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方法文章

人多能干细胞向胰岛素分泌型胰岛样细胞团的分化

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DOI：

10.3791/64840

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2023年6月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular & Physiological Sciences, Life Science Institute, University of British Columbia, 2School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 3STEMCELL Technologies Inc, 4Department of Surgery, University of British Columbia

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

干细胞向胰岛细胞的分化为传统的糖尿病治疗和疾病建模提供了替代方案。本文介绍了一种详细的干细胞培养方案，该方案结合商用分化试剂盒与先前已验证的方法，有助于在体外生成可分泌胰岛素的干细胞来源胰岛细胞。

摘要

将人类多能干细胞（hPSCs）分化为可分泌胰岛素的β细胞，为研究β细胞功能及糖尿病治疗提供了重要材料。然而，在获得能够充分模拟天然人类β细胞特性的干细胞来源β细胞方面，仍存在挑战。在既往研究基础上，已生成hPSC来源的胰岛样细胞，进而建立了一种可提高分化效率与一致性的实验方案。本方案在第1至第4阶段采用胰腺前体细胞试剂盒，第5至第7阶段则采用基于2014年先前发表论文所改进的方案（以下简称“R-方案”）。本方案详细描述了使用胰腺前体细胞试剂盒及直径为400 µm的微孔板生成胰腺前体细胞簇、在96孔静态悬浮体系中采用R-方案进行内分泌分化，以及 体外 人多能干细胞衍生胰岛的表征与功能评估也包含在内。该完整方案首先需要1周时间进行人多能干细胞的初始扩增，随后约5周时间获得可产生胰岛素的人多能干细胞胰岛。具备基本干细胞培养技术以及生物学检测培训经验的人员均可重复本方案。

引言

胰腺β细胞可响应血糖水平升高而分泌胰岛素。由于1型糖尿病（T1D）中β细胞遭受自身免疫破坏1，或2型糖尿病（T2D）中β细胞功能障碍2，导致胰岛素分泌不足的患者，通常需要外源性胰岛素治疗。尽管这种疗法可挽救生命，但其对血糖的调控远不如功能性β细胞动态分泌胰岛素那样精确。因此，患者常面临危及生命的低血糖事件，以及由长期高血糖波动引发的其他并发症。移植人尸体来源的胰岛可成功恢复T1D患者的严格血糖控制，但受限于胰岛供体的可获得性，以及难以纯化出适合移植的健康胰岛3,4。这一难题原则上可通过使用人多能干细胞（hPSCs）作为替代起始材料来解决。

由人多能干细胞生成分泌胰岛素的胰岛：当前策略 体外 通常旨在模拟胚胎胰腺发育过程 体内5,6这需要了解相关的信号通路，并在特定时间添加相应的可溶性因子，以模拟胚胎胰腺发育的关键阶段。胰腺发育程序始于定型内胚层的形成，该阶段以转录因子叉头盒A2（FOXA2）和Y染色体性别决定区蛋白17（SOX17）的表达为标志。7定型内胚层的连续分化涉及原始肠管的形成，并模式化为表达胰腺和十二指肠同源框1（PDX1）的后部前肠7,8,9以及上皮细胞向共同表达PDX1和NK6同源框1（NKX6.1）的胰腺前体细胞的扩展10,11.

内分泌胰岛细胞的进一步分化伴随着促内分泌主调控因子神经源素3（neurogenin-3, NGN3）的瞬时表达12，以及关键转录因子神经元分化1（neuronal differentiation 1, NEUROD1）和NK2同源框2（NK2 homeobox 2, NKX2.2）的稳定诱导13。随后，程序化生成主要的激素表达细胞，例如产生胰岛素的β细胞、产生胰高血糖素的α细胞、产生生长抑素的δ细胞以及产生胰多肽的PPY细胞。基于这些认识，以及大规模高通量药物筛选研究的发现，近年来的技术进展已能够生成含类似β细胞的人多能干细胞来源胰岛（hPSC-islets），这些细胞具备分泌胰岛素的能力14,15,16,17,18,19。

