目前用于分析极化单细胞内动态的方法通常依赖人工操作，且缺乏标准化。本文介绍了一种新颖的图像分析流程，可在用户友好的在线界面中自动提取单个极化细胞的中线，并对延时成像中的时空行为进行量化。
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本文内容
摘要
摘要
细胞极性是一种由空间上聚集的分子和结构共同建立的宏观现象，最终在亚细胞水平上形成特化的功能区域。该现象与产生不对称形态结构相关，这些结构是细胞分裂、生长和迁移等关键生物学功能的基础。此外，细胞极性的破坏已被证实与多种组织相关疾病有关，例如癌症和胃部发育异常。
目前评估单个极化细胞中荧光报告分子时空动态的方法通常需要手动沿细胞长轴描绘中线，这一过程耗时且容易引入显著偏差。此外，尽管比率分析可通过两个荧光通道校正报告分子分布不均的问题，但背景扣除技术往往具有任意性，且缺乏统计学支持。
本文介绍了一种新颖的计算流程，用于通过细胞极性模型——花粉管/根毛生长及胞质离子动态——自动分析并量化单个细胞的时空行为。该流程开发了一种三步算法，用于处理比率成像图像，并提取细胞内动态与生长的定量表征。第一步通过像素强度空间中的阈值技术，将细胞与背景分离，生成二值化掩膜。第二步通过骨架化操作，沿细胞中线追踪一条路径。最后，第三步将处理后的数据以比率时间序列形式呈现，并生成比率显影图（即随时间变化的一维空间剖面图）。本方法利用来自生长中花粉管的基因编码荧光报告分子所获取的比率成像数据进行了验证。该流程可更快速、更少偏差且更准确地表征极化细胞中线上的时空动态，从而推进了研究细胞极性可用的定量工具集。AMEBaS Python 源代码位于： https://github.com/badain/amebas.git
引言
细胞极性是一种基本的生物学过程，其中一系列空间聚集的分子和结构协同作用，最终形成特化的形态学子细胞区域1。细胞分裂、生长和迁移均依赖于此类极性位点，而极性的丧失则与上皮组织相关疾病中的癌症发生有关2。
顶端生长的细胞是极性现象的一个显著例子，其细胞顶端的极性位点通常会对外部胞外信号重新定向3。这类细胞包括正在发育的神经突、真菌菌丝、根毛和花粉管，其中多种细胞过程从细胞顶端向主干方向表现出明显差异。特别是在花粉管中，肌动蛋白聚合、囊泡运输以及离子浓度均呈现显著的极性分布，形成以顶端为中心的梯度分布模式4。花粉管是开花植物的雄配子体，负责通过细胞顶端进行快速生长，将精子细胞递送至胚珠，其生长速率在单细胞中属于已知最快之列。钙离子5（Ca2+）和质子6（H+）等离子的顶端聚焦梯度在维持花粉管生长中起着关键作用，这对于实现其主要生物学功能——最终完成双受精过程——至关重要5,6。因此，定量分析顶端生长细胞中轴线上时空动态变化的方法，对于研究极....
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方案
1. 交互式笔记本实验方案
可直接在网页上使用 Google Colab 运行 Jupyter 笔记本，地址为 https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb，下文所述操作说明即基于此平台。或者，也可从 https://github.com/badain/amebas 获取该 Jupyter 笔记本，下载后在本地 Jupyter 环境中运行（Anaconda 可提供简便且跨平台的安装方式）。完整的测试数据可在 Zenodo 上获取（https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350），其中包含表达 pH 或 Ca2+ 报告分子的拟南芥花粉管的单通道和双通道数据14。分析流程已被划分为多个部分，每个步骤均可在设置用户特定选项后，通过点击播放按钮执行。本研究所需文件包含在 AMEBaS- main 压缩文件夹中（补充代码文件 1）。
- 打开 Jupyter 笔记本并读取延时成像文件。
- 访问上述 Google Colab 中交互式笔记本的主页，或下载并打开该笔记本 AMEBaS_Local.ipynb 从 GitHub 获取....
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结果
AMEBaS 流程可自动从荧光显微镜图像序列中提取极化单细胞的中线动态信息，从而减少耗时并降低人为误差。该方法通过在生长的单细胞中生成明暗图（kymographs）和比率图像序列（图1）来量化这些时间变化过程。该流程可调整用于迁移中的单细胞分析，但尚需进一步实验验证。AMEBaS 以 Python 编写，提供交互式 Jupyter Notebook 实现形式（详见交互式笔记本协议部分），便于无编程经验的用户使用；同时也提供命令行工具形式（见批量模式协议部分），可用于对多个图像序列使用相同参数集进行分析。尽管可使用一个或两个荧光通道，但建议采用具有两个发射通道的比率探针，因为探针未结合状态的荧光发射可减轻细胞质中蛋白质分布不均所引起的空间异质性。
该流程首先在最强通道上生成最大细胞的二值化掩膜，并导出为名为 Filename_binary_mask.tiff (图2.......
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讨论
本文介绍的新方法是一种强大的工具，可用于简化和自动化极化细胞荧光显微镜图像堆栈的分析。目前文献中描述的方法（如ImageJ的Kymograph插件）需要手动追踪目标极化细胞的中线，这一过程不仅耗时，而且容易引入人为误差。本流程中，中线的定义由一种数值方法支持18,19，该方法执行骨架化处理，从而消除了主观判断，为该过程引入了定量标准。这对于拥有大量数据的研究人员尤为有用，且该流程可根据不同需求进行定制，包括为每一帧提取中线。此外，背景值的扣除通常是任意的，往往由人工为某一通道的所有帧选择单一背景值。本文采用等值区域（isodata）分割法，客观地确定每一帧的背景阈值，并可选地通过局部多项式回归对其进行平滑处理，以捕捉由荧光衰减（光漂白）引起的长期变化。尽管在背景选择中通过像素面积选取较大对象的方式忽略了可能的伪影和次要成分，但也可采用其他方法（如FRET-IBRA12）来消除阴影等效应。空间伪影（如阴影）可能影响通过阈值分割得到的细胞形态，这可能是AMEBaS标志所示比率成.......
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披露
本文作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。
致谢
作者感谢圣保罗研究基金会（FAPESP）提供的资助，项目编号为 2015/22308-2、2019/23343-7、2019/26129-6、2020/06744-5、2021/05363-0，以及巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）、美国国立卫生研究院（NIH）R01 基金 GM131043 和美国国家科学基金会（NSF）基金 MCB1714993、MCB1930165 提供的经费支持。根毛数据在 Andrea Bassi 教授和 Alex Costa 教授的指导和基础设施支持下完成。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Github | Github | https://github.com/badain/amebas | |
| Google Colab | 谷歌 | https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb |
参考文献
- Drubin, D. G., Nelson, W. J. Origins of cell polarity. Cell. 84 (3), 335-344 (1996).
- Wodarz, A., Näthke, I. Cell polarity in development and cancer. Nature Cell Biology. 9 (9), 1016-1024 (2007).
- Palanivelu, R., Preuss, D.
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重印与许可
