本实验采用腹腔注射白血病细胞的方法，在小鼠体内建立并扩增急性髓系白血病（AML）。该新方法在AML细胞的连续移植中具有良好的效果，可为在小鼠尾静脉注射操作中遇到困难或结果不一致的研究者提供一种替代方案。
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摘要
摘要
急性髓系白血病（AML）及其由持续存在的白血病干细胞（LSCs）所导致的复发，目前仍缺乏有效的新型治疗方法。为测试基于成功移植这些细胞的疗法，需建立一种实验性AML啮齿类动物模型。 通过 受体小鼠的眶后注射存在诸多挑战。本研究旨在建立一种简便、可靠且可重复的方法，通过腹腔注射途径构建稳定的急性髓系白血病（AML）小鼠模型。在本实验方案中，骨髓细胞被表达人源MLL-AF9融合癌蛋白的逆转录病毒转导。Lin阴性（Lin⁻）细胞的转导效率-）和 Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) 群体作为供体LSCs在原发性AML发展中的作用进行了测试，并采用腹腔注射作为生成AML的新方法。通过连续移植实验比较了腹腔注射与眶后注射两种方法。两者均属于Lin- 和 LSK 经人MLL-AF9病毒转导的细胞在受体小鼠的骨髓和脾脏中植入良好，导致完全成熟的急性髓系白血病（AML）。通过腹腔注射供体细胞可在连续移植后使受体小鼠成功建立AML模型，流式细胞术、qPCR及组织学分析均检测到AML细胞在受体小鼠外周血、骨髓、脾脏和肝脏中的浸润。因此，腹腔注射是一种利用供体白血病细胞连续移植诱导AML的高效方法。
引言
急性髓系白血病（AML）是一种病因多样的血液系统恶性肿瘤，预后较差1。建立AML动物模型为深入理解其复杂的异质性和发病机制奠定了基础，有助于发现新的治疗方法2。在小鼠中，白血病的发生通常通过移植表达融合癌蛋白的供体细胞来实现，其中包括混合谱系白血病（MLL）基因相关的融合蛋白，可有效诱导AML，从而模拟人类疾病3。在MLL基因相关AML的移植模型中，已有多种供体细胞来源的报道4，但对导致疾病起源的具体细胞类型仍知之甚少。
已开发出多种小鼠移植途径；与直接将突变供体细胞注入骨髓的股骨内注射不同5，利用静脉窦丛、尾静脉和颈外静脉的静脉注射已被广泛用于构建小鼠急性髓系白血病（AML）模型6,7,8,9。对于经眶后（r.o.）注射而言，存在多种固有缺陷，例如注射体积受限、技术要求高、重复操作或纠错机会少，以及可能造成眼部损伤等问题，长期以来缺乏有效替代方案，成为主要障碍
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方案
所有实验均事先获得宾夕法尼亚州立大学机构动物护理与使用委员会的批准。
1. 缓冲液与试剂的配制
- 制备添加氨苄青霉素（AP）的 LB 琼脂平板（无菌 10 cm 平板）。具体操作如下：将 10 g LB 肉汤与琼脂溶解于 400 mL 蒸馏水中，搅拌，并将体积补足至 500 mL。通过高压灭菌对溶液进行灭菌，待溶液冷却后，向其中加入 0.5 mL 氨苄青霉素（母液浓度：150 mg/mL），摇动混匀。立即在酒精灯旁，将 18 mL 溶液倒入无菌 10 cm 平板中，于室温下凝固，并将平板倒置储存。 4 °C 待后续使用。
- 制备LB培养基：将10克不含琼脂的LB粉末溶于500毫升蒸馏水中。通过高压灭菌对溶液进行消毒，待溶液冷却后，向其中加入0.5毫升氨苄青霉素（母液浓度：150毫克/毫升），振荡混匀。
- 制备流式缓冲液：将5 mL青霉素/链霉素和10 mL热灭活胎牛血清（hiFBS）加入485 mL 1x Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中。
注意：为通过加热灭活胎牛血清，请将解冻后的胎牛血清瓶置于 56 °C 水浴。确保瓶子不会翻倒或浸入水浴中。温度对于完全降解至关重要；为确保这一点，请等待温度稳定在56°C。 ˚将瓶子放入水浴后，保持37°C。每隔10分钟轻轻旋动瓶子，共三次。切勿让血清孵育超过30分钟。
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结果
比较小鼠急性髓系白血病细胞通过眼后和腹腔途径移植的效率
既往已有报道，在受体小鼠中通过眼后途径移植MLL-AF9转导的LSK细胞可成功建立1˚急性髓系白血病（AML），并通过连续移植实验证实了1˚ AML细胞具有可移植性30。本研究首次评估了使用骨髓Lin-细胞进行移植的可能性。异常白细胞增多（图2A）以及骨髓和脾脏中白血病细胞（CD45.1+）浸润增加（图2B）的结果支持使用骨髓Lin-细胞诱导生成1˚ AML的可行性。为比较疾病诱导时间，每只受体小鼠对应两只供体小鼠被实施安乐死，以分离LSK或Lin-细胞。结果显示，在移植了LSK细胞或Lin-细胞的1˚受体小鼠中，疾病潜伏期无显著差异（图2C）。
在.......