已有分步方案报道用于生成葡萄糖响应性β细胞6,14,18,19基于这些研究，本方案采用胰腺前体细胞试剂盒来生成PDX1+NKX6.1+ 平面培养中的人胰腺前体细胞，随后在微孔板中聚集成大小均一的细胞簇，并通过R-protocol在静态三维悬浮培养中进一步分化为可分泌胰岛素的人多能干细胞来源胰岛样细胞（hPSC-islets）。通过流式细胞术、免疫染色和功能评估等质量控制分析，对分化过程中的细胞进行严格表征。本文详细描述了定向分化的每一步操作，并概述了 体外 表征方法

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方案

本方案基于在无饲养层条件下对人多能干细胞（hPSC）系（包括H1、HUES4 PDXeG和Mel1 INSGFP/W）的研究。本节详细描述了具体操作步骤，并在代表性结果部分提供了Mel1 INSGFP/W分化的支持性数据。我们建议，当使用本文未提及的其他人多能干细胞系时，可能需要进一步优化条件。有关本方案中使用的所有试剂和溶液的详细信息，请参见材料表。

1. 分化培养基与溶液的制备

注意：所有待配制的溶液见表1，分化培养基见表2。

  1. 在无菌生物安全柜中准备所有细胞培养用培养基和试剂。使用前，将与细胞培养相关的溶液和基础培养基在水浴中短暂预热至 37 °C。
    ​注意：如下所述，每天新鲜配制分化培养基，加入添加剂后当日使用。或者，根据生产商说明书，胰腺前体细胞试剂盒也支持预先配制较大体积的培养基，可在数天内分次使用。两种培养基配制方法均有效。请注意，不建议将培养基长时间置于水浴中。若每日新鲜配制培养基，建议将添加剂分装保存，以避免反复冻融。

2. 将人多能干细胞分化为胰腺前体细胞

  1. 将未分化的hPSCs在Matrigel包被的培养容器中，使用mTeSR1完全培养基进行培养，并每日更换培养基。在维持培养期间，当细胞汇合度达到约70%时，每3-4天使用细胞解离试剂按照制造商说明书进行传代。为启动分化，将细胞解离为单细胞，并接种至6孔或12孔组织培养处理板（每孔培养基体积分别为2 mL或1 mL）。
    注：有关内胚层基础培养基及其分装保存的说明，请参见表1。
  2. 使用hESC认证的Matrigel（按制造商说明书推荐，用预冷的DMEM/F12稀释）预包被培养孔，并将培养板置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育30分钟。
  3. 将Matrigel包被的培养板转移至室温（需在3小时内使用）。
  4. 吸除hPSC培养物中的废弃培养基，用DPBS冲洗一次。在37 °C下使用细胞解离酶将hPSC培养物解离为单细胞，持续3-5分钟。加入预温的DMEM/F12培养基冲洗细胞，转移至15 mL或50 mL锥形管中，以300 × g离心5分钟。
  5. 用干细胞完全培养基重悬细胞沉淀，并添加10 µM Y-27632，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行活细胞（台盼蓝阴性）计数。吸除稀释的Matrigel，立即将活细胞以1.60–1.80 × 105/cm2的密度接种至Matrigel包被的培养孔中，于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中培养24小时。随后进入第1阶段。
    注：此接种密度可使起始汇合度约为95%。根据制造商说明书，推荐接种密度为2.6 × 105/cm2。建议测试不同接种密度以确定特定细胞系的最佳值，并检测细胞活力。若细胞活力低于80%，则不应继续进行分化。细胞活力低下可能由收获过程中消化过度、吹打过度，或接种前细胞在DMEM/F12培养基中放置时间过长所致。
  6. 在第1阶段第1天，将内胚层基础培养基在37 °C水浴中短暂预热，并解冻补充剂MR和CJ。通过将补充剂MR和CJ加入内胚层基础培养基中配制第1A阶段培养基。充分混匀后立即使用。
  7. 吸除各孔中的废弃培养基，加入第1A阶段培养基，并在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育24小时。
    ​注：无需洗涤步骤。在更换培养基前，轻轻摇动培养板以去除未贴壁的细胞。更换培养基时，避免移液枪头接触孔底，且添加培养基时动作应轻柔，以防止破坏单层细胞结构。
  8. 在第1阶段第2天，将内胚层基础培养基在37 °C水浴中短暂预热，并解冻补充剂CJ。通过将补充剂CJ加入内胚层基础培养基中配制第1B阶段培养基。充分混匀后立即使用。
  9. 吸除各孔中的废弃培养基，加入第1B阶段培养基，并在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育24小时。
  10. 在第1阶段第3天，重复步骤2.8–2.9。随后进入第2阶段。
  11. 在第2阶段第1天，将胰腺第2–4阶段基础培养基在37 °C水浴中预热，并解冻补充剂2A和2B。通过将补充剂2A和2B加入胰腺第2–4阶段基础培养基中配制第2A阶段培养基。充分混匀后立即使用。
  12. 吸除各孔中的废弃培养基，加入第2A阶段培养基，并在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育24小时。
  13. 在第2阶段第2天，将胰腺第2–4阶段基础培养基在37 °C水浴中预热，并解冻补充剂2B。通过将补充剂2B加入胰腺第2–4阶段基础培养基中配制第2B阶段培养基。充分混匀后立即使用。
  14. 吸除各孔中的废弃培养基，加入第2B阶段培养基，并在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育24小时。
  15. 在第2阶段第3天，重复步骤2.13–2.14。随后进入第3阶段。
  16. 在第3阶段第1天，将胰腺第2–4阶段基础培养基在37 °C水浴中预热，并解冻补充剂3。通过将补充剂3加入胰腺第2–4阶段基础培养基中配制第3阶段培养基。充分混匀后立即使用。
  17. 吸除各孔中的废弃培养基，加入第3阶段培养基，并在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育24小时。
  18. 在第3阶段第2天和第3天，重复步骤2.16–2.17。随后进入第4阶段。
  19. 在第4阶段第1天，将胰腺第2–4阶段基础培养基在37 °C水浴中预热，并解冻补充剂4。通过将补充剂4加入胰腺第2–4阶段基础培养基中配制第4阶段培养基。充分混匀后立即使用。
  20. 吸除各孔中的废弃培养基，加入第4阶段培养基，并在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育24小时。
  21. 在第4阶段第2天至第4天，重复步骤2.19–2.20。随后进入聚集体形成步骤。

