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方法文章

基于免疫染色的红细胞蛋白质动态变化检测

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DOI：

10.3791/64843

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2023年3月17日

 , 
1Department of Molecular and Cellular Sports Medicine, German Sport University Cologne, 2Biorheology Research Laboratory, Menzies Health Institute, Griffith University Gold Coast

本文内容

摘要

捕获无核红细胞中蛋白质活化过程的动态变化存在方法学上的挑战，例如如何保存急性刺激引起的动态变化以供后续分析。本方案描述了样本制备和染色技术，可实现相关蛋白质变化的保存与分析，并支持后续检测。

摘要

红细胞（RBC）蛋白的抗体标记是一种常用的半定量方法，用于检测总体蛋白含量的变化或蛋白活化状态的急性改变。该方法有助于评估红细胞处理效果、表征某些疾病状态下的差异，以及描述细胞间的关联性。检测蛋白活化状态的急性变化（例如通过机械转导途径）需要充分的样品制备，以保留原本短暂存在的蛋白修饰。其基本原理是固定目标红细胞蛋白的结合位点，从而实现特异性一抗的初始结合。随后进一步处理样品，以确保二抗与相应一抗结合的最佳条件。若选用非荧光标记的二抗，则需额外处理步骤，包括生物素-亲和素偶联以及使用3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）显色，该显色过程需在显微镜下实时监控，以便及时终止氧化反应，从而控制染色强度。对于染色强度的检测，可使用普通光学显微镜拍摄图像。在本方案的一个改进版本中，可改用荧光素标记的二抗，其优势在于无需额外的显色步骤。然而，该方法需要配备荧光物镜的显微镜以检测染色结果。鉴于这些方法均为半定量性质，必须设置多个对照染色，以排除非特异性抗体反应和背景信号的干扰。本文将介绍上述两种染色方案及其相应的分析流程，并对不同染色技术的结果与优势进行比较与讨论。

引言

红细胞（RBC）在心血管系统中循环70至140天，平均寿命约为115天1,2。衰老或受损的红细胞通过红细胞吞噬作用从循环中被清除，这一高效的清除过程由巨噬细胞介导3。红细胞这种预定寿命是其在分化和成熟过程中丢失细胞器（包括细胞核、线粒体和核糖体）的后果之一4。因此，循环中的红细胞缺乏翻译机制，无法合成新的蛋白质3。由此可见，对现有蛋白质进行动态的翻译后修饰，是红细胞应对胞外和胞内应激因子时唯一可行的急性生化调控机制5。

机械力似乎是导致红细胞内生物化学通路激活或调节的主要胞外信号。在红细胞膜上发现机械敏感蛋白Piezo16，激发了多项关于这些细胞中机械激活信号传导的研究7。例如，近期研究进展表明，红细胞的物理特性受到蛋白质急性且动态变化的主动调控8，其中包括翻译后磷酸化和泛素化修饰9。由于这些正常的修饰在某些疾病状态下存在差异9,10,11，因此确定红细胞蛋白质的激活状态，特别是其与力生物学过程的关系，在科学和临床上均具有重要意义。

确定红细胞（RBC）蛋白质活化状态的急性变化存在一些方法学上的挑战。例如，为后续分析而储存红细胞样本时，需要保持红细胞中已发生修饰的蛋白质状态，因为翻译后修饰并不稳定。此外，传统的蛋白质检测方法（如蛋白质印迹法）在红细胞中极难标准化，原因是相对于占细胞总蛋白含量约98%的血红蛋白而言，其他蛋白质的丰度极低12。因此，在研究重要红细胞蛋白质（如红细胞特异性一氧化氮合酶同工型，RBC-NOS）的急性修饰时，通常首选对抗化学固定后的红细胞进行基于抗体的染色方法13,14。已有研究表明，RBC-NOS具有催化生成一氧化氮（NO）的能力，而NO似乎对红细胞的关键特性（如红细胞变形能力）至关重要15,16,17。RBC-NOS的翻译后修饰可调控其催化酶活性，其中丝氨酸1177位点的磷酸化被证实可增强酶活性，而丝氨酸114或苏氨酸495位点的磷酸化则与RBC-NOS活性降低相关18,19。

