智能手机显微镜采集荧光图像，并利用结合迁移学习的深度学习模型对阳性与阴性样本的图像进行二分类判读。本方法以FV3作为阳性样本，从多个角度对其进行研究，以提升所提出系统的特异性和灵敏度。

第一种策略是设计特异性的RPA引物，并筛选出效率最高的引物。RPA反应的扩增效率受不同引物的影响36。用于扩增DNA病毒株目标基因的引物特异性，可通过与核苷酸序列标准数据库进行比对（blast）来确认。由于目前尚无设计高效RPA引物对的指导原则，因此需要通过实验验证37。

另一种方法是针对目标病毒设计用于CRISPR/Cas12a反应的crRNA，因为附带切割效率显著影响检测的灵敏度38,39。在选择更优crRNA时，需考虑在不使用RPA的情况下CRISPR/Cas12a反应所触发的荧光信号强度。此外，LbCas12a蛋白的附带活性可持续激活长达24小时32，这有利于检测的进行。

为了鉴定病毒并可视化病毒颗粒，已应用荧光显微镜技术40,41。然而，传统显微镜在快速床旁诊断（POC）中操作繁琐且成本较高。因此，在本系统中，构建了一种低成本的便携式SPM，通过捕获图像来获取荧光信号，以实现床旁检测。这种便携式SPM的成本远低于商用酶标仪或实时PCR仪，有利于降低检测系统的搭建成本。

该平台在某些方面仍需进一步改进。当将此检测平台应用于其他DNA病毒检测时，需要重新设计RPA引物和Cas12a-crRNA序列。由于目前尚无明确的设计指南，必须通过实验评估其效率。尽管该系统已具备便携性优势，但整体尺寸仍需进一步缩小，以实现更轻便的设计。此外，由于手机摄像头在近距离拍摄时难以对焦，在获取荧光图像的过程中需要花费时间调整视野，以获得质量更佳的图像。

随着相关技术的进步及其新应用的出现，即时检测（POC）的效率将持续提升。本文介绍的方法即是一种改进示例，可通过CRISPR/Cas12a系统与SPM平台结合，并在新型人工智能辅助下，助力即时检测的发展。此外，由于crRNA具有可重新编程的特性，该集成系统还可用于识别任何DNA靶标。RPA-CRISPR/Cas12a-AI系统在DNA病原体检测的灵敏度、特异性、检测时间及可靠性方面，将在未来占据重要地位。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到国家自然科学基金 31970752、深圳市科技创新委员会 JCYJ20190809180003689、JSGG20200225150707332、JSGG20191129110812708、WDZC20200820173710001；深圳湾实验室开放基金 SZBL2020090501004；中国博士后科学基金 2020M680023；中华人民共和国海关总署 2021HK007 的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
20倍扩增OLYMPUSOPLN20X
532 nm 绿色激光器ThorlabsPL201输出功率为 0.9 mW
535 nm 截止波长chromeAT535
6x DNA 上样缓冲液Thermo scientificR0611
96孔黑色微孔板Corning Incorporated3603黑色，带透明平底
非球面透镜LubangN/A
带通滤光片SEMROCKFF01-542/27-25
Bsu DNA 聚合酶ATG BiotechnologyM103大片段
crRNASangon BiotechN/A
DNA 片段Sangon BiotechN/A
二向色镜支架RuicageN/A
二向色镜SEMROCKFF555-Di03-25x36截止波长为 535 nm
E.Z.N.A 凝胶回收试剂盒Omega BiotekD2500-02
EnGen Lba Cas12a (Cpf1)New England Biolabs (Beijing) LTDM0653T
滤光片支架RuicageN/A
荧光团-单链DNA-淬灭剂报告探针Sangon BiotechN/A5'端使用 TAMRA（羧基四甲基罗丹明）作为荧光团；3'端使用 BHQ2（黑洞淬灭剂-2）作为淬灭剂
GP32ATG BiotechnologyM104
ImageJ开源软件版本 1.53t 24从 https://imagej.nih.gov/ij/  下载
微孔板读板仪SPARK, TECANN/A
多模块梯度PCR仪LongGeneN/A
NanoDrop 2000/2000c 分光光度计Thermo ScientificND-2000
NEBuffer r2.1New England Biolabs (Beijing) LTDB6002S10x CRISPR/Cas12a 反应缓冲液
氧气等离子体处理 Electro-Technic  ProductsN/A
病原体灭活、无需核酸提取、直接用于PCR的蛋白酶K缓冲液（PINDBK）EbioPINDBK -25mL
PCR引物对Sangon BiotechN/A
PDMSDow CorningSylgard 184
RPA引物对Sangon BiotechN/A
智能手机HuaweiMate10
平移台RuicageN/A
透射式中性密度滤光片ThorlabsND40A
三胶合消色差透镜ThorlabsTRH127-020-A
UvsXATG BiotechnologyM105
UvsYATG BiotechnologyM106