3. 使用直径为 400 µm 的微孔板将细胞聚集成胰腺前体细胞簇

  1. 在第4阶段第5天，用500 µL抗黏附冲洗液预处理每个微孔（例如24孔板格式）。
  2. 准备一个配平板，将微孔板在1,300 × g 条件下离心5分钟。
    注意：在显微镜下检查微孔板，确保微孔中无残留气泡。若仍有气泡滞留在微孔中，需再次离心5分钟。
  3. 吸除各孔中的抗黏附冲洗液，用1 mL DPBS冲洗一次。吸除DPBS后，向每孔加入1 mL聚集培养基。
  4. 移除胰腺前体细胞培养物中的用过的培养基，用DPBS洗涤一次。使用解离试剂在37 °C条件下将细胞解离为单细胞，持续10–12分钟。用预热的DMEM/F12将细胞冲洗下来，转移至离心管中，在300 × g 条件下离心5分钟。
  5. 用聚集培养基重悬细胞沉淀，并进行活细胞计数。每孔接种总计240万至360万个细胞（即每微孔2,000–3,000个细胞），并向每孔添加聚集培养基至终体积为2 mL。
  6. 使用P1000移液器枪头轻柔地将细胞上下吹打数次，以确保细胞在孔内均匀分布。操作过程中避免在微孔中引入气泡。将微孔板在300 × g 条件下离心5分钟，使细胞沉降至微孔中。将微孔板置于37 °C、5% CO2 的加湿培养箱中培养24小时以形成聚集体，随后进入第5–7阶段的分化。
    ​注意：在聚集体形成期间应避免扰动微孔板。为获得最佳聚集体形成效果，可能需要长达48小时的培养时间。

