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方法文章

牙周炎的诱导 通过 大鼠模型中结扎联合脂多糖注射的方法

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DOI：

10.3791/64842

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2023年2月17日

 ,  ,  ,  , 
1Group of Cell Therapy and Tissue Engineering, Research Institute on Health Sciences (IUNICS), University of the Balearic Islands (UIB), 2Balearic Islands Health Research Institute (IdISBa), 3Preclinical Research Department, Labo'Life España, 4Departament de Biologia Fonamental i Ciències de la Salut, UIB, 5ADEMA School of Dentistry, UIB

本文内容

摘要

本研究介绍了一种诱导大鼠牙周炎的动物模型 通过 一种保留性结扎联合重复注射源自脂多糖的治疗方法 牙龈卟啉单胞菌，持续14天作用于上颌第一磨牙周围。结扎联合LPS注射技术可有效诱导牙周炎，导致牙槽骨吸收和炎症反应。

摘要

牙周炎（PD）是一种高度流行的慢性免疫炎症性疾病，影响牙周组织，导致牙龈软组织、牙周膜、牙骨质和牙槽骨的丧失。本研究描述了一种在大鼠中诱导牙周炎的简便方法。我们提供了详细的步骤，介绍如何在上颌第一磨牙（M1）周围放置结扎丝模型，并在M1的近中腭侧联合注射来自牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）的脂多糖（LPS）。牙周炎诱导持续14天，以促进细菌生物膜的积聚和炎症反应。为验证该动物模型的有效性，通过免疫测定法检测龈沟液（GCF）中关键炎症介质IL-1β的水平，并利用锥形束计算机断层扫描（CBCT）计算牙槽骨吸收程度。该技术在实验第14天结束时有效诱导了牙龈退缩、牙槽骨丧失以及GCF中IL-1β水平的升高。该方法能够有效诱导牙周炎，因此可用于牙周炎疾病进展机制及未来潜在治疗方法的相关研究。

引言

牙周炎（PD）是全球第六大最常见的公共卫生问题，影响约总人口的11%，是一种进展性、不可逆且具有破坏性的牙周病形式1,2。PD是一种累及牙龈和牙周组织的炎症过程，可导致牙龈退缩、结合上皮向根方迁移并形成牙周袋，以及牙槽骨丧失3。此外，PD还与多种全身性疾病相关，包括心血管疾病、肥胖、糖尿病和类风湿性关节炎，其中环境因素和宿主特异性因素起着重要作用4,5。

因此，牙周病（PD）是一种多因素疾病，主要由微生物菌斑的积聚引发——这是微生物群落失衡的结果——以及宿主对牙周致病菌产生过度的免疫反应，从而导致牙周组织的破坏4,6。在多种牙周致病菌中，革兰氏阴性厌氧菌Porphyromonas gingivalis是牙周病的关键病原体之一4。P. gingivalis细胞壁中含有复杂的脂多糖（LPS），这种分子可诱导多形核白细胞浸润和炎症牙周组织中的血管扩张7。这会引发炎症介质的产生，如白细胞介素1（IL-1）、IL-6和IL-8、肿瘤坏死因子（TNF）或前列腺素，进而激活破骨细胞并导致骨吸收，最终造成组织破坏和牙齿脱落3。

动物模型具有多种优势，其中包括能够模拟人体内类似的细胞复杂性，或比在塑料表面进行且细胞类型有限的体外（in vitro）研究更具准确性8。为了在体内（in vivo）实验性地建立帕金森病（PD）模型，已使用了多种动物物种，如非人灵长类、狗、猪、雪貂、兔子、小鼠和大鼠9。然而，大鼠是研究PD发病机制最为广泛使用的动物模型，因其成本低廉且易于操作10。大鼠的牙龈组织在结构上与人类牙龈组织相似，具有浅表的龈沟以及附着于牙齿表面的结合上皮。此外，与人类相似，结合上皮有助于细菌、异物以及炎性细胞渗出物的通过9。