总体而言，红细胞蛋白质的暂时性修饰对细胞的重要功能具有贡献，而能够检测这些修饰蛋白质的标准化方案具有很高的价值。本文介绍了两种利用特异性抗体促进红细胞一氧化氮合酶（RBC-NOS）蛋白活性检测的不同实验方案，并讨论了数据分析与解释的相关建议。

通过测量红细胞一氧化氮合酶（RBC-NOS）在丝氨酸1177位点的磷酸化水平升高情况，评估所述实验方案的执行效果，该磷酸化反应是由模拟人体血管内所受机械力（5 Pa）引起的，已有广泛报道。

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方案

本文所述方案符合《赫尔辛基宣言》的要求，并已获得德国科隆体育大学伦理委员会（2013年9月16日）和格里菲斯大学伦理委员会（2019/808）的批准。志愿者均经过筛查，以确保无相关病理状况，并签署了书面知情同意书。

1. 使用免疫组织化学方案对红细胞蛋白质进行染色

注意：所需化学品和材料的详细列表见材料表。以下部分描述了所需溶液的配制，随后是免疫组织化学实验步骤的详细说明（图1）。

免疫染色流程图；蛋白质固定、抗体标记和显微分析。
图1：红细胞一氧化氮合酶在磷酸化位点1177进行免疫组织化学和免疫荧光染色所需各步骤的示意图。 本文所述方案的典型工作流程，从溶液配制和采血到基于抗体的检测与可视化，均在此展示。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 血液样本采集
    1. 从七名健康男性中采集血液样本（全血10 mL）。志愿者均为据报告无心血管、血液学、神经、内分泌或代谢系统疾病的健康个体，且均为非吸烟者。
    2. 使用无菌针头和注射器从 forearm 的肘前区明显静脉采集血液，并立即转移至含有以下抗凝剂之一的试管中：肝素钠（用于免疫组织化学）或乙二胺四乙酸（EDTA；用于荧光标记）。
    3. 使用Couette型剪切系统，按照先前所述方法，对已抗凝的血液样本施加精确控制的机械力7,20.
      1. 剪切装置由一个可旋转的杯体和一个固定的转子组成，二者之间由一个间隙分隔 300 µm 间隙。将血液样本转移至该间隙中，使杯状容器精确可控的旋转速度对样本施加良好控制的机械力。本文展示的代表性数据是通过施加模拟人体血管内所受机械力（5 Pa）并持续较长时间（300 s）获得的。
  2. 免疫染色所需溶液的配制
    1. 按照以下方法配制溶液 表1溶液可在进行免疫染色前预先配制，并在指定温度下保存至使用时。
      注意：不同化学品的储存期限可能有所差异，请查阅材料安全数据表。
  3. 样品制备
    1. 在采血或实验处理（如适用；例如，本研究样本中的机械刺激；参见步骤1.1.3）后立即处理全血，以便检测短暂存在的效应，例如施加剪切应力、运动、短时缺氧暴露等情况后的变化。
    2. 使用甲醛进行红细胞蛋白固定，步骤如下：将全血以1:2的比例稀释于4%多聚甲醛溶液中，在室温（RT）下孵育20分钟。将样品以132 × g 室温孵育3分钟，小心移液去除上清液。