4. 将试剂盒来源的胰腺前体细胞簇分化为人多能干细胞来源的胰岛

  1. 在第5阶段第1天，将第5-7阶段基础培养基置于37 °C水浴中预热，并解冻添加剂（见表1和表2）。通过向第5-7阶段基础培养基中添加添加剂（达到最终工作浓度）来配制第5阶段培养基。充分混匀后立即使用。
  2. 在细胞聚集体形成后，使用P1000移液器枪头轻轻反复吹打聚集体数次，使未聚集的细胞悬浮。让聚集体依靠重力自然沉降（静置约1分钟）。尽可能小心地吸除上清废液（含有悬浮的未聚集细胞），避免吸走聚集体。
  3. 用力将新鲜的第5阶段培养基加入微孔板表面，以使聚集体从微孔中脱离。将聚集体转移至超低吸附（ULA）6孔板中。用第5阶段培养基冲洗一次，以完全回收微孔中的所有聚集体。
  4. 收集ULA 6孔板中的全部聚集体，用第5阶段培养基重悬，并调整密度至每100 µL含20个聚集体（例如，预计每个孔可回收约1,200个聚集体；将1,200个聚集体重悬于6 mL第5阶段培养基中）。使用多通道移液器向ULA平底96孔板的每个孔中加入50 µL第5阶段培养基。向四角和边缘孔中加入200 µL DPBS。
    注意：避免在边缘孔中培养聚集体，因其更易发生蒸发；否则，应使用专为减少边缘蒸发设计的96孔板（例如带内置护沟的96孔板），或将培养板置于高湿度微环境细胞培养孵育箱中。
  5. 向ULA平底96孔板的每孔中加入100 µL聚集体重悬液，使每孔总体积为150 µL，平均含20个聚集体。
    注意：每次向96孔板加样前，均需轻轻混匀聚集体重悬液。
  6. 将培养板置于水平台面上，放入加湿的37 °C、5% CO2孵育箱中培养24小时。
  7. 在第5阶段第2天，按照步骤4.1的方法配制第5阶段培养基。
  8. 使用多通道移液器从每孔中移除约90 µL废培养基，并更换为100 µL第5阶段培养基。
  9. 在第5阶段第3天，重复步骤4.7–4.8。随后进入第6阶段。
  10. 在第6阶段第1天，将第5-7阶段基础培养基置于37 °C水浴中预热，并解冻添加剂（见表1和表2）。通过向第5-7阶段基础培养基中添加添加剂（达到最终工作浓度）来配制第6阶段培养基。充分混匀后立即使用。
  11. 使用多通道移液器从每孔中移除约90 µL废培养基，并更换为100 µL第6阶段培养基。
  12. 在第6阶段第2天至第8天，重复步骤4.10–4.11。随后进入第7阶段。
  13. 在第7阶段第1天，将第5-7阶段基础培养基置于37 °C水浴中预热，并解冻添加剂（见表1和表2）。通过向第5-7阶段基础培养基中添加添加剂（达到最终工作浓度）来配制第7阶段培养基。充分混匀后立即使用。
  14. 使用多通道移液器从每孔中移除约90 µL废培养基，并更换为100 µL第7阶段培养基。
  15. 在第7阶段第2天至第12天，重复步骤4.13–4.14。随后进行体外表征分析。

5. 流式细胞术分析

  1. 移除培养基，并用DPBS洗涤一次。使用解离试剂在37 °C孵育10–12分钟，将培养物（平面型前体细胞或分化中的细胞簇）解离为单细胞。用FACS缓冲液冲洗后，在300 × g离心5分钟。
  2. 将细胞沉淀重悬于FACS缓冲液中并进行细胞计数。在300 × g离心5分钟。将单细胞重悬于500 µL固定/破膜缓冲液中，在室温孵育10分钟。
    注意：使用前将固定/破膜缓冲液恢复至室温。该缓冲液含有甲醛（PFA），请在通风橱中小心操作，并根据机构规定妥善处理。
  3. 在500 × g离心3分钟，用500 µL 1×破膜/洗涤缓冲液洗涤两次，然后重悬于300 µL 1×破膜/洗涤缓冲液中。将100 µL单细胞悬液（每份含2.5–3 × 105个细胞）分别转移至三个微量离心管中，用于未染色对照、同型对照和抗体染色（抗体样本及稀释信息见材料表）。室温孵育45分钟，并用铝箔包裹避光。
  4. 在500 × g离心3分钟，用500 µL 1×破膜/洗涤缓冲液洗涤两次。将样品重悬于100 µL FACS缓冲液中，并使用流式细胞仪及配套软件（例如FlowJo）分析染色细胞（特定阶段标志物的胞内染色信息见材料表）。
    ​注意：若样品不能立即检测，请避光保存于4°C。门控策略如下：首先根据散射特性（FSC-A和SSC-A）设门以去除细胞碎片，再结合FSC-A与FSC-宽度参数识别单细胞群体。阳性与阴性门控的设定依据干细胞对照和/或未染色对照、同型对照来确定。