参考文献

  1. Gire, S. K., et al. Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak. Science. 345 (6202), 1369-1372 (2014).
  2. The Ebola Outbreak Epidemiology Team. Outbreak of Ebola virus disease in the Democratic Republic of the Congo, April-May 2018: an epidemiological study. Lancet. 392 (10143), 213-221 (2018).
  3. Zumla, A., Hui, D. S., Perlman, S. Middle East respiratory syndrome. Lancet. 386 (9997), 995-1007 (2015).
  4. Plourde, A. R., Bloch, E. M. A literature review of Zika virus. Emerg Infect Dis. 22 (7), 1185-1192 (2016).
  5. Yuan, X., et al. Current and perspective diagnostic techniques for COVID-19. ACS Infect Dis. 6 (8), 1998-2016 (2020).
  6. Minhaj, F. S., et al. Monkeypox outbreak - nine states, May 2022. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 71 (23), 764-769 (2022).
  7. Bao, M., et al. Challenges and opportunities for clustered regularly interspaced short palindromic repeats based molecular biosensing. ACS Sens. 6 (7), 2497-2522 (2021).
  8. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  9. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
  10. Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  11. Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Zhang, F. SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Nat Protoc. 14 (10), 2986-3012 (2019).
  12. Mukama, O., et al. An ultrasensitive and specific point-of-care CRISPR/Cas12 based lateral flow biosensor for the rapid detection of nucleic acids. Biosens Bioelectron. 159, 112143(2020).
  13. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  14. Yin, L., Man, S., Ye, S., Liu, G., Ma, L. CRISPR-Cas based virus detection: Recent advances and perspectives. Biosens Bioelectron. 193, 113541(2021).
  15. Dronina, J., Bubniene, U. S., Ramanavicius, A. The application of DNA polymerases and Cas9 as representative of DNA-modifying enzymes group in DNA sensor design (review). Biosens Bioelectron. 175, 112867(2021).
  16. Fozouni, P., et al. Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy. Cell. 184 (2), 323-333.e9 (2021).
  17. Kumar, M., et al. FnCas9-based CRISPR diagnostic for rapid and accurate detection of major SARS-CoV-2 variants on a paper strip. eLife. 10, e67130(2021).
  18. Lee, R. A., et al. Ultrasensitive CRISPR-based diagnostic for field-applicable detection of Plasmodium species in symptomatic and asymptomatic malaria. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (41), 25722-25731 (2020).
  19. Ganguli, A., et al. Hands-free smartphone-based diagnostics for simultaneous detection of Zika, Chikungunya, and Dengue at point-of-care. Biomed Microdevices. 19 (4), 73(2017).
  20. Yeo, S. J., et al. Smartphone-based fluorescent diagnostic system for highly pathogenic H5N1 viruses. Theranostics. 6 (2), 231-242 (2016).
  21. von Chamier, L., et al. Democratising deep learning for microscopy with ZeroCostDL4Mic. Nat Commun. 12 (1), 2276(2021).
  22. Shiaelis, N., et al. Virus detection and identification in minutes using single-particle imaging and deep learning. ACS Nano. 17 (1), 697-710 (2020).
  23. Liu, Y., et al. Mixed-UNet: Refined class activation mapping for weakly-supervised semantic segmentation with multi-scale inference. Front. Comput. Sci. 4, 1036934(2022).
  24. Lawrimore, J., Doshi, A., Walker, B., Bloom, K. AI-assisted forward modeling of biological structures. Front Cell Dev Biol. 7, 279(2019).
  25. Yang, Y., Hu, Y., Zhang, X., Wang, S. Two-stage selective ensemble of CNN via deep tree training for medical image classification. IEEE Trans Cybern. 52 (9), 9194-9207 (2022).
  26. Zhang, R., et al. RCMNet: A deep learning model assists CAR-T therapy for leukemia. Comput Biol Med. 150, 106084(2022).
  27. Xie, Y., et al. Stroke prediction from electrocardiograms by deep neural network. Multimed Tools Appl. 80, 17291-17297 (2021).
  28. Wang, J., Zhu, H., Wang, S., Zhang, Y. -D. A review of deep learning on medical image analysis. Mobile Netw Appl. 26, 351-380 (2021).
  29. Artoni, P., et al. Deep learning of spontaneous arousal fluctuations detects early cholinergic defects across neurodevelopmental mouse models and patients. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23298-23303 (2020).
  30. Li, J., et al. DeepLearnMOR: a deep-learning framework for fluorescence image-based classification of organelle morphology. Plant Physiol. 186 (4), 1786-1799 (2021).
  31. Yosinski, J., Clune, J., Bengio, Y., Lipson, H. How transferable are features in deep neural networks. Proceedings of the 27th International Conference on Neural Information Processing Systems. 2, 3320-3328 (2014).
  32. He, Q., et al. High-throughput and all-solution phase African Swine Fever Virus (ASFV) detection using CRISPR-Cas12a and fluorescence based point-of-care system. Biosens Bioelectron. 154, 112068(2020).
  33. Krizhevsky, A., Sutskever, I., Hinton, G. E. ImageNet classification with deep convolutional neural networks. Commun. ACM. 60 (6), 84-90 (2017).
  34. Lawton, S., Viriri, S. Detection of COVID-19 from CT lung scans using transfer learning. Comput Intell Neurosci. 2021, 5527923(2021).
  35. Lei, Z., et al. Detection of frog virus 3 by integrating RPA-CRISPR/Cas12a-SPM with deep learning. ACS Omega. 8 (36), 32555-32564 (2023).
  36. Chen, Z., Huang, J., Zhang, F., Zhou, Y., Huang, H. Detection of shrimp hemocyte iridescent virus by recombinase polymerase amplification assay. Mol Cell Probes. 49, 101475(2020).
  37. Fu, X., Sun, J., Ye, Y., Zhang, Y., Sun, X. A rapid and ultrasensitive dual detection platform based on Cas12a for simultaneous detection of virulence and resistance genes of drug-resistant Salmonella. Biosens Bioelectron. 195, 113682(2022).
  38. Habimana, J. D., et al. Mechanistic insights of CRISPR/Cas nucleases for programmable targeting and early-stage diagnosis: A review. Biosens Bioelectron. 203, 114033(2022).
  39. Liang, Y., Lin, H., Zou, L., Deng, X., Tang, S. Rapid detection and tracking of Omicron variant of SARS-CoV-2 using CRISPR-Cas12a-based assay. Biosens Bioelectron. 205, 114098(2022).
  40. Sivaraman, D., Biswas, P., Cella, L. N., Yates, M. V., Chen, W. Detecting RNA viruses in living mammalian cells by fluorescence microscopy. Trends Biotechnol. 29 (7), 307-313 (2011).
  41. Wang, I. H., Burckhardt, C. J., Yakimovich, A., Greber, U. F. Imaging, tracking and computational analyses of virus entry and egress with the cytoskeleton. Viruses. 10 (4), 166(2018).

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