    3. 将红细胞沉淀重悬于两倍体积的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）（1:3稀释），室温孵育5分钟。按上述方法重复离心，用移液器吸除上清液（上清液应澄清）。将红细胞沉淀重悬于一倍体积的0.1 mol/L PBS（1:2稀释）。
    4. 制备血涂片步骤如下：使用耐酒精笔（例如铅笔）在显微镜载玻片上标记样本编号、所用抗体等信息。然后，加入 10 µL 制备好的红细胞溶液的标签区域正上方。
    5. 将第二张载玻片以约 45° 将样品均匀涂布在载玻片上。将载玻片在本生灯火焰上方进行热固定，持续移动载玻片，使样品在火焰上方停留5–7秒。
      注意：建议在热固定前将样本风干。样本可在室温下保存至染色前图2).
  4. 免疫组织化学染色
    1. 在每张载玻片上标记两个区域：一个为检测区，红细胞在此与相应的初级抗体和次级抗体共同孵育；另一个为对照区，其中初级抗体被对照溶液替代。该对照区作为实验内对照，用于测定红细胞的背景信号。
    2. 根据实验步骤，在实验开始前或进行过程中配制溶液 表 2. 体积为 300 µL 每次测试区域需要 200 µL 每个对照区域
      注意：需要强调的是，这些基于抗体的染色方法所获得的数据为半定量而非定量结果。因此，为确保能够从所得数据中得出有意义的结论，必须设置适当的对照样本（即为评估蛋白激活水平的相对变化提供参考基准）。
    3. 对于胰蛋白酶消化，将0.1%胰蛋白酶解冻并平衡至室温。使用记号笔在每张载玻片上标记两个区域：一个测试区（占载玻片的2/3）和一个对照区（占载玻片的1/3）。使用移液管小心加入Tris缓冲盐水（TBS）以清洗样本区域。让TBS静置30秒，然后倾倒弃去。重复洗涤步骤一次。
      注意：除非另有说明，以下溶液需同时添加至对照区域和测试区域。各区域必须被相应溶液充分覆盖。使用一次性移液管加入溶液，并在每种溶液之间更换移液管。
    4. 加入0.1%胰蛋白酶，使用专用孵育盒并以盖子或铝箔覆盖载玻片，在30分钟内孵育 37 °C 在培养箱中孵育。孵育结束后，加入自来水终止酶反应。倒掉溶液。用TBS按上述方法清洗两个区域3次。
    5. 为阻断过氧化物酶活性，加入甲醇溶液，在室温下孵育30分钟。孵育期间用盖片覆盖载玻片。倒掉溶液。
      注意：对于免疫荧光检测（第2节），此步骤可以省略，因为内源性过氧化物酶的阻断旨在防止使用辣根过氧化物酶（HRP）和3,3′-二氨基联苯胺水合物（DAB）检测时产生人为信号。
    6. 用TBS缓冲液冲洗两个区域，重复3次，具体操作如步骤1.4.3所述。加入3%脱脂牛奶溶液，室温孵育30分钟以进行封闭。倒掉溶液，之后无需洗涤。
    7. 仅向测试区域添加一抗（AB）。向对照区域添加AB对照溶液（参见 表 2) 加入对照区域。将样品在指定条件下孵育 4 °C 过夜。在此期间用盖玻片覆盖以防止干燥。
      注意：避免将溶液从测试区域转移至对照区域，否则会影响对照值。
    8. 倒掉抗体溶液。按照步骤1.4.3所述，用TBS洗涤两个区域各3次。
    9. 进行封闭步骤以防止非特异性结合。加入3%正常山羊血清，室温孵育30分钟。倒掉溶液。
    10. 加入二抗溶液，在室温下孵育30分钟。倒掉抗体溶液。按照步骤1.4.3所述，用TBS洗涤区域3次。