6. 全胚胎免疫染色

  1. 在微量离心管中收集细胞簇，静置使其自然沉降。吸除废液，并用 1 mL 磷酸盐缓冲液（含钙和镁）清洗一次。加入 1 mL 4% 多聚甲醛，在 4°C 下固定过夜。
  2. 用 PBST 清洗一次，将 20–30 个细胞簇置于含 0.3% TritonX-100 的 500 µL 溶液中，在室温下于倾斜摇床（倾斜角度适宜）孵育至少 6 小时进行通透处理。
    注：对于较大的细胞簇，可能需要更长的通透时间（最长可达 24 小时）。
  3. 将细胞簇在 100 µL 封闭缓冲液中室温孵育 1 小时（置于倾斜摇床上）。移除封闭液后，加入 100 µL 用抗体稀释缓冲液稀释的一抗溶液，在室温下于倾斜摇床上孵育过夜。
    注：若成像时背景较强，建议在 4 °C 下孵育一抗。
  4. 在倾斜摇床上用 500 µL PBST 彻底清洗 3 次，每次 30 分钟（倾斜角度设为 8，转速设为 20）。
  5. 加入 100 µL 用抗体稀释缓冲液稀释的二抗溶液，在室温下于倾斜摇床上孵育过夜。用铝箔包裹离心管，避光操作。
    注：若成像时背景较强，建议在 4 °C 下孵育二抗。
  6. 用 500 µL PBST 清洗一次，加入 100 µL DAPI 染色液（DAPI 浓度为 10 µg/mL，溶于 PBST），室温避光染色 10–15 分钟。用铝箔包裹，防止光照。
  7. 在倾斜摇床上用 500 µL PBST 彻底清洗 3 次，每次 30 分钟。清洗过程中需用铝箔包裹离心管，避光操作。
  8. 按照制造商说明书及已发表的实验方案20,21，将细胞簇固定于预先涂有组织粘附剂的成像腔室载玻片（见材料表）上。
  9. 使用组织透明介质（含 80% 甘油的 PBS 溶液）封片，并加盖盖玻片。避光保存，直至进行共聚焦显微成像。
    ​注：若样品不能立即成像，请避光保存于 4 °C 环境中。

