本文介绍了一种高效、简便且快速的三维培养方案，用于两种斑马鱼（Danio rerio）细胞系——ZEM2S（胚胎细胞）和 ZFL（正常肝细胞）——的球状体形成。
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本文内容
摘要
摘要
鱼类细胞系具有广阔的应用前景 体外 生态毒理学评估模型；然而，传统的单层培养系统（二维培养）存在众所周知的局限性（例如，培养寿命及某些功能的维持） 体内 细胞功能）。因此，人们提出了类球体等三维培养模型，因为这些模型能够重现类似组织的结构，更真实地模拟 体内 条件。本文介绍了一种高效、简便且快速的三维培养方案，用于利用两种斑马鱼（斑马鱼细胞系：ZEM2S（胚胎来源）和 ZFL（正常肝细胞）。该方案包括将细胞接种于圆底、超低吸附性 96 孔板中，在 70 rpm 转速下振荡培养 5 天后，每孔形成一个单一类球体。所形成的类球体具有稳定的大小和形态，该方法可避免单孔内形成多个类球体，因此无需手动挑选大小一致的类球体。该类球体构建方法操作简便、快速且可重复性强，适用于高通量实验 体外 检测。
引言
类球体是在三维培养条件下，细胞紧密接触生长而形成的细胞小球。类球体具有模拟 体内 组织微环境已在多种细胞系和原代细胞中得到研究1,2然而，尽管球状体已广泛应用于哺乳动物的毒性研究，但针对非哺乳类脊椎动物（如鱼类）的毒性研究用球状体的开发仍处于进行中3对于鱼类细胞系，类球体已通过多种不同方法制备，例如使用不同类型的培养板进行轨道振荡（OS）3,4,5,6,7，以及利用磁性纳米颗粒的磁悬浮方法8然而，某些用于球体培养的方法可能存在较多缺点。
例如，在大型微孔板（24孔板）中使用旋转法可能产生大量大小和形状各异的类球体；事实上，已有研究证实可形成多类球体结构7。因此，实验前需耗费大量人力手动挑选大小和形态相似的类球体。悬滴三维培养法常用于哺乳动物细胞系类球体的制备
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方案
在圆底96孔板中生成ZFL和ZEM2S细胞系三维球状体的关键步骤如图1所示。
注意：有关本实验方案中使用的所有材料的详细信息，请参见材料表；本实验方案中所用溶液和培养基的详细信息，请参见表1。
1. 细胞培养基与单层细胞培养
- 将两种细胞系（ZFL、ZEM2S）在28 °C、无CO2的培养箱中以单层形式培养，当细胞融合度达到约80%时，按1:3的传代比例进行传代。
- 从一个培养至约80%融合度的T75培养瓶中开始，该瓶中的斑马鱼细胞按上述方法培养。
- 移除完全培养基，并借助移液器向培养瓶中加入1×磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01 M）清洗细胞。
- 借助移液器向培养瓶中加入3 mL 1×胰蛋白酶-0.5 mM EDTA（0.05% [v/v]），在28 °C下孵育3分钟，使细胞从培养瓶表面脱落。
- 轻轻敲击培养瓶以释放细胞，然后加入3 mL完全培养基终止胰蛋白酶消化作用。
- 使用移液器将细胞悬液转移至15 mL圆锥形离心管中，在100 × g 条件下离心5分钟。
- 待细胞沉淀形成后，....
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结果
通过该方法可在每个孔中形成大小和形状稳定的单个球状体。图2展示了在ULA板的孔中，ZFL和ZEM2S细胞在轨道振荡（70 rpm）条件下单个球状体的形成过程。ZFL和ZEM2S细胞系在三维培养中表现出不同的行为。ZEM2S细胞系自轨道振荡第一天起即表现出易于形成球状结构的特征（图2E），而ZFL细胞系则需要5天才能达到理想的球状形态（图2A-C）。通过该方法生成的球状体在更长时间的培养中（>5天）也表现出良好的形态稳定性，如图2D（16天龄的ZFL球状体）和图2H（10天龄的ZEM2S球状体）所示。球状体的直径和圆形度通过使用科学图像处理与分析软件对所获图像中的投影面积进行测量确定13（.......
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讨论
这是一种简单、便捷且快速的方法，用于生成斑马鱼肝细胞和胚胎细胞系的球状体。本研究团队在现有三维球状体方法的基础上进行改进，开发了该方法，以克服科学文献中报道的与球状体形成相关的问题，以及三维球状体检测中数据准确性存在的不确定性。例如，已有报道指出，传统方法存在操作困难、生成球状体耗时、进行检测前需挑选大小和形状相似的球状体，以及在悬滴法中将球状体从液滴转移至微孔板过程中存在技术难题3,7,12。此外，本实验方案建议在无CO2条件下培养ZFL和ZEM2S细胞系。本方案中针对这两种细胞系所推荐的培养基组成及无CO2培养环境在文献中已有广泛报道。ZFL细胞系通常在L-15和RPMI培养基中培养，可添加或不添加碳酸氢钠，且无需CO2环境14,15,
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
谨以此文纪念本文的共同作者 Márcio Lorencini 博士，他是一位杰出的化妆品领域研究人员，毕生致力于推动巴西的化妆品研究。作者感谢巴拉那联邦大学生理学系多用户实验室提供的设备支持，以及高等教育人员改善协调机构（CAPES，巴西）（资助代码 001）和 Grupo Boticário 提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔透明圆底超低吸附微孔板，独立包装，带盖，无菌 | Corning | 7007 | |
| DMEM，粉末，高糖，含丙酮酸钠 | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 营养混合物，粉末 | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Java图像处理与分析软件（ImageJ）1.52p 版 | National Institutes of Health, USA | 可访问网址：https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 培养基，粉末 | Gibco | 41300021 | |
| 轨道摇床 | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm 旋转直径 |
| Dulbecco's PBS (10倍浓度)，含钙和镁 | Invitrogen | 14080055 | |
| 青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL） | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 培养基 | Gibco | 31800-014 | |
| FBS－胎牛血清，经鉴定合格，来自美国农业部批准地区 | Gibco | 12657-029 | |
| 碳酸氢钠，粉末，分子生物学级生物试剂 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 台盼蓝染液（0.4%） | Gibco | 15250-061 | |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.5%），不含酚红 | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S 细胞系 | ATCC | CRL-2147 | 该细胞系由美国威斯康星大学密尔沃基分校 Michael J. Carvan 教授惠赠 |
| ZFL 细胞系 | BCRJ | 256 |
参考文献
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K.
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