在大鼠中诱导牙周病（PD）最常报道的实验模型之一是在牙齿周围放置结扎丝，该方法虽技术上具有挑战性，但结果可靠10。结扎丝的放置可促进牙菌斑和细菌的积聚，导致龈沟内菌群失调，从而引发牙周组织的炎症与破坏11。在此大鼠模型中，牙周附着丧失和牙槽骨吸收可能在7天内发生8。

另一种用于牙周病（PD）的动物模型是将LPS注射到牙龈组织中。该方法可刺激破骨细胞生成和骨质流失。此模型的组织病理学特征与人类已形成的牙周病相似，表现为促炎性细胞因子水平升高、胶原降解以及牙槽骨吸收6，8。

因此，本研究旨在描述一种基于牙龈卟啉单胞菌脂多糖（P. gingivalis-LPS，Pg-LPS）注射并结合在上颌第一磨牙（M1）周围放置结扎线技术的简单大鼠实验性牙周病模型。该模型具有与人类牙周病相似的特征，可用于研究疾病进展机制及未来可能的治疗方法。

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方案

注意：本研究的实验方案已获巴利阿里群岛健康研究所动物实验伦理委员会（CEEA-UIB；参考编号 163/03/21）批准。

1. 动物麻醉与实验准备

  1. 手术前对所有外科器械（铝制开口器、牙科探针、金刚石刀头、手术剪、显微钳、显微持针器、Hollenback雕刻刀、骨膜显微剥离器和显微外科剪）进行灭菌处理（135 °C，5分钟）。
  2. 按照所述方法，在无菌条件下配制该实验步骤所需的所有溶液。
    1. 配制氯胺酮（60 mg/mL）与赛拉嗪（8 mg/mL）混合溶液：将1.6 mL氯胺酮与1 mL赛拉嗪溶于磷酸盐缓冲液（PBS）/生理盐水中。将该储备液储存于4 °C。
    2. 将阿替美唑用PBS/生理盐水稀释至终浓度为0.25 mg/mL。将储备液储存于4 °C。
    3. 将丁丙诺啡用PBS/生理盐水稀释至终浓度为0.03 mg/mL。将储备液储存于4 °C。
    4. 制备1 mL的 Pg- 酪蛋白酸钠（1 mg/mL）溶于无菌生理盐水中。将原液储存于 -20 °C。
  3. 实验中使用12周龄、手术时体重为210–350 g的雌性和雄性Wistar大鼠。将动物分组饲养于适宜且环境条件恒定的环境中（20–24 °C，12小时光照-黑暗循环），自由摄取食物和标准水 随意摄取.
  4. 为诱导麻醉，称量大鼠体重，并使用25 G无菌皮下注射针头和1 mL注射器，按80/10 mg/kg的剂量腹腔注射（IP）氯胺酮/赛拉嗪混合物。
  5. 大鼠麻醉后，将其仰卧于加热的手术平台上；术中应覆盖动物身体以防止热量散失。
    注意：在操作过程中，通过观察足底反射的消失以及监测生命体征来评估麻醉深度。必要时，可使用小型鼻罩以100%氧气中含2%异氟烷维持麻醉。麻醉诱导后，应在双眼涂抹无菌眼膏，以保护角膜并防止干燥。 
  6. 在操作过程中，使用小型鼻罩给予100%氧气，并通过脉搏血氧仪监测脉搏率和血氧饱和度。
    注意：若血氧饱和度和脉搏率分别低于95%和190次/分钟，应立即停止操作，将动物置于侧卧位，直至各项指标恢复至正常水平。
  7. 使用铝制开口器固定于大鼠上下门齿处以撑开鼠嘴，同时牵拉舌头，使上颌骨和下颌骨稳定于张开且便于操作的位置，从而暴露下颌磨牙以便操作。
    注意：若需将动物置于侧卧位，应在改变其体位前移除开口器，以利于恢复。动物麻醉后，在手术前采集龈沟液（GCF）（基础状态样本）（第0天）。
  8. 按照以下步骤收集GCF：
    1. 将动物仰卧于手术台上，使用铝制开口器固定上颌和下颌，使其保持张开状态。
    2. 使用共四个（每颗第一磨牙M1使用两个）30号吸水纸尖（直径0.03 cm，长度3 cm），将其插入M1近中腭侧龈沟（牙龈上皮与邻近釉质之间的间隙）直至遇到轻微阻力，每个纸尖在原位保留30秒后立即取出。
    3. 收集后，立即将纸尖转移至塑料管中，并于 -80 °C 保存直至进行检测。

2. 固位结扎技术与龈内 Pg -脂多糖注射

注意：使用显微外科器械，在双侧上颌第一磨牙（M1）的龈沟内放置无菌编织丝线结扎线（5/0），并在腭侧表面以外科结固定，从而建立结扎模型（第0天）。所用的显微外科器械包括显微外科钳、显微持针器、Hollenback挖匙、骨膜显微外科剥离器和显微外科剪刀。同时使用带LED光源的手术放大镜（3.6倍放大）。

  1. 将缝线的远端置于牙列的腭侧，将缝线的近端插入第一上颌磨牙（M1）与第二上颌磨牙（M2）之间的邻接点。
  2. 使用骨膜显微外科剥离器将缝线置入龈沟内。非常小心地将结扎线绕过M1的颊侧表面，因为该水平的组织附着龈区域较窄。在腭侧，确保将缝线两端拉紧，以使其完全进入龈沟。
    注意：若在M1与M2之间插入缝线时遇到阻力，可使用牙科探针和金刚石尖钻头略微打开邻接点。
  3. 用外科结打结并尽可能剪短线尾，将结埋入龈沟内。
    注意：手术器械尖端可能造成口腔组织创伤和出血。准备小段纱布或棉签以清除口腔内的血液，并施加压力以止血。采用显微外科技术进行细致的软组织管理，可最大限度减少手术并发症并降低组织损伤。
  4. 结扎完成后，使用25 G无菌注射针头和1 mL注射器，将40 µL溶于无菌生理盐水中的Pg-LPS注射至M1近中腭侧双侧的牙周下组织（牙根或牙颈部与牙龈边缘之间）（第0天）。

3. 实验步骤的结束

  1. 在结扎定位和 Pg-LPS 应用后，使大鼠脱离手术状态，并将其置于清洁的单独笼具中，在保温灯下饲养。
  2. 使用 25 G 无菌皮下注射针头和 1 mL 注射器，皮下注射（SC）拮抗剂 Atipamezole (0.5 mg/kg) 。
  3. 为缓解疼痛，皮下注射 0.03 mg/kg 的 Buprenorphine。
  4. 监测动物恢复情况，直至手术影响完全消除。将每只大鼠单独饲养于适宜环境中，保持恒定条件（20–24 °C，12 小时光照-黑暗循环）。自由提供食物和去离子水ad libitum。
  5. 手术后前 2 天内，每日两次称量动物体重，并皮下注射 Buprenorphine 以缓解疼痛。
    注意：为消除痛觉敏化效应，可在手术开始前给予 Buprenorphine。
  6. 实验期间，每周一至两次通过体重和一般行为评估监测动物状况。

