AMEBaS:偏振单细胞比例荧光延时的自动中线提取和背景减法

Summary

目前用于分析极化单细胞细胞内动力学的方法通常是手动的，缺乏标准化。本文介绍了一种新颖的图像分析管道，用于在用户友好的在线界面中自动提取单偏振细胞的中线，并量化时间流逝的时空行为。

Abstract

细胞极性是一种宏观现象，由空间集中的分子和结构的集合建立，最终导致亚细胞水平上出现专门的结构域。它与发育不对称的形态结构有关，这些结构是细胞分裂、生长和迁移等关键生物学功能的基础。此外，细胞极性的破坏与组织相关疾病有关，如癌症和胃发育不良。

目前评估单个偏振细胞中荧光报告基因时空动力学的方法通常涉及沿着细胞长轴追踪中线的手动步骤，这既耗时又容易产生强烈的偏差。此外，尽管比率分析可以使用两个荧光通道校正报告分子的不均匀分布，但背景减法技术通常是任意的，缺乏统计学支持。

本文介绍了一种新的计算管道，使用细胞极性模型（花粉管/根毛生长和胞质离子动力学）来自动化和量化单个细胞的时空行为。开发了一种三步算法来处理比率图像并提取细胞内动力学和生长的定量表示。第一步将细胞从背景中分割出来，通过像素强度空间中的阈值技术生成二进制掩码。第二步通过骨架化操作追踪穿过细胞中线的路径。最后，第三步将处理后的数据作为比率延时提供，并生成比率测距仪（即随时间变化的一维空间剖面图）。使用来自生长花粉管的遗传编码荧光报告基因获取的比率图像的数据用于对该方法进行基准测试。该管道可以更快、更少、更准确地表示沿极化细胞中线的时空动力学，从而推进可用于研究细胞极性的定量工具包。AMEBaS Python 源代码可在以下网址获得: https://github.com/badain/amebas.git

Introduction

细胞极性是一个基本的生物学过程，在这个过程中，一系列空间集中的分子和结构的协同作用最终导致了专门的形态亚细胞结构域的建立¹。细胞分裂、生长和迁移依赖于这种极性位点，而其丢失与上皮组织相关疾病中的癌症有关^2。

顶端生长的细胞是极性的一个戏剧性例子，其中尖端的极性位点通常重新定向到细胞外线索³。这些包括发育中的神经突、真菌菌丝、根毛和花粉管，其中多个细胞过程显示出从细胞尖端到小腿的明显差异。特别是在花粉管中，肌动蛋白聚合、囊泡运输和离子浓度明显极化，显示出以尖端为中心的梯度⁴。花粉管是开花植物的雄配子体，负责将精子细胞输送到胚珠，以单个细胞已知的最快生长速度之一仅在细胞的顶端生长。钙⁵ （Ca²+） 和质子 6 （H⁺） 等离子的尖端聚焦梯度在维持花粉管生长中起着重要作用，这对于实现其主要生物学功能至关重要，最终导致双重受精 ^5,6。因此，分析顶端生长细胞中线时空动力学的定量方法对于研究极化生长的细胞和分子机制至关重要

Protocol

1. 交互式笔记本协议

Jupyter 笔记本可以在 https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb 上使用 Google Colab 直接在 Web 上使用，以下说明基于该说明。或者，Jupyter 笔记本可在 https://github.com/badain/amebas 获得，可以在其中下载并配置为在 Jupyter 中本地运行（Anaconda 可以提供简单的跨平台安装过程）。完整的测试数据可以在Zenodo（https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350）找到，其中包含表达pH或Ca²⁺ 报告基因的拟南芥花粉管的单通道和双通道数据¹⁴。管道已分为多个部分，在设置用户特定选项后，可以通过单击播放按钮来执行每个步骤。本研究所需的文件可在 AMEBaS- 主 zip 文件夹（补充编码文件 1）中找到。

1. 打开 Jupyter 笔记本并读取延时摄影文件。
   1. 导航到上面提到的 Google Colab 中交互式笔记本的主页，或从 GitHub 下载并打开 AMEBaS_Local.ipynb 笔记本。
   2. 为输....

Results

AMEBaS 流程可自动从荧光显微镜图像堆栈中提取偏振单细胞的中线动态，从而减少耗时且不易出现人为错误。该方法通过在生长的单细胞中生成kymographs和比率图像堆栈（图1）来量化这些时间流逝。它可以调整为用于迁移单个细胞，但还需要进一步的实验。AMEBaS 在 Python 中作为交互式 Jupyter Notebook（在 交互式 Notebook 协议部分中描述）实现，无需编程经验即可更轻松地使用，并作为命令行工具（在 批处理模式协议部分中），其中可以使用相同的参数集分析多个堆栈。虽然可以使用一个或两个荧光通道，但具有两个发射通道的比率探针应该产生更可靠的结果，因为探针未结合状态的荧光发射可以减轻由蛋白质在细胞质中分布不均匀引起的空间异质性。

流水线首先生成最强通道上最大单元的二进制掩码，导出为名为 Filename_binary_mask.tiff 的 tif 文件（图 .......

Discussion

这里介绍的新方法是一种有效的工具，可以简化和自动化偏振细胞的荧光显微镜图像堆栈的分析。文献中描述的当前方法，例如 ImageJ Kymograph 插件，需要手动跟踪目标偏振细胞的中线，这项任务不仅耗时，而且容易出现人为错误。由于该管道中中线的定义由执行骨架化的数值方法^18,19 支持，因此消除了主观评估^，从而为该过程引入了定量标准。这对于拥有大量数据的研究人员特别有用，可以根据不同的需求定制管道，包括提取每一帧的中线。此外，背景值减法通常是任意的，为给定通道的所有帧手动选择单个背景值。在这里，等值数据分割用于客观地确定每一帧的背景阈值，并（可选）使用局部多项式回归对其进行平滑处理，以捕获由褪色（光漂白）引起的荧光的长期变化。虽然通过按像素面积选择较大的对象，在背景中可以忽略可能的伪影和次要元素，但可以使用其他方法（如 FRET-IBRA¹²）来消除阴影等效果。空间伪影（如阴影）会影响通过阈值分割的细胞的形状，这可能解释了在AMEBaS徽标上的比率视频中看到的梯度偏向管的一.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Github	Github		https://github.com/badain/amebas
Google Colab	Google		https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb