本研究介绍了一种诱导大鼠牙周炎的动物模型 通过 一种保留性结扎联合重复注射源自脂多糖的治疗方法 牙龈卟啉单胞菌，持续14天作用于上颌第一磨牙周围。结扎联合LPS注射技术可有效诱导牙周炎，导致牙槽骨吸收和炎症反应。
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本文内容
摘要
摘要
牙周炎（PD）是一种高度流行的慢性免疫炎症性疾病，影响牙周组织，导致牙龈软组织、牙周膜、牙骨质和牙槽骨的丧失。本研究描述了一种在大鼠中诱导牙周炎的简便方法。我们提供了详细的步骤，介绍如何在上颌第一磨牙（M1）周围放置结扎丝模型，并在M1的近中腭侧联合注射来自牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）的脂多糖（LPS）。牙周炎诱导持续14天，以促进细菌生物膜的积聚和炎症反应。为验证该动物模型的有效性，通过免疫测定法检测龈沟液（GCF）中关键炎症介质IL-1β的水平，并利用锥形束计算机断层扫描（CBCT）计算牙槽骨吸收程度。该技术在实验第14天结束时有效诱导了牙龈退缩、牙槽骨丧失以及GCF中IL-1β水平的升高。该方法能够有效诱导牙周炎，因此可用于牙周炎疾病进展机制及未来潜在治疗方法的相关研究。
引言
牙周炎（PD）是全球第六大最常见的公共卫生问题，影响约总人口的11%，是一种进展性、不可逆且具有破坏性的牙周病形式1,2。PD是一种累及牙龈和牙周组织的炎症过程，可导致牙龈退缩、结合上皮向根方迁移并形成牙周袋，以及牙槽骨丧失3。此外，PD还与多种全身性疾病相关，包括心血管疾病、肥胖、糖尿病和类风湿性关节炎，其中环境因素和宿主特异性因素起着重要作用4,5。
因此，牙周病（PD）是一种多因素疾病，主要由微生物菌斑的积聚引发——这是微生物群落失衡的结果——以及宿主对牙周致病菌产生过度的免疫反应，从而导致牙周组织的破坏4,6。在多种牙周致病菌中，革兰氏阴性厌氧菌Porphyromonas gingivalis是牙周病的关键病原体之一4。P. gingivalis细胞壁中含有复杂的脂多糖（LPS），这种分子可诱导多形核白细胞浸润和炎症牙周组织中的血管扩张7。这会....
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方案
注意：本研究的实验方案已获巴利阿里群岛健康研究所动物实验伦理委员会（CEEA-UIB；参考编号 163/03/21）批准。
1. 动物麻醉与实验准备
- 手术前对所有外科器械（铝制开口器、牙科探针、金刚石刀头、手术剪、显微钳、显微持针器、Hollenback雕刻刀、骨膜显微剥离器和显微外科剪）进行灭菌处理（135 °C，5分钟）。
- 按照所述方法，在无菌条件下配制该实验步骤所需的所有溶液。
- 配制氯胺酮（60 mg/mL）与赛拉嗪（8 mg/mL）混合溶液：将1.6 mL氯胺酮与1 mL赛拉嗪溶于磷酸盐缓冲液（PBS）/生理盐水中。将该储备液储存于4 °C。
- 将阿替美唑用PBS/生理盐水稀释至终浓度为0.25 mg/mL。将储备液储存于4 °C。
- 将丁丙诺啡用PBS/生理盐水稀释至终浓度为0.03 mg/mL。将储备液储存于4 °C。
- 制备1 mL的 Pg- 酪蛋白酸钠（1 mg/mL）溶于无菌生理盐水中。将原液储存于 -20 °C。
- 实验中使用12周龄、手术时体重为210–350 g的雌性和雄性Wistar大鼠。将动物分组饲养于适宜且环境条件恒定的环境中（20–24 °C，12小时光照-黑暗循环），自由摄取食物和标准水 随意摄取.