7. 静态GSIS检测

  1. 将低葡萄糖克雷布斯-林格碳酸氢盐（3.3G KRB）缓冲液、高葡萄糖（16.7G）KRB缓冲液以及30 mM KCl KRB缓冲液在37 °C水浴中预热。
  2. 手工挑选大小一致的胰岛细胞团簇，用2 mL预热的3.3G KRB缓冲液冲洗。将细胞团簇转移至未经组织培养处理的6孔板中，每孔加入2 mL预热的3.3G KRB缓冲液，在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中平衡孵育1小时。
  3. 平衡完成后，在检测室（见材料表）中加入100 µL预热的3.3G KRB缓冲液。手工挑选5个细胞团簇并转移至检测室中央，在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育30分钟。
    注意：转移细胞团簇时应使用10 µL枪头，尽量减少携带的液体体积。
  4. 小心收集约100 µL上清液，于-30 °C保存，用于后续基础胰岛素分泌量的测定（见步骤7.9）。此步骤中不得使细胞团簇干燥或丢失。立即向检测室中加入100 µL预热的16.7G KRB缓冲液，并将同一组细胞团簇在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中继续孵育30分钟。
  5. 小心收集约100 µL上清液，于-30 °C保存，用于后续葡萄糖刺激的胰岛素分泌量测定（见步骤7.9）。立即向检测室中加入100 µL预热的30 mM KCl KRB缓冲液，并将同一组细胞团簇在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中继续孵育30分钟。
  6. 小心收集约100 µL上清液，于-30 °C保存，用于后续KCl刺激的胰岛素分泌量测定（见步骤7.9）。立即向检测室中加入100 µL RIPA裂解缓冲液，并将含有全部5个细胞团簇的裂解液转移至微量离心管中。
  7. （可选）使用P200移液枪头剧烈吹打，手动破碎细胞团簇。涡旋振荡30秒，冰上孵育30分钟，再进行30秒涡旋振荡。
    注意：通过充分涡旋及足够的冰上孵育时间，确保细胞完全裂解。
  8. 以8,000 × g离心1分钟。收集上清液，于-30 °C保存，用于后续总胰岛素含量的测定（见步骤7.9）。
  9. 根据试剂盒制造商说明书及已发表的实验方案20,22，使用人胰岛素ELISA试剂盒检测上清液样品中的人胰岛素含量。
    注意：避免上清液样品反复冻融。经历超过三次冻融循环的样品不应再用于检测。

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结果

我们开发了一种七步法混合策略，用于将干细胞分化为可分泌胰岛素的人多能干细胞来源的胰岛（hPSC-islets）。该策略在前四个阶段采用胰腺前体细胞试剂盒进行平面培养，随后基于先前报道的方法改进并实施后续步骤。6 在静态悬浮培养条件下进行最后三个阶段（图1）。根据本方案，在细胞接种后24小时（第0阶段）确保培养物达到接近完全汇合（90%–100%）对于大多数hPSC系的有效分化起始至关重要（图2A）。强烈建议测试不同的接种密度，以确定特定细胞系的最佳培养条件。在第1阶段培养期间，由于存在悬浮的死细胞，培养基可能会呈现浑浊状态，这在此阶段较为常见。只要贴壁细胞已完全覆盖培养容器表面，该现象不会影响试剂盒的分化效率。在第2至第4阶段，随着细胞增殖和细胞死亡减少，单层细胞逐渐变得更加致密，耗尽的培养基也不再像第1阶段那样浑浊（图2A）。如使用胰岛素报告基因 Mel1 INS 所示GFP/W hESC...

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讨论

本文描述了一种七阶段杂交方案，可在培养40天内生成能够在葡萄糖刺激下分泌胰岛素的人多能干细胞胰岛 体外在这些多个步骤中，高效诱导定型内胚层被认为对最终的分化结果具有重要的起始作用18,27,28. 根据制造商的操作说明，接种密度为 2.6 × 105/cm2 建议启动分化，细胞在第1阶段培养基中培养2天。为确保细胞在第1天达到接近汇合状态（90%-100%），我们强烈建议在使用新的hPSC细胞系时测试接种密度，因为最佳接种密度可能有所不同。例如，在我们实验室测试的三个hPSC细胞系中，接种密度为1.6-1.80 × 105/cm2，而不是 2.60 × 105/cm2，被确定为最佳接种密度。将第1阶段的培养时间从2天延长至3天，并在第1B阶段培养基中额外培养1天，可提高FOXA2的纯度+

