利用CRISPR SunTag-p65-HSF1激活系统研究米色脂肪生物学与代谢

摘要

本方案介绍了在脂肪细胞中使用CRISPR SunTag-p65-HSF1（AdipoSPH）作为研究米色脂肪生物学的一种替代腺相关病毒（AAV）的策略。 在体 注射携带靶向内源性 Prdm16 基因的 sgRNA 的 AAV 足以诱导米色脂肪发育并增强产热基因程序。

摘要

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）技术推动了生物学领域的革命，近年来该技术的应用已远远超出最初描述的基因编辑范畴。CRISPR激活系统（CRISPRa）将无催化活性的Cas9（dCas9）蛋白与不同的转录调控模块结合，以诱导内源性基因表达。SunTag-p65-HSF1（SPH）是一种近期开发的CRISPRa技术，它将协同激活介质（SAMs）的组分与SunTag激活元件相结合。该系统可通过设计定制的单导向RNA（sgRNA）实现单个或多个基因的过表达。在本研究中，利用先前构建的SPH小鼠，生成了一种在脂肪细胞中条件性表达SPH（脂肪素Cre谱系）的小鼠模型，命名为AdipoSPH。为诱导白色脂肪向米色脂肪转化（即“褐变”表型），将携带靶向内源Prdm16基因（一个已被充分证实与棕色及米色脂肪发育相关的转录因子）的sgRNA的腺相关病毒（AAV）注射至腹股沟白色脂肪组织（iWAT）中。该小鼠模型成功诱导了内源Prdm16的表达，并激活了产热相关基因程序。此外， 体外 SPH诱导的Prdm16过表达增强了米色脂肪细胞的耗氧量，表型模拟了先前Prdm16转基因小鼠模型的结果。因此，本方案描述了一种多功能、低成本且省时的小鼠模型，可用于脂肪组织生物学的研究。

引言

米色（或称“褐样”）脂肪细胞是一类表达解偶联蛋白1（UCP1）且富含线粒体的脂肪细胞，存在于白色脂肪组织（WAT）库中。米色脂肪可在寒冷暴露及其他刺激条件下，由一部分脂肪前体细胞或成熟的白色脂肪细胞转化而来^1,2。米色脂肪细胞能够以依赖或不依赖UCP1的方式将能量转化为热量³。无论其产热功能如何，米色脂肪还可通过其他机制改善代谢健康，例如分泌脂肪因子以及发挥抗炎和抗纤维化作用。在小鼠和人类中的研究表明，诱导米色脂肪生成可改善全身的葡萄糖和脂质稳态³。然而，尽管近年来对米色脂肪生物学的认识迅速发展，其大多数代谢益处及相关机制仍尚未完全阐明。

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）最初在真核细胞中被描述为一种可通过Cas9蛋白的核酸酶活性在基因组特定位点产生双链断裂（DSB）的工具^4,5。Cas9由合成的单链引导RNA（sgRNA）引导，靶向特定的基因组区域，从而导致DNA双链断裂。除了利用Cas9核酸酶进行基因编辑外，CRISPR-Cas9技术还发展成为一种序列特异性的基因调控工具⁶。通过开发出催化失....

方案

动物实验按照坎皮纳斯大学《实验动物护理和使用指南》进行（实验动物使用协议编号 CEUA #5810-1/2021）。

1. 分子克隆

1. 单导向RNA（sgRNA）的设计
   1. 使用 CHOPCHOP 设计用于 CRISPR 激活的 sgRNA，网址为 https://chopchop.cbu.uib.no/ 或任何其他合适的工具。使用以下参数设计靶向 Prdm16 基因的 sgRNA：靶基因：Prdm16；物种：Mus musculus；方法：Crispr/Cas9；目的：激活。
      注意：针对转录起始位点（TSS）上游200 bp区域内的每个目标区域设计sgRNA。例如，本研究中靶向Prdm16的sgRNA结合于TSS上游154 bp处。
   2. 为sgRNA添加与载体骨架pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry中SacI限制性酶切位点相匹配的突出端（参见 材料表）。包含序列：5'- (N20)AGCT-3'（N = 核苷酸）。例如，靶向 Prdm16 基因的序列为 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3'，加上突出端后为 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'。
   3. 使用可用的工具获取 3' sgRNA 反向互补序列 https://arep.med.har....

