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方法文章

利用CRISPR SunTag-p65-HSF1激活系统研究米色脂肪生物学与代谢

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⸱

DOI：

10.3791/64849

⸱

2023年1月6日

 ,  , 
1Obesity and Comorbidities Research Center, State University of Campinas, 2Department of Structural and Functional Biology, Institute of Biology, State University of Campinas

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了在脂肪细胞中使用CRISPR SunTag-p65-HSF1（AdipoSPH）作为研究米色脂肪生物学的一种替代腺相关病毒（AAV）的策略。 在体 注射携带靶向内源性 Prdm16 基因的 sgRNA 的 AAV 足以诱导米色脂肪发育并增强产热基因程序。

摘要

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）技术推动了生物学领域的革命，近年来该技术的应用已远远超出最初描述的基因编辑范畴。CRISPR激活系统（CRISPRa）将无催化活性的Cas9（dCas9）蛋白与不同的转录调控模块结合，以诱导内源性基因表达。SunTag-p65-HSF1（SPH）是一种近期开发的CRISPRa技术，它将协同激活介质（SAMs）的组分与SunTag激活元件相结合。该系统可通过设计定制的单导向RNA（sgRNA）实现单个或多个基因的过表达。在本研究中，利用先前构建的SPH小鼠，生成了一种在脂肪细胞中条件性表达SPH（脂肪素Cre谱系）的小鼠模型，命名为AdipoSPH。为诱导白色脂肪向米色脂肪转化（即“褐变”表型），将携带靶向内源Prdm16基因（一个已被充分证实与棕色及米色脂肪发育相关的转录因子）的sgRNA的腺相关病毒（AAV）注射至腹股沟白色脂肪组织（iWAT）中。该小鼠模型成功诱导了内源Prdm16的表达，并激活了产热相关基因程序。此外， 体外 SPH诱导的Prdm16过表达增强了米色脂肪细胞的耗氧量，表型模拟了先前Prdm16转基因小鼠模型的结果。因此，本方案描述了一种多功能、低成本且省时的小鼠模型，可用于脂肪组织生物学的研究。

引言

米色（或称“褐样”）脂肪细胞是一类表达解偶联蛋白1（UCP1）且富含线粒体的脂肪细胞，存在于白色脂肪组织（WAT）库中。米色脂肪可在寒冷暴露及其他刺激条件下，由一部分脂肪前体细胞或成熟的白色脂肪细胞转化而来1,2。米色脂肪细胞能够以依赖或不依赖UCP1的方式将能量转化为热量3。无论其产热功能如何，米色脂肪还可通过其他机制改善代谢健康，例如分泌脂肪因子以及发挥抗炎和抗纤维化作用。在小鼠和人类中的研究表明，诱导米色脂肪生成可改善全身的葡萄糖和脂质稳态3。然而，尽管近年来对米色脂肪生物学的认识迅速发展，其大多数代谢益处及相关机制仍尚未完全阐明。

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）最初在真核细胞中被描述为一种可通过Cas9蛋白的核酸酶活性在基因组特定位点产生双链断裂（DSB）的工具4,5。Cas9由合成的单链引导RNA（sgRNA）引导，靶向特定的基因组区域，从而导致DNA双链断裂。除了利用Cas9核酸酶进行基因编辑外，CRISPR-Cas9技术还发展成为一种序列特异性的基因调控工具6。通过开发出催化失活的Cas9蛋白（dCas9），并将其与能够增强基因表达的转录调控模块相融合，由此诞生了CRISPR激活（CRISPRa）工具。目前已出现多种CRISPRa系统，例如VP647,8、协同激活介质（SAM）9、SunTag10,11、VPR12,13以及SunTag-p65-HSF1（SPH）14，后者结合了SAM与SunTag激活系统的组分。最近的研究表明，在N2a神经母细胞和原代星形胶质细胞中，使用SPH诱导神经发生相关基因的表达水平高于其他CRISPRa系统14，证明SPH是一种具有前景的CRISPRa工具。