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披露

Timothy J. Kieffer 在撰写本文期间是 ViaCyte 的员工。其他作者声明无竞争利益。

致谢

我们衷心感谢 STEMCELL Technologies、Michael Smith Health Research BC、干细胞网络（Stem Cell Network）、JDRF 以及加拿大卫生研究院（Canadian Institutes of Health Research）提供的支持。Jia Zhao 和 Shenghui Liang 是 Michael Smith Health Research BC 培训生奖的获得者。Mitchell J.S. Braam 是 Mitacs Accelerate 博士后奖学金的获得者。Diepiriye G. Iworima 是亚历山大·格拉汉姆·贝尔加拿大研究生奖学金以及加拿大大学妇女联合会 1989 年纪念埃科尔理工学院奖（CFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Award）的获得者。我们诚挚感谢来自 MCRI 及莫纳什大学（Monash University）的 Edouard G. Stanley 博士提供 Mel1 INS GFP/W 细胞系，以及阿尔伯塔糖尿病研究所胰岛核心实验室（Alberta Diabetes Institute Islet Core）在人胰岛的分离与分发方面提供的支持。我们同时感谢不列颠哥伦比亚大学生命科学研究所成像与流式细胞术平台（Life Sciences Institute Imaging and Flow Cytometry facilities at the University of British Columbia）提供的技术支持。图 1 使用 BioRender.com 制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸（T3）SigmaT6397甲状腺激素
4% PFA 溶液Santa Cruz Biotechnologysc-281692应在通风橱中操作
96孔超低吸附平底板Corning Costar (VWR)CLS3474平底；用于最后三个阶段的静态悬浮培养
AccutaseSTEMCELL Technologies07920第4阶段细胞的解离试剂
Aggrewell400 板STEMCELL Technologies34415直径为 400 µm 的微孔板
Aggrewell800 板STEMCELL Technologies34815直径为 800 µm 的微孔板
Alexa Fluor 488 山羊抗人 FOXA2（山羊 IgG）R&D SystemsIC2400G流式细胞术中按 1:100 稀释；用于检测第1阶段细胞
Alexa Fluor 488 山羊 IgG 同型对照R&D SystemsIC108G流式细胞术中按 1:100 稀释
Alexa Fluor 488 小鼠抗人 SST（小鼠 IgG2B）BD Sciences566032流式细胞术中按 1:250 稀释；用于检测第7阶段细胞
Alexa Fluor 488 小鼠 IgG2B 同型对照R&D SystemsIC0041G流式细胞术中按 1:500 稀释
Alexa Fluor 647 小鼠抗人 C-肽（小鼠 IgG1κ）BD Pharmingen565831流式细胞术中按 1:2,000 稀释；用于检测第7阶段细胞
Alexa Fluor 647 小鼠抗人 INS（小鼠 IgG1κ）BD Sciences565689流式细胞术中按 1:2,000 稀释
Alexa Fluor 647 小鼠抗人 NKX6.1（小鼠 IgG1κ）BD Sciences563338流式细胞术中按 1:33 稀释；用于检测第4阶段细胞
Alexa Fluor 647 小鼠抗人 SOX17（小鼠 IgG1κ）BD Sciences562594流式细胞术中按 1:50 稀释；用于检测第1阶段细胞
Alexa Fluor 647 小鼠 IgG1κ 同型对照BD Sciences557714流式细胞术中按 1:50 稀释
ALK5i IICayman Chemicals14794TGF-β 信号通路抑制剂
Anti-Adherence Rinsing Solution STEMCELL Technologies7010微孔清洗液
检测腔室CellvisD35-10-1-N用于静态葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）实验和共聚焦成像
牛血清白蛋白（BSA）Thermo Fisher ScientificBP1600-100用于免疫染色程序
CK19 抗体DAKOM0888整体免疫荧光中按 1:50 稀释
D-葡萄糖SigmaG8769培养基添加剂
DAPISigmaD9542用于细胞核复染
DMEM/F12, HEPESThermo Fisher Scientific11330032基质稀释液
驴抗山羊 Alexa Fluor 555Life technologiesA21432整体免疫荧光中按 1:500 稀释
驴抗山羊 Alexa Fluor 647Life technologiesA21447整体免疫荧光中按 1:500 稀释