结果

AdipoSPH 小鼠系通过繁育 SPH 与 Adipoq-Cre 小鼠品系而获得。两个小鼠品系均具有 C57BL6J-DBA/2J 杂交背景（根据商业供应商信息；参见 材料列表SPH小鼠品系最初由Zhou等人描述。¹⁴.

体内 通过 AdipoSPH 介导的 Prdm16 过表达促进米色脂肪细胞发育
为评估本研究所描述模型形成米色脂肪细胞的能力 体内将携带靶向Prdm16基因sgRNA的腺相关病毒注射至AdipoSPH小鼠的腹股沟白色脂肪组织。Prdm16是决定米色脂肪细胞发育与功能的明确转录因子。^20,21需要说明的是，此处我们选择了一种经过先前测试和验证的、靶向内源性 Prdm16 基因的 sgRNA。¹⁴携带空载 s.......

讨论

CRISPR 技术最有用的非编辑应用之一是通过 CRISPRa 系统激活内源性基因，从而研究基因功能⁶。SPH 是一种高效的 CRISPRa 系统，最初被报道可通过靶向多个神经发生相关基因，诱导星形胶质细胞转化为活性神经元¹⁴。在本研究中，AdipoSPH 被证明是研究米色脂肪生物学的合适工具，其通过激活脂肪细胞中内源性 Prdm16 的表达发挥作用。SPH 诱导的脂肪细胞中 Prdm16 过表达可激活产热基因程序，并诱导出现米色化表型，该表型模拟了此前报道的 Prdm16 转基因（Tg）小鼠模型²³。本研究选择 Prdm16 作为诱导米色脂肪细胞的靶基因，是基于该转录因子在调控棕色和米色脂肪分化过程中的核心作用，以及其在成熟脂肪细胞中对产热基因程序（例如，增强 Ucp1 表达）的调控功能。然而，当前模型允许研究人员根据研究目的，选择性地过表达任意内源性基因。

研究脂肪组织生物学的传统转基因模型依赖于基因改造的啮齿类动物，这些动物在脂肪细胞.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸	Sigma-Aldrich	T2877
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤	Sigma-Aldrich	I5879
AAVpro 293T 细胞系	Takarabio	632273
Amicon Ultra 离心滤膜	Merckmillipore	UFC510008	100 KDa
地塞米松	Sigma-Aldrich	D1756
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）	Corning	10-017-CV
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）F-12，含 GlutaMAX™ 添加剂	Gibco	10565-018	高浓度葡萄糖、氨基酸和维生素
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）	Sigma-Aldrich	D8662
Excelta 自开式显微剪刀	Fisher Scientific	17-467-496
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F2442
Fisherbrand 细胞刮刀（100 个装）	Fisher Scientific	08-100-241
Fisherbrand 高精度直头锥形超细尖镊子/持针钳	Fisher Scientific	12-000-122
Fisherbrand 尖头解剖剪刀	Fisher Scientific	08-940
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-25G
六亚甲基溴化铵（Polybrene）	Sigma-Aldrich	H9268
吲哚美辛	Sigma-Aldrich	I7378
胰岛素	Sigma-Aldrich	I9278
LigaFast 快速 DNA 连接系统	Promega	M8225
质粒大提纯化试剂盒	Qiagen	12162
微升注射器	Hamilton	80308	型号 701
NEB 10-beta/Stable	New England Biolabs	C3019H	E. coli 感受态细胞
pAAV2/8	Addgene	112864
pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry	Addgene	91947
pAdDeltaF6	Addgene	112867
PEG 8000	Sigma-Aldrich	89510
青霉素/链霉素	Gibco	15140-122
聚乙烯亚胺	Sigma-Aldrich	23966	线性，分子量 25000
聚维酮碘	Rioquímica	510101303	消毒剂
罗格列酮	Sigma-Aldrich	R2408
SacI 酶	New England Biolabs	R0156
Surgical Design Premier Adson 镊子	Fisher Scientific	22-079-741
注射器	Hamilton	475-40417
T4 DNA 连接酶	Promega	M180B
T4 DNA 连接酶缓冲液	New England Biolabs	B0202S
T4 PNK 酶试剂盒	New England Biolabs	M0201S
盐酸曲马多	SEM	43930
Vidisic 凝胶	Bausch + Lomb	99620