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讨论
上述研究提供了有力证据，表明Lin细胞的移植- 细胞在生成1方面与LSK细胞相当˚ 小鼠急性髓系白血病。此外，当前数据还表明，与静脉注射（或眶后注射）相比，腹腔注射是建立小鼠急性髓系白血病的一种高效且便捷的方法。
除了 LSK 细胞外，已有研究报道其他细胞群体，如粒细胞-单核细胞前体细胞（GMP）、共同淋巴样前体细胞（CLP）和共同髓系前体细胞（CMP），也可作为供体细胞用于构建不同潜伏期的 1˚ MLL-AF9 诱导型 AML 模型31,32，但目前尚缺乏定量比较以确定最优选择。在本研究中，来自相同供体小鼠的 Lin- 与 LSK 细胞在生成 1˚ MLL-AF9 诱导型 AML 方面无明显差异，原因在于转导后的髓系前体细胞（Sca-1-）亦能够启动 AML33。考虑到基于流式细胞术分选 LSK 群体所需的成本和时间，这些研究支持将 Lin<.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢宾夕法尼亚州立大学兽医与生物医学科学系的赫克研究所流式细胞术核心设施以及动物诊断实验室组织病理学核心设施提供的及时技术支持。本研究得到了美国癌症研究所（KSP）、宾夕法尼亚州立大学农业科学学院、宾夕法尼亚州立大学癌症研究所、美国农业部-国家粮食与农业研究所项目4771（编号00000005）对K.S.P.和R.F.P.的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| a-选择感受态细胞 | Bioline | BIO-85027 | |
| 氯化铵 (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| 氨苄青霉素 | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| 牛血清白蛋白 (BSA)，第五组分—低内毒素级 | Gemini bio-products | Cat# 700-102P | |
| 盐酸环丙沙星 | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM，高糖，不含谷氨酰胺 | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA，二钠盐 (EDTA-2Na)，二水合物，分子生物学级 | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| 胎牛血清 - 优质精选 | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| 全转铁蛋白，牛源 | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| 人胰岛素溶液 | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove's 改良 Dulbecco 培养基 (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-谷氨酰胺 200 mM (100×) 溶液 | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB 肉汤，Lennox 型 | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| 含琼脂的 LB 肉汤 (Miller 型) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| 小鼠抗小鼠 CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| 小鼠白细胞介素-3 (IL-3) | Gemini bio-products | Cat# 300-324P | |
| 小鼠白细胞介素-6 (IL-6) | Gemini bio-products | Cat# 300-327P | |
| 小鼠干细胞因子 (SCF) | Gemini bio-products | Cat# 300-348P | |
| 青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩 | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) 细胞 | ATCC | CRL-3214 | |
| 碳酸氢钾 (KHCO3)，颗粒状 | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| 大鼠抗小鼠 CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
| 大鼠抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| 重组小鼠 Flt3 配体 | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin 重组人纤维连接蛋白片段 | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 试剂 | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI 试剂 | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| 台盼蓝溶液，0.4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.25%)，含酚红 | Gibco | Cat# 25200-056 | |
| β-巯基乙醇 (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| 商用检测试剂盒 | |||
| EasySep 小鼠造血祖细胞分离试剂盒 | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
| 高容量 cDNA 反转录试剂盒 | Thermo Fisher | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| 质粒大提试剂盒 (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| 实验动物 | |||
| Ai14TdTomato 小鼠 | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J 小鼠 | Jackson Laboratory | Strain # 002014 | |
| CD45.2 C57BL6/J 小鼠 | Jackson Laboratory | Strain # 000664 | |
| 仪器与软件 | |||
| Adobe Illustrator | 版本 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 流式细胞仪 | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys 软件程序 | 版本 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism 版本 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 实时 PCR 系统 | Applied Biosystems | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 化学发光与荧光成像系统 | G:Box Chemi |
参考文献
- Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
- Erns....
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重印与许可