  5. 染色与封片的制备
    1. 进行亲和素偶联的HRP反应（参见稀释比例在 表 2) 加入稀释的亲和素-过氧化物酶溶液，室温孵育 30 分钟。倒掉溶液。
    2. 使用前按说明配制DAB混合液以显色免疫染色 表3.
      警告：DAB 具有危险性。请参阅危险性说明 H341（怀疑可造成遗传性缺陷）和 H350（可能致癌）。请遵守以下预防措施：P201、P202、P280、P308+P313、P405 和 P501。
    3. 进行DAB对照染色操作如下：从步骤1.5.1中收集一滴HRP溶液，与少量（例如1 mL）配制好的DAB溶液在另一离心管中混合，染色前进行混合。混合液应呈现棕/灰色。
    4. 将载玻片置于显微镜下（放大倍数至少200倍），向两个区域加入DAB溶液。持续观察红细胞的染色情况，并在背景开始着色前，用一次性移液器移除DAB溶液以终止染色。对于红细胞NOS丝氨酸1177染色，DAB孵育时间约为17分钟。
    5. 进行样品脱水。将载玻片置于玻璃架中，依次浸入不同浓度的乙醇溶液中各5秒，顺序为70%、96%、100%，最后浸入二甲苯中。从架上取出载玻片，放置于纸巾上，使红细胞面朝上以吸收多余液体。
    6. 在载玻片上滴加两到三滴封片剂。用盖玻片覆盖载玻片，避免产生气泡，以免影响显微镜观察。将样品在通风橱中干燥至少过夜。
  6. 进行显微镜评估
    1. 为进行观察和成像，将载玻片置于透射光显微镜下，放大倍数至少为200倍。确保显微镜连接有相机，以便拍摄染色红细胞的图像。
    2. 打开显微镜光源。开启与显微镜连接的相机，并启动显微镜控制软件。使用明场显微镜，通过调节粗调和微调焦旋钮，找到可观察到红细胞（RBCs）的合适焦平面。
    3. 将图片的背景值设定为220 ± 5 灰度值，该值在载玻片上三个无细胞区域测量获得。操作时，使用免费软件 ImageJ 打开第一张图片，选择相应选项 平均灰度值 使用该面板 设置测量参数. 使用椭圆形图标通过测量灰度值 测量 命令。如果测量值超出范围，请相应调整显微镜的背景光。重复这些步骤，直至背景值正确为止。
      注意：所有采集的图像中，这些背景值均应在给定范围内；否则，数据将不可比较。
    4. 用于分析红细胞灰度值时，使用 ImageJ 软件中的椭圆选区工具标记每个红细胞的边缘。利用 测量 命令。从测试区域测量至少50个红细胞的灰度值，从对照区域测量至少10个红细胞的灰度值。
      注意：分析的红细胞总数可根据需要进行个体化调整。分析的红细胞数量越多，结果越具有统计意义。但在同一实验中，不同条件、不同受试者等之间的红细胞分析总数应具有可比性。
      1. 避免分析靠近石蜡笔标记区域的红细胞，因为该区域染色可能不完全。避免分析相互重叠的红细胞，因为这会影响染色强度。仅选择与其他红细胞分离的红细胞进行分析。为评估50/10红细胞，至少分析来自实验区域的五张图像和来自对照区域的两张图像。最终分析应包含每张图片中的红细胞。
    5. 为计算染色强度，将最终信号按如下公式计算：
      （单个检测区域红细胞 - 检测区域平均背景） - （单个对照区域红细胞 - 对照区域平均背景）