在此，我们利用了一种先前开发的SPH小鼠14 构建一种条件性小鼠模型，使其在脂肪细胞中特异性表达SPH，该模型基于脂联素Cre谱系（AdipoSPH）。通过使用携带靶向内源性Prdm16基因的gRNA的腺相关病毒（AAV），诱导腹股沟白色脂肪组织（iWAT）发生米色化（白色向米色转化），从而增强产热基因程序的表达。此外， 体外 Prdm16 过表达增强了耗氧量。因此，该方案提供了一种多功能的 SPH 小鼠模型，可用于探索脂肪组织内米色脂肪发育的机制。

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方案

动物实验按照坎皮纳斯大学《实验动物护理和使用指南》进行（实验动物使用协议编号 CEUA #5810-1/2021）。

1. 分子克隆

  1. 单导向RNA（sgRNA）的设计
    1. 使用 CHOPCHOP 设计用于 CRISPR 激活的 sgRNA，网址为 https://chopchop.cbu.uib.no/ 或任何其他合适的工具。使用以下参数设计靶向 Prdm16 基因的 sgRNA：靶基因：Prdm16；物种：Mus musculus；方法：Crispr/Cas9；目的：激活。
      注意：针对转录起始位点（TSS）上游200 bp区域内的每个目标区域设计sgRNA。例如，本研究中靶向Prdm16的sgRNA结合于TSS上游154 bp处。
    2. 为sgRNA添加与载体骨架pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry中SacI限制性酶切位点相匹配的突出端（参见 材料表）。包含序列：5'- (N20)AGCT-3'（N = 核苷酸）。例如，靶向 Prdm16 基因的序列为 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3'，加上突出端后为 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'。
    3. 使用可用的工具获取 3' sgRNA 反向互补序列 https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html。例如，靶向 Prdm16 基因的 3’ sgRNA 序列为 3’- TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5’。
  2. 互补单链寡核苷酸的退火
    1. 加入1 µL的5'和3'单链寡核苷酸（各100 µM储备浓度）、1 µL T4连接酶缓冲液、0.5 µL T4多核苷酸激酶（PNK）（1 × 104 单位/毫升）和 6.5 µL 的 H2O至终反应体积为10 µL。使用PCR仪以下列条件使互补的单链寡核苷酸退火：37 °C孵育30分钟，95 °C孵育5分钟，随后以5 °C/min的降温速率降温。
      ​注意：PNK 酶随附 PNK 缓冲液，但不含磷酸化反应所需的足量 ATP（参见 材料表）。为简化反应，使用T4连接酶缓冲液（而非PNK缓冲液）。T4连接酶缓冲液可提供磷酸化反应所需的适量ATP（1 mM）。PNK酶用于寡核苷酸5'末端的磷酸化，以进行后续的连接反应。
  3. 退火后的sgRNA寡核苷酸连接
    1. 将25 ng质粒pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry与2 µL退火的sgRNA寡核苷酸、1 µL SacI酶、2 µL 10x T4 DNA连接酶缓冲液、1 µL T4 DNA连接酶（1-3 u/µL）混合（参见 材料表）和 H2最终反应体系体积为10 µL。
    2. 使用PCR仪孵育反应体系进行连接反应，程序设置如下：37 °C 5分钟、25 °C 5分钟，共15个循环，最后在4 °C保存。
  4. 转化后菌落聚合酶链式反应（PCR）
    1. 转化感受态细胞 E. coli DH10B 细胞（参见 材料表使用4 µL连接产物通过热激法（42 °C，45 s）转化，并涂布于含100 µg/mL氨苄青霉素的琼脂平板上。
    2. 使用PCR预混液通过菌落PCR验证转化子菌落（参见 材料表）。挑取菌落，与5 µL预混液、0.1 µL通用引物（储存浓度：100 µM）、0.1 µL sgRNA反向引物（储存浓度：100 µM）混合表1）以及 5 µL H2O. 使用PCR仪进行PCR反应，反应条件如下：初始变性（94 °C，2 min）；随后进行35个循环的变性（94 °C，20 s）、退火（60 °C，30 s）、延伸（72 °C，30 s）；最后进行终延伸（72 °C，5 min）。采用1.5%琼脂糖凝胶，在0.5×TAE缓冲液中以90 V电泳30 min分离DNA。
      ​注意：阳性克隆会产生约 280 bp 的条带。
    3. 使用通用引物对阳性样本进行Sanger测序表1，补充文件1).
  5. 质粒纯化
    1. 使用质粒纯化试剂盒从阳性克隆中纯化质粒（参见 材料表），按照制造商的说明进行操作。
      注意：使用阴离子交换树脂或适用于细胞转染的其他试剂盒纯化质粒。
    2. 在含有100 µg/mL氨苄青霉素的标准细菌培养基中，将阳性克隆于37 °C、200 rpm振荡培养12小时。
    3. 将细菌细胞在 6,000 × g 4 °C 下离心 10 分钟。随后根据试剂盒说明书的步骤进行操作。

2. AAV 包装

注意：AAV 包装按照先前发表的文献15,16进行，仅做了 minor modifications。

  1. 使用含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）的25 mL DMEM培养基，将293T细胞（见材料表）接种于175 cm2培养瓶中（每瓶接种5 × 106个细胞）。在37 °C、5% CO2、95%湿度条件下培养，直至细胞融合度达到50%–70%。
  2. 将14 µL聚乙烯亚胺（1 µg/µL）与1 mL 150 mM NaCl混合。将AAV生产所需的三种质粒按1:1:1的摩尔比混合（即17.7 µg pAdDeltaF6、7.9 µg AAV2/8（见材料表）和5.9 µg步骤1中克隆的sgRNA）溶于1 mL 150 mM NaCl中。将聚乙烯亚胺:NaCl混合液逐滴加入含DNA（质粒混合物）的离心管中，于25 °C孵育20分钟。
    ​注：pAdDeltaF6为辅助质粒，pCapsid pAAV2/8为包装质粒，表达复制（Rep）和衣壳（cap）基因。这两种质粒均为AAV生产所必需。
  3. 转染前，将细胞培养基更换为含1% FBS和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（0.5 g/L）的18 mL DMEM。向每个培养瓶中加入2 mL聚乙烯亚胺:DNA混合液，并将细胞置于CO2培养箱（37 °C、5% CO2、95%湿度）中继续培养。
  4. 5小时后，加入5 mL补充有10% FBS和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（0.5 g/L）的DMEM。
  5. 孵育3天后，用细胞刮刀将细胞从培养瓶中刮下。收集10个（175 cm2）细胞培养瓶中的293T细胞至50 mL离心管中，并加入DMEM（见材料表）至终体积30 mL。
  6. 向每个含293T细胞的50 mL离心管中加入3 mL氯仿，使用涡旋振荡器高速振荡混合5分钟。加入7.6 mL 5 M NaCl重悬细胞，并短暂涡旋。在4 °C条件下以3,000 × g离心5分钟。
  7. 将水相转移至新的离心管中，加入9.4 mL 50%（v/v）聚乙二醇（PEG）8000。使用涡旋振荡器高速混合10秒，将样品置于冰上1小时。
  8. 在4 °C条件下以3,000 × g离心30分钟。弃去上清液，让沉淀在空气中干燥10分钟。
  9. 加入1.4 mL HEPES缓冲液（50 mM，pH 8），使用涡旋振荡器高速混合5分钟。加入3.5 µL 1 M MgCl2、14 µL DNase I（20单位/µL）和1.4 µL RNase A（10 µg/µL）。在37 °C水浴中孵育20分钟，然后将样品转移至新的1.5 mL离心管中（每管700 µL）。
  10. 向每个1.5 mL离心管中加入700 µL氯仿，使用涡旋振荡器高速混合10秒。在4 °C条件下以3,000 × g离心5分钟，将水相转移至新管中。重复此步骤3次。
  11. 在生物安全柜中挥发氯仿30分钟。然后，将300 µL水相转移至0.5 mL超滤离心管（见材料表）。在25 °C条件下以14,000 × g离心5分钟。弃去滤过液，再次离心直至全部液体通过滤膜。
  12. 通过加入300 µL Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）清洗滤膜，并用移液器吹打混匀溶液。在25 °C条件下以14,000 × g离心5分钟。重复该洗涤步骤4次。
  13. 在25 °C条件下以14,000 × g离心8分钟。将滤膜倒置放入新离心管中，在25 °C条件下以1,000 × g离心2分钟。

3. 通过qPCR对AAV进行滴定

  1. 按照 Fripont 等人15的原始研究方法，制备用于 AAV 滴定的标准曲线，并确定 AAV 滴度。

4. 在体 向腹股沟白色脂肪组织（iWAT）注射AAV

  1. 根据每种材料的具体要求，分装手术所需器械和耗材，并进行灭菌处理。
  2. 通过腹腔注射给予小鼠 100 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 赛拉嗪进行麻醉。通过用力按压小鼠足爪和尾部并检查反射是否存在来确认麻醉效果。在小鼠眼睛上涂抹眼膏，以防止手术期间眼睛干涩。
  3. 将麻醉后的小鼠置于仰卧位，使用剃毛器在靠近髋关节的侧腹部区域剃除少量毛发，用于iWAT注射。涂抹脱毛膏5分钟，然后用水彻底清除残留脱毛膏，以避免皮肤灼伤。
  4. 使用干净的纱布交替进行三轮皮肤消毒：先用消毒液（聚维酮碘）涂抹皮肤，再用70%酒精处理。每次使用后丢弃纱布。
  5. 最后再对皮肤进行一次消毒液涂抹。 然后，用灭菌剪刀在关节近端区域做1-2 cm切口，用镊子撑开皮肤以暴露脂肪组织。白色脂肪组织（WAT）附着于皮肤两侧，从背部起始处向下延伸至睾丸区域。
    注意： 手术或缝合过程中应使用手术巾以避免污染。
  6. 通过切口用镊子轻轻将脂肪组织向上提起，以确保注射位置和深度准确。
    注意：操作时需小心，避免将组织从其原始位置移出。
  7. 使用微量注射器（规格：33；针尖类型：4；角度：12；长度：10）（参见材料表），吸取2.5 µL AAV（含靶向内源性Prdm16基因的sgRNA，浓度为5.6 × 1010 病毒基因组 [VG]/µL）。将针头以30°–45°角小心插入iWAT中。在组织的不同位置重复注射5次，以实现对整个iWAT脂肪垫的均匀感染。建议总注射体积为15 µL。
    注意：注射深度取决于脂肪垫的厚度。 抽吸注射液时应采用无接触技术。
  8. 使用4/0单股缝线缝合剃毛区域的皮肤切口。将小鼠置于加热垫上，直至意识恢复。每10–15分钟监测一次动物状态，直至完全苏醒。动物恢复意识后，观察其运动行为，应呈直线行走，无痛苦或不适表现。
  9. 术后48小时内进行疼痛控制，腹腔注射盐酸曲马多（5 mg/kg），连续给药3天（每日2次）。
    注意：应密切观察动物是否出现痛苦或不适迹象，并监测饮水和进食情况。 建议在手术前或手术开始时预先给予有效剂量的镇痛药，以实现预防性镇痛。 
  10. 在恢复期间，将小鼠饲养于可自由获取食物和饮水的笼具中。恢复期结束后，实施安乐死。本研究中采用注射麻醉剂过量（腹腔注射）的方式进行安乐死，剂量为诱导剂量的3倍（300–360 mg/kg盐酸氯胺酮 + 30–40 mg/kg盐酸赛拉嗪），随后进行断头处理。
    ​注意：强烈建议在动物完全从麻醉中恢复之前，将其单独饲养于独立笼具中。

5. 体外 基质血管细胞（SVFs）向米色脂肪细胞的分化

  1. 根据 Aune 等人的方法17，从 AdipoSPH 小鼠的 iWAT 中分离并接种原代 SVF。将来源于 AdipoSPH 小鼠 iWAT 的 SVF 接种至含有完全培养基（DMEM，含 3.1 g/L 葡萄糖、0.5 g/L L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、10% FBS 和 2.5% P/S）的 6 孔板中，孵育 1–2 小时。
    注意：SVF 组分包含多种不同类型的细胞。在此步骤中，尚无法确定能够分化为脂肪细胞的接种前体细胞数量。
  2. 吸除培养基，用磷酸盐缓冲液（1× PBS）洗涤孔板 2 次，然后更换为新鲜完全培养基。将细胞置于 37 °C、5% CO2、95% 湿度条件下培养，直至细胞融合度达到 70%–80%。
  3. 通过加入诱导培养基（表 2）启动分化（第 0 天）。
    注意：诱导培养基中的药物混合物对于增强米色脂肪细胞分化以及促进产热基因程序的表达是必需的17。
  4. 2 天后（第 2 天），将诱导培养基更换为维持培养基（表 2）。
  5. 再过 2 天后（第 4 天），将维持培养基更换为新鲜维持培养基（表 2），继续培养 2 至 3 天。
  6. 此后每 48 小时更换一次维持培养基，直至前脂肪细胞完全分化为成熟脂肪细胞（通常在加入诱导培养基后约 6 天）。可通过光学显微镜观察成熟脂肪细胞，此时分化后的细胞可见富含脂滴。

6. 体外 SVF的AAV感染

注意：来自 AdipoSPH 小鼠 iWAT 的基质血管组分（SVF）用携带 sgRNA-Prdm16 的腺相关病毒（AAV）进行感染，具体方法参照 Wang 等人先前描述的方法18，并稍作修改。

  1. 按照步骤 5.1-5.3 中所述方法，将细胞接种于 6 孔培养板中，使用完全培养基培养，直至细胞融合度达到 70%-80%。
  2. 将携带 sgRNA-Prdm16 的 AAV 以 5.6 × 1010 VG/µL 的浓度与 2 mL 完全培养基及六甲基溴化铵（8 µg/mL）混合（参见材料表）。更换完全培养基，加入含有 AAV 的完全培养基以转导细胞。将转导后的细胞在 37 °C、95% 湿度、5% CO2 条件下孵育 12 小时。
  3. 按照步骤 5 的方法对细胞进行传代和接种，以促进其增殖并分化为米色脂肪细胞。
    注意：进行耗氧量检测时，将步骤 6.2 中获得的 4.0 × 104 个细胞接种于 24 孔细胞培养板中，每孔加入诱导培养基。后续的细胞增殖与分化步骤按步骤 5 所述进行。当细胞融合度达到 80%-100% 并完全分化后，进行耗氧量检测，方法如先前报道19。

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结果

AdipoSPH 小鼠系通过繁育 SPH 与 Adipoq-Cre 小鼠品系而获得。两个小鼠品系均具有 C57BL6J-DBA/2J 杂交背景（根据商业供应商信息；参见 材料列表SPH小鼠品系最初由Zhou等人描述。14.

体内 通过 AdipoSPH 介导的 Prdm16 过表达促进米色脂肪细胞发育
为评估本研究所描述模型形成米色脂肪细胞的能力 体内将携带靶向Prdm16基因sgRNA的腺相关病毒注射至AdipoSPH小鼠的腹股沟白色脂肪组织。Prdm16是决定米色脂肪细胞发育与功能的明确转录因子。20,21需要说明的是，此处我们选择了一种经过先前测试和验证的、靶向内源性 Prdm16 基因的 sgRNA。14携带空载 s...