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结果
实验步骤的时间线见图1。图2A显示了手术干预后下颌骨的图像，实验开始时（时间为0）在M1牙颈部周围放置结扎线。图2B显示，术后14天，M1周围的结扎线已进入龈沟，导致牙龈炎症及炎性细胞浸润积聚。
图1：大鼠牙周炎（PD）诱导实验流程的时间线示意图。
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讨论
本方法描述了采用牙龈卟啉单胞菌（Pg-LPS）注射联合在M1牙周围结扎丝线的方法诱导大鼠牙周炎（PD），结果显示，采用该方法可在14天内成功诱导牙周组织及牙槽骨的显著改变。
在该操作过程中，必须注意多个关键步骤。在动物麻醉和术前准备阶段，评估手术过程中麻醉是否充分对操作成功至关重要，同时必须确保动物体位正确，使用铝制开口器固定在切牙周围以稳定大鼠张开的口腔，并避免开口器和手术器械对动物造成损伤。若血氧饱和度和脉搏速率下降，应立即停止操作，将动物置于侧卧位，直至各项指标恢复至正常水平。在结扎线放置过程中，必须将缝线和结正确置入龈沟内，同时应尽量减少软组织损伤，以防止其他区域出现疼痛和炎症。考虑到动物福利相关的伦理问题，必须持续监测动物的恢复情况，直至麻醉作用完全消除。术后前两天使用镇痛药物是必不可少的。监测动物的体重和行为同样重要，以评估大鼠对操作的耐受程度，并确保其未表现出严重痛苦。在术后程序中进行 Pg-LPS 注射及调整结扎线至 M1 牙齿周围龈下组织时，首先应将结扎线向根方收紧并重新定位，以诱导炎症产生；其次，需谨慎进行双侧 Pg<.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本工作由巴利阿里群岛大学-企业基金会（2020年概念验证项目资助）、西班牙卡洛斯三世健康研究所、经济与竞争力部（由欧洲社会基金ESF和欧洲区域发展基金ERDF共同资助，资助编号：M.M.B；FI18/00104）以及巴利阿里政府研究总局、研究事务厅（资助编号：M.M.F.C；FPI/040/2020）提供支持。作者感谢IdISBa实验外科与平台的Anna Tomás博士和Maria Tortosa提供的帮助。最后，感谢ADEMA牙科学院提供CBCT扫描仪的使用权限。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 吸附纸尖 nº30 | Proclinc | 8187 | |
| 抑肽酶 | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| 阿替美唑 | 德克拉 | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| 编织丝线结扎线（5/0） | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| 布托啡诺 | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| 锥形束计算机断层扫描（CBCT）扫描仪 | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn 软件 | SkyScan | 版本 1.13.4.0 | |
| 牙科探针 | Proclinc | 99743 | |
| 金刚石锥形车针 | Dentaltix | IT21517 | |
| 食物维持饮食 | Sodispain 研究 | ROD14 | |
| 加热手术平台 | PetSavers | ||
| 霍伦贝克刮匙 | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| 皮下注射针头 | BD | 300600 | 25G × 5/8” - 0.5 × 16 mm |
| 异氟烷 | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| 氯胺酮 | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| 脂多糖 源自牙龈卟啉单胞菌 | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| 甲醇 | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| 微针式动态心电图监测仪 | 费林外科器械 | KOT-6 | |
| 显微外科镊子 | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| 显微外科剪刀 | S&T 显微外科器械 | SDC-15 RV | |
| iMEC 8 Vet 监护仪 | 迈瑞 | ||
| 多重微球免疫测定 | Procartaplex，赛默飞世尔科技 | PPX-05 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| 骨膜显微外科剥离器 | Dentaltix | CU19112468 | |
| 苯甲基磺酰氟（PMSF） | 罗氏 | 10837091001 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | 罗氏 | 4906845001 | 商用磷酸酶抑制剂片剂 |
| 塑料离心管 | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5 mL |
| 生理盐水 | Cinfa | 204024.3 | |
| 体视显微镜 | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| 手术放大镜导光 | 蔡司 | ||
| 手术剪 | Zepf 外科手术 | 08-1701-17 | |
| 注射器 | BD Plastipak | 303172 | 1 mL |
| 兽医牙科微型电机 | Eickemeyer | 174028 | |
| 赛拉嗪 | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
参考文献
- Carvalho, J. D. S., et al. Impact of citrus flavonoid supplementation on inflammation in lipopolysaccharide-induced periodontal disease in mice. Food and Function. 12 (11), 5007-5017 (2021).
- Nazir, M. A.
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