小鼠下颌磨牙拔牙窝愈合模型的建立

摘要

本方案逐步演示了如何从小鼠中提取下颌第一磨牙，为专注于颌骨愈合与再生研究的研究人员提供了一种替代方法。

摘要

本研究介绍了小鼠下颌磨牙拔除模型的建立，旨在为研究牙槽骨再生和膜内成骨提供一种可行的实验模型。采用C57/J6小鼠，拔除下颌第一磨牙以建立该模型。分别在术后1周和4周处死动物，并取双侧下颌骨进行后续分析。通过连续立体显微观察、组织学评估及免疫荧光染色验证手术成功。术后即刻的立体显微图像显示拔牙窝为空腔状态。术后1周的苏木精-伊红（H&E）染色及术后4周的Masson染色结果显示，原牙根所在区域分别被部分和完全新生骨小梁填充。免疫荧光染色显示，与稳态侧相比，术后1周Sp7表达升高，提示牙槽窝内成骨活动活跃。上述结果共同表明，该小鼠拔牙窝愈合模型具有可行性。未来研究颌骨缺损或拔牙窝愈合机制时可采用此方法。

引言

拔牙后牙槽窝愈合是一种常见的临床情况，可能因愈合不良导致不理想的并发症，如牙槽窝出血、干槽症，甚至颌骨骨髓炎^1,2,3。这些合并症可能影响患者的生活质量，更严重的是，由于大量骨量丧失，可能严重影响后续的修复治疗⁴。尽管牙槽窝愈合的各个阶段已得到阐明，但在临床拔牙术后面对各种预后挑战时，现有知识仍不足以有效指导临床护理⁴。

已有许多基于动物模型的研究，旨在更深入地理解牙槽窝愈合过程中的潜在机制，并避免上述情况的发生。Sp7是成骨细胞分化的关键调控因子，在骨骼发育、骨稳态及骨再生过程中发挥重要作用^5,6。合理的牙槽窝愈合模型能够揭示创伤后Sp7在骨再生中的冗余性。此外，与长骨骨折愈合不同，牙槽窝的愈合过程仅涉及一种成骨方式，即膜内成骨⁷。这使得动物拔牙模型成为研究种植体相关治疗的理想选择，因为种植体的骨整合遵循相同的成骨规律⁸。

几十年来，由于大鼠、兔子和狗的牙齿较大，便于操作，因此常被用于牙齿拔除模型的研究^9,10,11。然而，随着基因修饰技术需求的增长，以及小鼠相较于其他动物更接近人类的遗传背景，小鼠正越来越多地被用于建立牙齿拔除模型。由此，研究人员可利用基因修饰小鼠揭示特定细胞群体在拔牙窝愈合过程中的作用，而不仅限于观察表型变化¹²。在小鼠拔牙窝模型中，既往研究已报道了上颌牙齿及切牙拔除窝的建立过程与愈合机制^13,14,15,16。然而，不同研究中关于预后愈合模式以及检测和观察时间点的设定可能存在差异。因此，亟需建立统一的标准，以指导学者构建小鼠拔牙窝愈合模型。

本研究旨在针对上述问题建立一种可行的小鼠牙槽窝愈合模型。小鼠下颌磨牙在形态特征上与上颌磨牙及切牙存在显著差异，具有独特的优缺点。由于目前专注于小鼠下颌骨的研究模型尚属空白，本实验方案致力于提供一种完整的小鼠下颌第一磨牙拔除方法。我们希望本方案能为基础研究人员提供新思路，以揭示牙槽窝愈合的潜在机制，并为临床护理提供指导。

方案

本研究中的所有动物实验均经四川大学华西口腔医学院伦理委员会（WCHSIRB-D-2017-041）审查和批准。本研究使用的成年C57BL/6小鼠购自商业来源（见材料表）。

