需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

一种斑马鱼胚胎和肝脏细胞系球状体的三维培养方法

3.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/64859

⸱

2023年1月20日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department, Grupo Boticário, 3Department of Cell Biology, Federal University of Paraná (UFPR), 4Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR)

本文内容

摘要

本文介绍了一种高效、简便且快速的三维培养方案，用于两种斑马鱼（Danio rerio）细胞系——ZEM2S（胚胎细胞）和 ZFL（正常肝细胞）——的球状体形成。

摘要

鱼类细胞系具有广阔的应用前景 体外 生态毒理学评估模型；然而，传统的单层培养系统（二维培养）存在众所周知的局限性（例如，培养寿命及某些功能的维持） 体内 细胞功能）。因此，人们提出了类球体等三维培养模型，因为这些模型能够重现类似组织的结构，更真实地模拟 体内 条件。本文介绍了一种高效、简便且快速的三维培养方案，用于利用两种斑马鱼（斑马鱼细胞系：ZEM2S（胚胎来源）和 ZFL（正常肝细胞）。该方案包括将细胞接种于圆底、超低吸附性 96 孔板中，在 70 rpm 转速下振荡培养 5 天后，每孔形成一个单一类球体。所形成的类球体具有稳定的大小和形态，该方法可避免单孔内形成多个类球体，因此无需手动挑选大小一致的类球体。该类球体构建方法操作简便、快速且可重复性强，适用于高通量实验 体外 检测。

引言

类球体是在三维培养条件下，细胞紧密接触生长而形成的细胞小球。类球体具有模拟 体内 组织微环境已在多种细胞系和原代细胞中得到研究1,2然而，尽管球状体已广泛应用于哺乳动物的毒性研究，但针对非哺乳类脊椎动物（如鱼类）的毒性研究用球状体的开发仍处于进行中3对于鱼类细胞系，类球体已通过多种不同方法制备，例如使用不同类型的培养板进行轨道振荡（OS）3,4,5,6,7，以及利用磁性纳米颗粒的磁悬浮方法8然而，某些用于球体培养的方法可能存在较多缺点。

例如，在大型微孔板（24孔板）中使用旋转法可能产生大量大小和形状各异的类球体；事实上，已有研究证实可形成多类球体结构7。因此，实验前需耗费大量人力手动挑选大小和形态相似的类球体。悬滴三维培养法常用于哺乳动物细胞系类球体的制备1,2,9,10,11，该方法可在每个液滴中生成单个类球体，从而避免上述问题。然而，尽管改良的悬滴法（悬滴结合轨道振荡）能够以低成本方法生成ZFL类球体，但仍存在一些缺点12。所形成的细胞聚集体无法在液滴中长期维持，因此必须将其转移至孔板中。该过程需要大量操作，并需在超净工作台中长时间逐滴使用微量移液器完成12。此外，该方法需要10天时间才能完全形成ZFL类球体（5天悬滴培养 + 5天OS培养）12。这些局限性可能制约三维鱼类类球体在毒性测试中的应用，尤其是在化学品优先排序和产品可持续性等潜在应用方面。

因此，本文描述了一种3D培养方案，该方案基于96孔超低吸附板（ULA板）和轨道摇床（22 mm旋转直径）的联合使用，能够生成ZFL（D. rerio 正常肝细胞）和ZEM2S（D. rerio 囊胚期胚胎）细胞系的单个球状体。该方法操作简便且可重复，在较短时间内（5天）即可产生大量大小和形态相似的球状体。该方法的优势有助于推动鱼类3D模型在工业和学术界水生毒性研究中的应用，以及促进生态毒性测试替代方法的发展。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

在圆底96孔板中生成ZFL和ZEM2S细胞系三维球状体的关键步骤如图1所示。

注意：有关本实验方案中使用的所有材料的详细信息，请参见材料表；本实验方案中所用溶液和培养基的详细信息，请参见表1。

1. 细胞培养基与单层细胞培养

  1. 将两种细胞系（ZFL、ZEM2S）在28 °C、无CO2的培养箱中以单层形式培养，当细胞融合度达到约80%时，按1:3的传代比例进行传代。
    1. 从一个培养至约80%融合度的T75培养瓶中开始，该瓶中的斑马鱼细胞按上述方法培养。
    2. 移除完全培养基，并借助移液器向培养瓶中加入1×磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01 M）清洗细胞。
    3. 借助移液器向培养瓶中加入3 mL 1×胰蛋白酶-0.5 mM EDTA（0.05% [v/v]），在28 °C下孵育3分钟，使细胞从培养瓶表面脱落。
    4. 轻轻敲击培养瓶以释放细胞，然后加入3 mL完全培养基终止胰蛋白酶消化作用。
    5. 使用移液器将细胞悬液转移至15 mL圆锥形离心管中，在100 × g 条件下离心5分钟。
    6. 待细胞沉淀形成后，小心吸除上清液，加入1 mL相应细胞系（ZFL或ZEM2S）的完全培养基，并用移液器重悬细胞。取部分细胞悬液用于细胞计数。

2. 使用台盼蓝染料排斥法进行细胞计数

  1. 取 10 µL 细胞悬液和 10 µL 台盼蓝染液加入微量离心管中，用于细胞计数和活力评估。使用移液器混匀细胞悬液与染液。
  2. 然后，取 10 µL 上述混合液（细胞悬液 + 台盼蓝）加入血细胞计数板（Neubauer 计数室），计数位于计数室四角的四个大方格（象限：Q）中的细胞，未被台盼蓝染色的细胞视为活细胞。使用公式（1）计算活细胞数量：
    细胞数量计算公式，ΣQ/4 × 10⁴，定量分析用公式示意图     （1）
  3. 为计算细胞悬液中的最终细胞数量，需将通过公式（1）得出的细胞数乘以 2（因使用台盼蓝导致的稀释倍数）。
    注：也可使用自动细胞计数系统。

3. 在 ULA-培养板中进行细胞接种

  1. 计算细胞数量后，将细胞悬液调整至适宜浓度用于接种培养板 200 µL 每孔加入该悬浮液，接种于96孔圆底超低吸附板中，每种细胞系所需细胞数量如下所示：
    1. 接种7,000个存活细胞 ZFL 每孔细胞数；因此，对于整块ULA板，使用700,000个细胞加入20 mL完全培养基中。
    2. 接种 3,500 个可存活细胞 ZEM2S 每孔细胞数；因此，对于整块ULA板，使用350,000个细胞加入20 mL完全培养基中。
  2. 在培养基储液槽中制备调整好细胞浓度的细胞悬液，并使用多通道移液器轻轻混匀，注意避免产生泡沫或气泡。使用多通道移液器加入 200 µL 将调整后的细胞悬液加入超低吸附培养板（ULA-plate）的每孔中。
    注意：必须使用石蜡膜或压敏封口膜密封培养板，以防止96孔板中的培养基蒸发。

4. 类球体形成

  1. 将ULA板置于28 °C培养箱中，在70 rpm的摇床上孵育5天。通过5天的旋转摇动使球状体形成（图2），其平均直径达到约225 µm（ZFL球状体）和约226 µm（ZEM2S球状体）12。
    注意：孵育5天后（此时圆形度最大），球状体即可用于后续实验。
  2. 若需将球状体在培养中维持超过5天，每5天用多通道移液器移除100 µL用过的培养基，并加入100 µL新鲜的完全培养基。
    ​注意：操作过程中注意避免吸出球状体。

5. 类球体大小（直径）和形态（圆形度指数）的测量

  1. 获取图像。
    1. 在配备图像采集系统的倒置光学显微镜下，获取一个已知标尺的图像。
      注意：使用显微镜载物台校准载玻片或已知象限尺寸的血细胞计数板（Neubauer板）来获取比例尺。
    2. 在显微镜下，使用获取刻度图像时所用的同一物镜，拍摄完全形成的球状体（即.，5天大的球体。
      注意：所有图像必须使用相同的成像采集系统拍摄，因为图像分辨率对于确定类球体的大小和形状至关重要，而不同类型的系统之间分辨率可能存在差异。
  2. 设置比例尺。
    1. 使用 ImageJ 软件打开已定义尺度的图像（点击 文件 | 打开).
    2. 选择 直线选择器 从工具栏中选择，并用鼠标在图像中已定义标尺的延长线上拖动以绘制一条线。
    3. 设置比例尺，通过选择 分析 | 设置比例尺，并等待 设定比例尺 窗口打开。
    4. 在 设置比例尺 窗口，填写空白处 已知距离 已知距离（µm）对应于直线；填充 长度单位 与 um 用于 µm. 点击 好的.
      注意：比例尺单位为像素/µm 显示在窗口底部。
  3. 设置测量参数。
    1. 在 ImageJ 软件中，选择 分析 | 设置测量参数 打开 设置测量参数 窗口
    2. 在 设置测量参数 窗口中，选中所需测量项目的复选框（即， 面积 和 形态 描述符）。点击 好的.
  4. 测量类球体的直径和圆度。
    1. 打开类球体的图像（文件 | 打开).
    2. 选择 自由选择工具 在工具栏中，使用鼠标选择类球体的外侧，如图所示 图3A.
      注意：要放大或缩小图像，请按住 Ctrl 键并使用鼠标向上或向下滚动，或按下 Ctrl 使用键盘上的向上或向下箭头键进行选择。
    3. 选择 分析 | 测量 以打开 结果 窗口，用于显示测量值。
    4. 使用 面积 值，使用公式（计算球状体的大小（直径）2):
      圆直径的计算公式：\(d = \sqrt{\frac{\text{面积}}{\pi}} \times 2\)；几何代数。     (2)
    5. 圆形度指数在结果窗口中显示为“Circ.”，并由软件根据公式（3):
      形状紧凑度公式，\(4\pi \times \frac{\text{面积}}{\text{周长}^2}\)，数学方程。     (3)
      注意：圆形度指数为1.0时代表完美的球形形态，而接近0.0的值则表示细长的形态13.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

通过该方法可在每个孔中形成大小和形状稳定的单个球状体。图2展示了在ULA板的孔中，ZFL和ZEM2S细胞在轨道振荡（70 rpm）条件下单个球状体的形成过程。ZFL和ZEM2S细胞系在三维培养中表现出不同的行为。ZEM2S细胞系自轨道振荡第一天起即表现出易于形成球状结构的特征（图2E），而ZFL细胞系则需要5天才能达到理想的球状形态（图2A-C）。通过该方法生成的球状体在更长时间的培养中（>5天）也表现出良好的形态稳定性，如图2D（16天龄的ZFL球状体）和图2H（10天龄的ZEM2S球状体）所示。球状体的直径和圆形度通过使用科学图像处理与分析软件对所获图像中的投影面积进行测量确定13（...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

这是一种简单、便捷且快速的方法，用于生成斑马鱼肝细胞和胚胎细胞系的球状体。本研究团队在现有三维球状体方法的基础上进行改进，开发了该方法，以克服科学文献中报道的与球状体形成相关的问题，以及三维球状体检测中数据准确性存在的不确定性。例如，已有报道指出，传统方法存在操作困难、生成球状体耗时、进行检测前需挑选大小和形状相似的球状体，以及在悬滴法中将球状体从液滴转移至微孔板过程中存在技术难题3,7,12。此外，本实验方案建议在无CO2条件下培养ZFL和ZEM2S细胞系。本方案中针对这两种细胞系所推荐的培养基组成及无CO2培养环境在文献中已有广泛报道。ZFL细胞系通常在L-15和RPMI培养基中培养，可添加或不添加碳酸氢钠，且无需CO2环境14,15,

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

谨以此文纪念本文的共同作者 Márcio Lorencini 博士，他是一位杰出的化妆品领域研究人员，毕生致力于推动巴西的化妆品研究。作者感谢巴拉那联邦大学生理学系多用户实验室提供的设备支持，以及高等教育人员改善协调机构（CAPES，巴西）（资助代码 001）和 Grupo Boticário 提供的经费支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96孔透明圆底超低吸附微孔板，独立包装，带盖，无菌Corning7007
DMEM，粉末，高糖，含丙酮酸钠Gibco12800-017
Ham's F-12 营养混合物，粉末Gibco21700026
HEPES (1 M)Gibco15630080
Java图像处理与分析软件（ImageJ）1.52p 版 National
Institutes of Health, USA		可访问网址：https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Leibovitz's L-15 培养基，粉末Gibco41300021
轨道摇床 WarmnestKLD-350-BI22 mm 旋转直径
Dulbecco's PBS (10倍浓度)，含钙和镁Invitrogen14080055
青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL）Gibco15140122
RPMI 1640 培养基Gibco31800-014
FBS－胎牛血清，经鉴定合格，来自美国农业部批准地区Gibco12657-029
碳酸氢钠，粉末，分子生物学级生物试剂 Sigma-AldrichS5761
台盼蓝染液（0.4%）Gibco15250-061
胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.5%），不含酚红Gibco15400054
ZEM2S 细胞系ATCCCRL-2147该细胞系由美国威斯康星大学密尔沃基分校 Michael J.
Carvan 教授惠赠
ZFL 细胞系BCRJ256

参考文献

  1. Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).
  2. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
  3. Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes. Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).
  4. Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. Fish hepatocyte spheroids - A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity. Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470(2022).
  5. Baron, M. G., et al. Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance. PloS One. 12 (1), 0168837(2017).
  6. Langan, L. M., et al. Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model. Frontiers in Pharmacology. 9, 947(2018).
  7. Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1. Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).
  8. Jeong, Y., et al. Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture. Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161(2016).
  9. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720(2011).
  10. Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).
  11. Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).
  12. de Souza, I. R., et al. Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods. Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).
  13. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ user guide. ImageJ/Fiji. 1, 151-161 (2012).
  14. Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368(2021).
  15. da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755(2020).
  16. Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966(2020).
  17. Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
  18. Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
  19. Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892(2020).
  20. Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24(2021).
  21. ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2022).
  22. Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187(2016).
  23. Gajski, G., et al. Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).
  24. Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843(2021).
  25. Mueller-Klieser, W. Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids. Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).
  26. Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
  27. Ho, R. K., Kimmel, C. B. Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo. Science. 261 (5117), 109-111 (1993).
  28. Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).
  29. Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
  30. He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

三维细胞培养斑马鱼类球体类球体形成鱼类细胞系ZFL细胞系ZEM2S细胞系轨道振荡超低吸附培养板MTT活力检测生态毒性评估
一种斑马鱼胚胎和肝脏细胞系球状体的三维培养方法
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。