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讨论

CRISPR 技术最有用的非编辑应用之一是通过 CRISPRa 系统激活内源性基因，从而研究基因功能6。SPH 是一种高效的 CRISPRa 系统，最初被报道可通过靶向多个神经发生相关基因，诱导星形胶质细胞转化为活性神经元14。在本研究中，AdipoSPH 被证明是研究米色脂肪生物学的合适工具，其通过激活脂肪细胞中内源性 Prdm16 的表达发挥作用。SPH 诱导的脂肪细胞中 Prdm16 过表达可激活产热基因程序，并诱导出现米色化表型，该表型模拟了此前报道的 Prdm16 转基因（Tg）小鼠模型23。本研究选择 Prdm16 作为诱导米色脂肪细胞的靶基因，是基于该转录因子在调控棕色和米色脂肪分化过程中的核心作用，以及其在成熟脂肪细胞中对产热基因程序（例如，增强 Ucp1 表达）的调控功能。然而，当前模型允许研究人员根据研究目的，选择性地过表达任意内源性基因。

研究脂肪组织生物学的传统转基因模型依赖于基因改造的啮齿类动物，这些动物在脂肪细胞...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢来自巴西坎皮纳斯州立大学（Unicamp）实验动物科学生物学多学科研究中心（Cemib）的支持，该中心协助生成了AdipoSPH小鼠；同时感谢免疫代谢与细胞信号传导实验室以及国家科学技术研究所——光子学在细胞生物学中的应用（INFABIC）提供的全部实验支持。本研究获得圣保罗研究基金会（FAPESP）的经费支持：2019/15025-5；2020/09308-1；2020/14725-0；2021/11841-2。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸Sigma-AldrichT2877
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤Sigma-AldrichI5879
AAVpro 293T 细胞系Takarabio632273
Amicon Ultra 离心滤膜MerckmilliporeUFC510008100 KDa
地塞米松Sigma-AldrichD1756
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）Corning10-017-CV
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）F-12，含 GlutaMAX™ 添加剂Gibco10565-018高浓度葡萄糖、氨基酸和维生素
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）Sigma-AldrichD8662
Excelta 自开式显微剪刀Fisher Scientific17-467-496
胎牛血清Sigma-AldrichF2442
Fisherbrand 细胞刮刀（100 个装）Fisher Scientific08-100-241
Fisherbrand 高精度直头锥形超细尖镊子/持针钳Fisher Scientific12-000-122
Fisherbrand 尖头解剖剪刀Fisher Scientific08-940
甘油Sigma-AldrichG5516
HEPESSigma-AldrichH3375-25G
六亚甲基溴化铵（Polybrene）Sigma-AldrichH9268
吲哚美辛Sigma-AldrichI7378
胰岛素Sigma-AldrichI9278
LigaFast 快速 DNA 连接系统PromegaM8225
质粒大提纯化试剂盒 Qiagen12162
微升注射器Hamilton80308型号 701
NEB 10-beta/Stable New England BiolabsC3019HE. coli 感受态细胞
pAAV2/8 Addgene 112864
pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherryAddgene 91947
pAdDeltaF6 Addgene 112867
PEG 8000Sigma-Aldrich89510
青霉素/链霉素Gibco15140-122
聚乙烯亚胺Sigma-Aldrich23966线性，分子量 25000
聚维酮碘Rioquímica510101303消毒剂
罗格列酮Sigma-AldrichR2408
SacI 酶New England BiolabsR0156
Surgical Design Premier Adson 镊子Fisher Scientific22-079-741
注射器Hamilton475-40417
T4 DNA 连接酶PromegaM180B
T4 DNA 连接酶缓冲液 New England BiolabsB0202S
T4 PNK 酶试剂盒New England BiolabsM0201S
盐酸曲马多SEM43930
Vidisic 凝胶 Bausch + Lomb 99620

参考文献

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