全血固定流程图，用于细胞分析制备的离心与热固定。
图2固定过程及血涂片制备示意图 （示意图使用 BioRender.com 制作。）将稀释的血液样本用多聚甲醛化学固定，随后离心并用磷酸盐缓冲液洗涤。最后，将重悬的血液涂布于玻片上并进行热固定 通过 在本生灯火焰上方悬停。 请点击此处查看此图的放大版本。

表1：免疫组织化学染色所需溶液的配制与储存条件。 这些溶液可在实验方案开始前预先配制。请点击此处下载该表格。

表2：即用型抗体溶液的说明。 请点击此处下载该表格。

表3：制备DAB溶液以立即使用的组分及操作步骤。 请点击此处下载该表格。

2. 红细胞蛋白质的荧光标记

注意：以下部分概述了免疫组织化学实验方案的一种改进方法，旨在使带有荧光标记的抗体得以应用（图1）。

免疫荧光实验的血液样本制备步骤与第1节所述相同，因此以下部分从样本染色开始。

  1. 免疫荧光染色
    1. 加入二抗（荧光标记抗体）于样品中，在避光条件下室温孵育30分钟，二抗用量请参见步骤1.4.2，可使用专用孵育盒或铝箔包裹。
    2. 倾去二抗溶液，用TBS缓冲液洗涤样品3次，每次洗涤后将最后一次洗涤液保留在样品上，以防止样品干燥。
    3. 倾去TBS缓冲液，逐个从样品架上取下样品以避免长时间光照。进行样品脱水时，将载玻片依次浸入70%、90%和100%的乙醇溶液中，每种浓度约5秒。随后将载玻片浸入二甲苯（xylol/xylene）溶液中5秒。
    4. 在盖玻片上滴加两至三滴封片剂，然后将盖玻片覆盖于载玻片上。使用镊子或类似的无菌金属工具轻轻按压，使封片剂均匀分布，并用同一工具排除可能影响成像的气泡。将样品置于黑暗干燥处过夜干燥。
  2. 显微镜观察
    1. 将载玻片置于显微镜载物台上，总放大倍数至少为400倍，以进行观察和成像。打开显微镜光源和荧光光源，并确保荧光光源强度调节至最大。
    2. 开启显微镜连接的相机并启动显微镜控制软件。使用明场显微镜模式，通过调节粗调和微调焦旋钮，找到红细胞（RBCs）清晰可见的焦平面。
      注意：过度暴露于光线可能导致荧光偶联物发生光漂白。建议使用先前实验的载玻片进行对焦操作，以减少待分析样品的光照暴露。
    3. 通过观察对照区域中的红细胞来确定最佳激光强度。确保强度足够使红细胞可见，同时不会产生过强的背景信号。在不同区域和样品之间保持激光强度和曝光时间一致，以确保数据可比性。
    4. 在载玻片测试区域中随机选取至少三个不同位置，分别采集明场和荧光图像。选择成像区域时，使用显微镜载物台控制装置避开脂质笔标记的载玻片边缘区域。选择一个红细胞呈单层均匀分布的区域进行成像。
    5. 将荧光图像的曝光时间设置为1秒，通过显微镜控制软件采集图像。切换至明场模式，将曝光时间设为“自动”，并采集对应的明场图像。
    6. 重复步骤2.2.3，在载玻片对照区域中随机选取至少两个不同位置，分别采集明场和荧光图像。
    7. 将图像保存为.tif格式，以保留像素的原始灰度值，避免压缩，并保留采集过程中的元数据。
    8. 测量所采集红细胞的灰度值。打开ImageJ（或FIJI21；见补充文件1），测定单个红细胞的灰度值。具体操作为：使用椭圆选区工具标记每个单独的细胞，然后通过测量命令进行分析。
      注意：若红细胞与其他细胞重叠，则不应纳入分析，因为这可能导致信号值升高。
    9. 标记三至五个无红细胞的区域，测定其灰度值，作为背景信号的参考。每个测试区域应分析至少来自三张不同图像的150个红细胞，每个对照区域应分析至少来自两张不同图像的50个红细胞。
      注意：为降低变异性，建议增加细胞或区域的分析数量。由于红细胞群体本身具有异质性，不同细胞间的信号差异可能较显著，具体取决于目标蛋白。
    10. 使用宏命令对采集的图像进行替代性数据分析。通过FIJI版本的ImageJ创建或安装宏命令，实现图像中细胞的自动识别、背景校正及灰度值分析。
      注意：该程序通过复制原始图像并采用自动阈值法检测图像中的细胞，生成叠加图并叠加至原始图像，从而提取荧光红细胞的灰度值。该宏命令以.ijm文件形式提供，见补充编码文件1。
    11. 以.tif格式打开待分析的图像文件。打开RBC fluorescence.ijm宏文件（补充编码文件1），点击运行。
      注意：该宏命令适用于600倍放大倍数且信噪比较高的图像。细胞的自动识别结果需由研究人员进行复核。
  3. 最终信号计算方式如下：
    （测试区域红细胞灰度值 - 测试区域背景灰度值）-（对照区域红细胞灰度值 - 对照区域背景灰度值），用于手动分析；
    （测试区域信号 - 对照区域信号），用于自动分析。

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结果

本方案描述了一种可促进检测红细胞（RBC）蛋白质急性变化的方法，并在一个已知的机械敏感性蛋白修饰——红细胞一氧化氮合酶（RBC-NOS）丝氨酸1177位点的磷酸化上进行了验证。从健康志愿者采集全血后，将其分为两个独立的等份样本。其中一份血液样本接受生理水平的机械剪切应力（5 Pa）作用300秒，此前研究已证实该条件可诱导RBC-NOS在丝氨酸1177位点发生磷酸化14。机械剪切作用结束后，立即用多聚甲醛固定该血液样本。作为对照，另一份血液样本同样被装入剪切装置，但在未施加剪切力的情况下静置300秒后进行多聚甲醛固定。通过免疫组织化学法（图3A、B）和免疫荧光法（图3C、D）分别检测了静息状态及机械力作用后针对丝氨酸1177位点磷酸化的RBC-NOS抗体信号。经剪切与未剪切样本之间的信号差异具有统计学显著性 [Friedman检验：χ2(3) = 18.71，p = ...

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讨论

近期文献强烈表明，红细胞一氧化氮合酶（RBC-NOS）蛋白对红细胞变形性的调控具有至关重要的作用15,22,23，而红细胞变形性反过来有助于其通过狭窄的毛细血管24。该蛋白的活性高度依赖于翻译后蛋白修饰，尤其是特定残基的磷酸化18。研究关注的重点是第1177位点的磷酸化，该位点与RBC-NOS蛋白的激活相关23。已有研究表明，在多种疾病中该蛋白发生了改变25,26,27,28,29，因此，...

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披露

所有作者均已声明不存在利益冲突。

致谢

LK 感谢澳大利亚政府研究培训计划奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3,3′二氨基联苯胺四盐酸盐水合物Sigma/MerckD5637DAB
氯化铵 默克 / 密理博101145NH4Cl
Centrifuge 5427 R Eppendorf5409000010
盖玻片VWR631-0147 
二水合磷酸氢二钠 默克 / 密理博106580Na2HPO42 H2O
一次性移液管VWR612-6803
Entellan默克 / 密理博107961显微镜快速封片剂
使用1%甲基乙基酮（MEK）变性的乙醇霍夫曼642
葡萄糖氧化酶Sigma/MerckG2133
润滑铅笔 DakoS 2002
辣根过氧化物酶/ExtrAvidin−过氧化物酶Sigma/MerckE-2886HRP
盐酸 默克 / 密理博109057HCl
过氧化氢，30%默克 / 密理博107203H2O2
ImageJ 软件免费软件
激光辅助光学旋转细胞分析仪（LORCA）RR 机电一体化用于剪切的变形红细胞计仪器
甲醇默克 / 密理博106009
显微镜载玻片VWR630-1985
六水合硫酸镍(II) Sigma/MerckN4882NiSO4.6H2O
正常山羊血清安捷伦/DAKOX0907NGS
多聚甲醛默克 / 密理博818715PFA
移液器 Eppendorf Reference 2VWR613-5836/ 613-5839
兔抗磷酸化eNOS抗体（Ser1177）默克/密理博07-428-I一抗
2 ml 反应管Eppendorf30120094
二抗 山羊抗兔安捷伦/DAKOE0432二抗
脱脂奶粉Bio-Rad170-6404
氯化钠 默克 / 密理博106404NaCl
一水合二氢磷酸钠默克 / 密理博106346NaH2PO4.2O
氢氧化钠，1 M默克 / 密理博150706NaOH
三(羟甲基)氨基甲烷默克 / 密理博108382Tris
胰蛋白酶Sigma/MerckT7409
Tween 20 默克/密理博822184
Whatman Glas 微纤维滤膜，GF/F 型默克 / 密理博WHA1825047
二甲苯VWR Chemicals2,89,73,465
ßD-葡萄糖一水合物默克 / 密理博14431-43-7

参考文献

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