4. 术后随访

注意：为促进细菌生物膜的积聚及随之发生的炎症，需维持牙周炎诱导14天。应检查并调整结扎线， Pg- 每周注射三次LPS（第2、4、6、8、10和12天）。

  1. 检查并调整结扎线（第2天、第4天、第6天、第8天、第10天和第12天），步骤如下：
    1. 使用麻醉诱导舱，以100%氧气中含2%异氟烷进行麻醉。
    2. 大鼠麻醉后，将其仰卧放置，在操作过程中通过小型鼻罩持续给予1%异氟烷（溶于100%氧气）以维持麻醉状态。
    3. 使用铝制开口器固定上下门齿，撑开大鼠口腔，同时利用其牵拉舌头，并将上颌与下颌稳定在张开且便于操作的位置，以便接触结扎线。
    4. 借助骨膜显微外科剥离器将结扎线紧贴牙龈压紧，并确保结扎缝线已正确置入，以诱导牙龈周围产生炎症。
      注意：术后7–10天内可能出现结扎线脱落情况。若发生脱落，请按照Pg-LPS注射步骤（步骤2.4）所述方案进行处理。
  2. 完成结扎线调整后，使用25 G无菌皮下注射针头和1 mL注射器，于M1牙近中腭侧的龈下组织双侧各注射40 µL的Pg-LPS（第2天、第4天、第6天、第8天、第10天和第12天）。
  3. 移除麻醉鼻罩，将大鼠放回笼中，并密切观察其恢复过程，直至麻醉效应完全消失。