1. 术前准备

1. 仪器准备
   1. 准备若干一次性注射器针头（26G、25G、23G；参见材料表），用作骨膜剥离器。将针头头部弯曲约20°–40°，如图1所示。
   2. 准备带齿眼科镊作为持针钳。确保其尺寸适合小鼠磨牙，并能牢固夹持磨牙。理想镊子尺寸如图1A、B3所示。
   3. 准备一根橡胶带（可从医用乳胶手套上撕下）作为开口器，泡沫板或软木板作为手术平台，头灯用于照亮手术区域，加热垫用于术后复苏。若术中发生出血，可将干燥棉球撕成小块 并应用于手术部位 。
2. 麻醉准备
   1. 可采用任何合适的麻醉方案对小鼠实施麻醉，通过“夹趾法”确认达到全身麻醉状态。麻醉后，应在小鼠眼部涂抹兽用眼膏。
      ​注：推荐的全身麻醉方案可为：腹腔注射（IP）氯胺酮（100 mg/kg）与赛拉嗪（10 mg/kg）进行诱导和维持；
      本研究中 采用异氟烷及1%戊巴比妥钠（50 mg/kg，IP）进行麻醉诱导与维持，并根据需要追加剂量。
3. 消毒与灭菌准备
   1. 使用75%乙醇喷雾器对手术平台及开放空间上方进行消毒。每次对小鼠操作前，建议使用一套新的一次性针头。
      注：带齿镊子可重复使用，可通过任何首选的 方法（如高压蒸汽灭菌）进行灭菌。

2. 手术过程

1. 小鼠及其下颌的固定
   1. 使用胶带将小鼠仰卧位固定于手术平台上。将两根26 G针沿眶耳平面固定，另两根26 G针轻松固定于下颌下方。
   2. 将橡皮筋绕过针头并交叉穿过门齿，以保持口腔张开。轻轻将舌头拉出，并将其固定在手术侧对侧的橡皮筋下方，以防其遮挡视野（图1C）。
2. 消除远中阻力
   1. 用镊子从近中夹住磨牙，将23 G针用力插入远中根的颊侧牙槽骨，形成间隙。
      注意：此步骤必须格外谨慎，若针插入过深，可能导致牙根折断。
   2. 随后更换为25 G针，继续扩大间隙，并在缓慢向前及舌向（按小鼠解剖位置）旋转针头的同时，轻柔推进至根尖周区域，以将牙根压出牙槽窝。
3. 消除近中阻力
   1. 当获得足够空间后，使用23 G针插入牙根分叉处，向咬合方向抬起磨牙。在牢固夹持磨牙后，取另一根23 G针，将其用力插入舌侧近中牙周膜，形成间隙。
   2. 随后更换为25 G针，缓慢向前及颊向旋转。若存在阻碍磨牙松动的深层阻力，可使用26 G针穿刺牙根尖端，并重复上述操作。
4. 最终拔除
   1. 拔除牙齿时，应确保牙冠明显高于咬合平面，并能清晰观察到两个完整的牙根。
      注意：牙齿的松动（脱位）被认为是该操作中最疼痛且最易引起应激的阶段。在牙齿脱位前，应通过脚趾夹捏试验重新评估麻醉深度，并根据需要给予适量麻醉剂。 
5. 术后护理
   1. 拔牙后，使用干棉球压迫止血，复位舌头，皮下注射卡洛芬（5 mg/kg），并将小鼠置于恒温加热垫上，直至其从麻醉中恢复。