驴抗小鼠 Alexa Fluor 555Life technologiesA31570整体免疫荧光中按 1:500 稀释
驴抗小鼠 Alexa Fluor 647Life technologiesA31571整体免疫荧光中按 1:500 稀释
驴抗兔 Alexa Fluor 555Life technologiesA31572整体免疫荧光中按 1:500 稀释
驴抗兔 Alexa Fluor 647Life technologiesA31573整体免疫荧光中按 1:500 稀释
驴抗绵羊 Alexa Fluor 647Life technologiesA21448整体免疫荧光中按 1:500 稀释
DPBSSigmaD8537不含 Ca2+ 和 Mg2+
ELISA，胰岛素，人源Alpco80-INSHU-E01.1用于人胰岛素测定
游离脂肪酸 BSAProliant68700培养基添加剂
固定和通透溶液试剂盒BD Sciences554714包含 Fix/Perm 和 10x Perm/Wash 溶液
温和细胞解离试剂STEMCELL Technologies7174用于维持培养期间 hPSCs 的团块传代
胰高血糖素抗体SigmaG2654整体免疫荧光中按 1:400 稀释
GLUT1 抗体Thermo Fisher ScientificPA1-37782整体免疫荧光中按 1:200 稀释
GlutaMAX-I（100x）Gibco35050061L-谷氨酰胺补充剂
甘油Thermo Fisher ScientificG33-4用于组织透明化和封片
GSi XXSigma Millipore565789Notch 抑制剂
肝素SigmaH3149培养基添加剂
ITS-X（100x）Thermo Fisher Scientific51500056胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺；培养基添加剂
LDN193189 STEMCELL Technologies72147BMP 拮抗剂
MAFA 抗体Abcamab26405整体免疫荧光中按 1:200 稀释
Matrigel，hESC 级别Thermo Fisher Scientific08-774-552用于血管表面包被的细胞外基质
MCDB131 培养基Life technologies10372019基础培养基
mTeSR1 完全试剂盒STEMCELL Technologies85850包含干细胞培养基和 5x 补充剂
N-Cys（N-乙酰半胱氨酸）SigmaA9165抗氧化剂
NaHCO3SigmaS6297培养基添加剂
NEUROD1 抗体R&D SystemsAF2746整体免疫荧光中按 1:20 稀释
NKX6.1 抗体DSHBF55A12-c整体免疫荧光中按 1:50 稀释
胰多肽抗体R&D SystemsAF6297整体免疫荧光中按 1:200 稀释
PBSSigmaD8662含 Ca2+ 和 Mg2+
PDX1 抗体Abcamab47267整体免疫荧光中按 1:200 稀释
PE 小鼠抗人 GCG（小鼠 IgG1κ）BD Sciences565860流式细胞术中按 1:2,000 稀释；用于检测第7阶段细胞
PE 小鼠抗人 NKX6.1（小鼠 IgG1k）BD Sciences563023流式细胞术中按 1:250 稀释
PE 小鼠抗人 PDX1（小鼠 IgG1k）BD Sciences562161流式细胞术中按 1:200 稀释；用于检测第4阶段细胞
PE 小鼠 IgG1κ 同型对照BD Sciences554680流式细胞术中按 1:2,000 稀释
PE 小鼠抗人嗜铬粒蛋白 A（CHGA，小鼠 IgG1k）BD Sciences564563流式细胞术中按 1:200 稀释
R428 Cayman Chemicals21523AXL 酪氨酸激酶抑制剂
全反式视黄酸SigmaR2625对光敏感
RIPA 裂解缓冲液，10xSigma20-188用于激素提取
SANT-1SigmaS4572SHH 抑制剂
SLC18A1 抗体SigmaHPA063797整体免疫荧光中按 1:200 稀释
生长抑素抗体SigmaHPA019472整体免疫荧光中按 1:100 稀释
STEMdiff 胰腺前体细胞试剂盒STEMCELL Technologies05120包含基础培养基和补充剂
突触素抗体NovusNB120-16659整体免疫荧光中按 1:25 稀释
Triton X-100SigmaX100用于通透处理
Trolox Sigma Millipore648471维生素 E 类似物
TrypLE 酶快速型Life technologies12604-021用于 hPSCs 单细胞传代的细胞解离酶试剂
胰蛋白酶1/2/3 抗体R&D SystemsAF3586整体免疫荧光中按 1:25 稀释
Y-27632STEMCELL Technologies72304ROCK 抑制剂
硫酸锌SigmaZ0251培养基添加剂

参考文献

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PDX1 NKX6 1
人多能干细胞向胰岛素分泌型胰岛样细胞团的分化
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