5. 动物安乐死与分析

注意：评估牙周病（PD）进展的方法有多种。此处描述的分析包括对龈沟液（GCF）中促炎性细胞因子的评估，以及对牙槽骨丧失的评估。

  1. 在研究的第14天（第14天），用CO₂处死动物2 在二氧化碳培养箱中。A 建议啮齿类动物的换气率为每分钟30%至70%的箱体体积。
    注意：必须确认动物对足底反射无反应且无生命体征，以验证死亡 安乐死 
  2. 按照以下步骤收集GCF：
    注意：GCF 在 PD 诱导前（手术前）（第 0 天）和 PD 诱导后（处死后）（第 14 天）采集。
    1. 将动物仰卧位固定于手术台上，使用铝制开口器稳定上颌和下颌，使其保持张开状态。
    2. 使用30号吸附纸尖（直径0.03 cm，长度3 cm）插入第一磨牙近中腭侧牙龈沟内，直至遇到轻微阻力。保持纸尖在同一位置30秒后立即取出。
    3. 收集后，立即将纸尖转移至塑料管中，并于 -80 °C 保存直至进行检测。
  3. 为评估龈沟液中的蛋白质，按如下所述配制以下溶液并执行洗脱方法的各个步骤：
    注意：根据制造商说明书，使用免疫测定法对龈沟液（第14天）中的IL-1β进行评估。
    1. 新鲜配制洗脱缓冲液，并在整个提取过程中将其置于冰上，以抑制蛋白酶活性。
    2. 按照如下说明准备洗脱缓冲液所需的所有溶液：
      1. 在超纯水中配制1 mL抑肽酶（1 mg/mL）溶液。
      2. 在甲醇中配制10 mL苯基甲基磺酰氟（PMSF）（200 mM）溶液。
      3. 向24.5 mL PBS溶液（pH = 7.4）中加入125 µL PMSF和250 µL Aprotinin，以制备洗脱缓冲液。
    3. 将一片商用磷酸酶抑制剂片剂加入10 mL新配制的洗脱缓冲液中，4 °C下振荡溶解10分钟。
      注意：GCF 洗脱时间有限；加入磷酸酶抑制剂片剂后，需在30分钟内立即用于离心。
    4. 加入磷酸酶抑制剂后，将11 µL完全洗脱缓冲液直接加入含有纸尖的离心管中。
    5. 将试管在452 x g 4 °C 下离心 5 分钟。
    6. 将洗脱液转移至新的塑料管中。重复此过程四次，最终得到50 µL的总体积。
    7. 最后一次离心后，直接将总体积60 µL加入纸尖中，再以452 x g离心一次 g 4 °C下离心5分钟。
    8. 使用洗脱所得的必要体积进行蛋白质评估。
  4. 安乐死后采集龈沟液，借助手术剪将大鼠上颌骨切除。尽量剥离大鼠面部软组织，保留尽可能少的软组织。
  5. 将颚部置于显微镜载物台上进行观察，并在所需放大倍数下拍摄图像。
  6. 将下颌骨直接置于用PBS稀释的4%多聚甲醛（PFA）中，每周更换两次新鲜PFA，持续12天以完成固定。
    注意：涉及PFA的步骤应在通风橱中进行，并遵循安全数据表的建议。
  7. 完全固定下颌后，使用锥形束计算机断层扫描（CBCT）设备评估骨量丢失，步骤如下：
    1. 打开电脑。
    2. 打开CBCT分析程序。
    3. 选择 扫描方案 > 义齿扫描模式.
    4. 选择 视野 （视野） > (11x8) 高分辨率 （90 kV 电压和 3 mA 电流）
    5. 将大鼠固定的上颌置于扫描架中。
    6. 点击 下一步.
    7. 点击 X射线发射按钮 （按下X射线遥控器以启动发射，并在扫描全程保持按压状态）。
    8. 如有必要，通过按压控制按钮将上颌骨在额状面中心重新定位，然后单击 X射线发射按钮 （按下X射线遥控器以启动发射，并在扫描全程保持按压状态）。
    9. 点击 下一步.
    10. 点击 X射线发射按钮 （按下X射线遥控器以启动发射，并在扫描全程保持按压状态）。
    11. 如有必要，通过按压控制按钮将义齿在矢状面中心重新定位，然后单击 X射线发射按钮 （按下X射线遥控器以启动发射，并在整个扫描过程中持续按住）。
    12. 点击 下一步.
    13. 点击 开始按钮 （按下X射线遥控器以开始曝光，并在整个检查过程中持续按住）。等待出现处理中的提示信息，然后按照屏幕显示的指示进行操作。
    14. 窗口视图出现。将灰度调节至65%，然后点击 应用.
    15. 要保存扫描结果，请点击 文件 并将其保存为 DICOM 格式。然后，单击 所有图像 在DICOM导出选择窗口中，选择显示的所有参数（初始图像、原始轴向、重建轴向、多平面），并选择预定义类型。
  8. 使用分析程序处理上颌磨牙的二维和矢状面代表性图像，步骤如下：
    1. 打开软件。
    2. 点击 文件 和 打开，然后选择包含 DICOM 格式图像的文件夹并点击 打开.
    3. 等待窗口 "转换为8位" 出现时，选择 0 到 6,000 的范围，然后单击 好的.
    4. 点击 原始图像.
    5. 定义选区的顶部和底部以限定感兴趣区域。查找肺泡骨首次和最后一次出现的图像，并选择该区域 选择区域的顶部 和 选择底部 命令。
      注意：可导出磨牙牙槽骨的代表性二维图像，如 图3A，B.
    6. 对于矢状面代表性图像，请单击 切换个人资料栏.
    7. 在腭部正中画一条矢状线并点击 重新切片模型确定感兴趣区域的参数（切片间距：1；切片数量：100），然后点击 好的等待重新切片模型结束后，最后点击保存 重切片图像.
      注意：可导出磨牙牙槽骨的代表性矢状面图像，如 图 3C，D.

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结果

实验步骤的时间线见图1。图2A显示了手术干预后下颌骨的图像，实验开始时（时间为0）在M1牙颈部周围放置结扎线。图2B显示，术后14天，M1周围的结扎线已进入龈沟，导致牙龈炎症及炎性细胞浸润积聚。

牙周炎小鼠模型：PgLPS注射、龈沟液采集及至第14天的时间线示意图。
图1：大鼠牙周炎（PD）诱导实验流程的时间线示意图。

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讨论

本方法描述了采用牙龈卟啉单胞菌（Pg-LPS）注射联合在M1牙周围结扎丝线的方法诱导大鼠牙周炎（PD），结果显示，采用该方法可在14天内成功诱导牙周组织及牙槽骨的显著改变。