小鼠下颌骨及拔牙窝的成像

1. 样品制备
   1. 通过颈椎脱位法处死小鼠。使用眼科剪刀剪除附着于下颌骨和颧弓的骨骼肌。从 throat 沿下颌骨下缘剪至升支，再剪至髁突后侧，然后将下颌骨向下拉并沿下切牙中线剪开。由此可获得两个分离的下颌骨。
   2. 按照标准程序进行固定、脱钙和脱水¹⁷。包埋时¹⁷，确保咬合面与包埋盒边缘平行（见 材料表）。将下颌骨固定在包埋盒底部，使其下缘倾斜（图2）。
      注：本方案可获得下颌骨区域的矢状切面。
2. 将样品固定在切片机上
   1. 调节切片机的标本夹，使髁突和牙冠侧多突出 5°–20°，以同时获得包含牙冠牙髓和根部牙髓的完整图像（图2）。
3. 制备切片
   注：髁突始终是首先被切到的解剖结构。当髁突消失后，即可对磨牙区域进行多层切片。
   1. 将切片机切片厚度设为 5 µm，每八片收集一次，并在最后一片中寻找牙本质。若首次出现的是牙冠牙本质而无根尖牙本质，则调整标本夹使根部区域突出；反之亦然。
4. 收集切片
   注：当牙本质在牙冠和根尖区域均等出现时，表明切片角度已合适。
   1. 沿此方向继续切片，并在显微镜下观察切片，直至牙冠和牙根中均可见牙髓。当石蜡样品表面出现磨牙轮廓模糊的影像时，开始收集切片¹⁷。

结果

为了阐明该方法的实际应用，分别对两只健康的C57BL/6小鼠（3月龄，雌性）的右侧下颌第一磨牙进行拔除，并分别观察术后1周和4周的情况。未受损的左侧下颌用作健康对照。图1A展示了手术器械的具体特征，包括26-23 G针头和带齿眼科镊。26 G针头去除了针尖并弯折。25 G针头在针尖处约弯曲25°。23 G针头是手术中的关键部件，在针尖处分别弯曲约25°和35°（图1B1、B2）。镊子具有一个1 mm长的齿状结构，与小鼠磨牙的形态相匹配（图1B3）。图1C显示了小鼠术前的状态，关键点包括头部周围四个固定针的位置，以及将舌头固定在左侧橡皮带下方。

图3A显示了右侧下颌第一磨牙的位置和形态。图3B显示...

讨论

小鼠牙槽骨愈合模型是揭示骨愈合与再生潜在机制的重要方法，最终有助于解决临床难题。已有研究证实了切牙拔除模型和上颌磨牙拔除模型的可行性，但尚未见关于下颌第一磨牙拔除模型的应用报道^13,17,18。然而，切牙对啮齿类动物的生存至关重要，其损伤可能致命。此外，由于上颌骨的骨小梁结构比下颌骨更为疏松，因此在愈合过程中其潜在机制可能存在一定差异。因此，建立一种可行的下颌第一磨牙拔除模型十分必要。

拔牙过程中最重要的考虑因素是避免牙根折断¹⁹。小鼠的磨牙体积小且脆弱，下颌中残留的牙根无法被完全拔除。然而，在本实验方案中，整个手术过程中均存在牙根折断的风险。因此，必须牢固夹持磨牙，并严格控制施加的力度。具体而言，在去除远中阻力时，需注意不要压碎牙冠；在去除近中阻力时，应小心避免针头从牙根分叉处突然滑脱；在使用针头制造间隙时，需明确间隙应位于牙根与牙槽突之间，因此不...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
23/25/26 号针头	成都新津士峰医疗器械 &安普&仪器有限公司	SB1-074(IV)
C57/B6J	中国成都 gempharmatech 实验动物公司	C57/B6J
DAPI染色液	Beyotime	货号 C1005
包埋盒	CITOTEST 科学	80106-1100-16
苏木精和伊红染色试剂盒	Biosharp	BL700B
异氟烷	RWD生命科学有限公司	R510-22-10
马松’s Trichrome 染色试剂盒	Solarbio	G1340
切片机	Leica	RM2235
戊巴比妥钠	华厦化学试剂有限公司	2018042001
兔多克隆	抗Sp7	Abcam 货号 ab22552
镊子	成都新津施丰医疗器械 &安普&仪器有限公司	SB2-115