在该操作过程中，必须注意多个关键步骤。在动物麻醉和术前准备阶段，评估手术过程中麻醉是否充分对操作成功至关重要，同时必须确保动物体位正确，使用铝制开口器固定在切牙周围以稳定大鼠张开的口腔，并避免开口器和手术器械对动物造成损伤。若血氧饱和度和脉搏速率下降，应立即停止操作，将动物置于侧卧位，直至各项指标恢复至正常水平。在结扎线放置过程中，必须将缝线和结正确置入龈沟内，同时应尽量减少软组织损伤，以防止其他区域出现疼痛和炎症。考虑到动物福利相关的伦理问题，必须持续监测动物的恢复情况，直至麻醉作用完全消除。术后前两天使用镇痛药物是必不可少的。监测动物的体重和行为同样重要，以评估大鼠对操作的耐受程度，并确保其未表现出严重痛苦。在术后程序中进行 Pg-LPS 注射及调整结扎线至 M1 牙齿周围龈下组织时，首先应将结扎线向根方收紧并重新定位，以诱导炎症产生；其次，需谨慎进行双侧 Pg<...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本工作由巴利阿里群岛大学-企业基金会（2020年概念验证项目资助）、西班牙卡洛斯三世健康研究所、经济与竞争力部（由欧洲社会基金ESF和欧洲区域发展基金ERDF共同资助，资助编号：M.M.B；FI18/00104）以及巴利阿里政府研究总局、研究事务厅（资助编号：M.M.F.C；FPI/040/2020）提供支持。作者感谢IdISBa实验外科与平台的Anna Tomás博士和Maria Tortosa提供的帮助。最后，感谢ADEMA牙科学院提供CBCT扫描仪的使用权限。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
吸附纸尖 nº30 Proclinc8187
抑肽酶Sigma-AldrichA1153
阿替美唑德克拉573751.5Revanzol 5 mg/mL
编织丝线结扎线（5/0） Laboratorio Arago Sl613112
布托啡诺 Richter pharma578816.6Bupaq 0.3 mg/mL
锥形束计算机断层扫描（CBCT）扫描仪 MyRayhyperion X9Model Hyperion X9
CTAn 软件SkyScan版本 1.13.4.0
牙科探针 Proclinc99743
金刚石锥形车针 DentaltixIT21517
食物维持饮食Sodispain 研究ROD14 
加热手术平台PetSavers
霍伦贝克刮匙Hu-FRIEDY HF45234
皮下注射针头  BD 30060025G × 5/8” - 0.5 × 16 mm
异氟烷 KarizooIsoflutek 1000mg/g
氯胺酮  Dechra581140.6Anesketin 100 mg/mL
脂多糖  源自牙龈卟啉单胞菌 InvivoGenTLRL-PGLPS
甲醇Fisher ScientificM/4000/PB08
微针式动态心电图监测仪费林外科器械KOT-6
显微外科镊子KLS Martin12-384-06-07
显微外科剪刀 S&T 显微外科器械SDC-15 RV
iMEC 8 Vet 监护仪迈瑞 
多重微球免疫测定Procartaplex，赛默飞世尔科技PPX-05
多聚甲醛（PFA） Sigma-Aldrich8187151000
骨膜显微外科剥离器 DentaltixCU19112468
苯甲基磺酰氟（PMSF） 罗氏10837091001
磷酸盐缓冲液（PBS）Capricorn ScientificPBS-1A
PhosSTOP 罗氏4906845001商用磷酸酶抑制剂片剂 
塑料离心管SPL Lifesciencies600151.5 mL
生理盐水Cinfa204024.3
体视显微镜 ZeissModel SteREO Discovery.V12
手术放大镜导光蔡司
手术剪 Zepf 外科手术08-1701-17
注射器 BD Plastipak3031721 mL
兽医牙科微型电机Eickemeyer174028
赛拉嗪Calier20102-003Xilagesic 20 mg/mL

参考文献

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