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方法文章

斑马鱼细胞系的细胞毒性检测

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DOI：

10.3791/64860

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2023年1月6日

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1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department, Grupo Boticário, 3Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR)

本文内容

摘要

本方案介绍了常用于评估斑马鱼胚胎（ZEM2S）和斑马鱼肝细胞（ZFL）系在96孔板中细胞毒性的检测方法（Alamar Blue [AB]、CFDA-AM、中性红和MTT检测）。

摘要

鱼类细胞系在生态毒理学研究中日益得到广泛应用，细胞毒性检测已被提出作为预测鱼类急性毒性的方法。因此，本实验方案介绍了经改良的细胞毒性检测方法，用于评估斑马鱼（zebrafish）细胞的存活率斑马鱼) 胚胎（ZEM2S）和肝脏（ZFL）细胞系置于96孔板中。所评估的细胞毒性终点包括线粒体完整性（Alamar Blue [AB] 和 MTT 检测）以及膜完整性 通过 酯酶活性（CFDA-AM 检测）和溶酶体膜完整性（中性红 [NR] 检测）。在96孔板中暴露于待测物质后，进行细胞毒性检测；其中 AB 和 CFDA-AM 检测在同一块板上同时进行，随后进行 NR 检测，而 MTT 检测则在另一块独立的板上进行。AB 和 CFDA-AM 检测的读数采用荧光法，MTT 和 NR 检测采用吸光度法。利用这些鱼类细胞系进行的细胞毒性检测可用于研究化学物质对鱼类的急性毒性。

引言

化学物质需要针对其对人类健康和环境的安全性进行测试。分子和细胞生物标志物在安全性评估中正受到监管机构和/或立法机构（如 REACH、OECD、US EPA）越来越多的重视，以预测其对生物体的影响。1,2，因为它们可能先于 体内 不良结局（例如，内分泌干扰、免疫反应、急性毒性、光毒性）3,4,5,6,7在此背景下，细胞毒性被用作预测鱼类急性毒性的指标5,8；然而，它在生态毒理学研究中还可有多种其他应用，例如确定化学物质的亚细胞毒性浓度，以研究其对鱼类产生的各种不同效应（如.，内分泌干扰效应）。

在细胞培养系统（体外系统）中，化学物质的细胞毒性可通过不同类型的终点指标方法进行测定。例如，某些细胞毒性方法可基于细胞死亡过程中观察到的特定形态学变化作为终点指标，而另一些方法则可通过检测细胞死亡、活力与功能、形态、能量代谢以及细胞贴壁与增殖等指标来确定细胞毒性。化学物质可通过多种不同机制影响细胞活力，因此有必要采用涵盖多种细胞活力终点指标的评估方法，以准确预测化学物质的效应9。

MTT 和 Alamar Blue（AB）是基于细胞代谢活性来测定对细胞活力影响的检测方法。MTT 检测法评估线粒体酶琥珀酸脱氢酶的活性10。只有在活细胞中，黄色的 3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）才会被还原为蓝紫色的甲臜，其光密度与活细胞数量成正比10。AB 检测法是一种灵敏的氧化还原指示剂，由线粒体酶介导，活细胞将刃天青还原为试卤灵时会发出荧光并发生颜色变化11；然而，胞质和微粒体酶也参与 AB 和 MTT 的还原过程12。这些酶可能包括多种还原酶，如醇和醛氧化还原酶、NAD(P)H:醌氧化还原酶、黄素还原酶、NADH 脱氢酶以及细胞色素11。

中性红（Neutral Red, NR）检测法是一种基于活细胞对染料摄取能力的细胞活力检测方法，其原理是该染料可被活细胞的溶酶体摄取13。中性红的摄取依赖于细胞维持pH梯度的能力。溶酶体内部的质子梯度使其pH值低于细胞质。在正常的生理pH条件下，中性红的净电荷约为零，使其能够穿透细胞膜。进入细胞后，染料被质子化而带电，并被保留在溶酶体内。因此，被保留的中性红越多，表明活细胞数量越多14。任何损伤细胞表面或溶酶体膜的化学物质都会影响该染料的摄取。

CFDA-AM 检测是一种基于保留 5-羧基荧光素二乙酸乙酰氧基甲基酯（CFDA-AM）的荧光法细胞活力检测方法15。5-CFDA-AM 作为一种酯酶底物，可被转化为羧基荧光素，后者是一种具有极性且无法透过活细胞膜的荧光物质15；因此，该物质保留在完整细胞膜的内侧，表明细胞具有活性。

最近，三种细胞毒性检测方法（CFDA-AM、NR 和 AB 检测）被整合到一项经过验证的 ISO（国际标准化组织）指南（ISO 21115:2019）16 和经济合作与发展组织（OECD）测试方法（OECD TG 249）中，用于在 24 孔板中利用 RTgill-W1 细胞系（源自虹鳟 [Oncorhynchus mykiss] 鳃组织的永生化细胞系）评估鱼类急性毒性17。尽管目前已存在基于细胞的鱼类急性毒性预测方法，但研究人员仍致力于开发适用于其他鱼类物种的类似方法，并提高该方法的通量。一些实例包括：构建转染了特定毒性通路报告基因的 ZFL 细胞系18,19、在 RTgill-W1 细胞系中开展光毒性测试20，以及利用 ZFL 和 ZF4 细胞系（源自 1 日龄斑马鱼胚胎的成纤维细胞）结合多种细胞毒性检测方法评估毒性21。

Danio rerio（斑马鱼）是水生毒性研究中使用的主要鱼类物种之一；因此，基于斑马鱼细胞系的鱼类毒性检测方法可能具有重要价值。ZFL 细胞系是一种斑马鱼上皮性肝细胞系，具有肝脏实质细胞的主要特征，能够代谢外源性化合物7,22,23,24,25。而 ZEM2S 细胞系则是一种来源于囊胚期的斑马鱼胚胎成纤维细胞系，可用于研究对鱼类发育的影响26,27。因此，本实验方案描述了四种细胞毒性检测方法（MTT 法、AB 法、NR 法和 CFDA-AM 法），并进行了相应优化，适用于在 96 孔板中对 ZFL 和 ZEM2S 细胞系进行检测。

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方案

注意：本实验方案所用材料的列表请参见材料表，所用溶液和培养基的组成请参见表1。

1. 准备 ZFL 和 ZEM2S 细胞

  1. 取一个培养在相应完全培养基中、汇合度为80%的ZFL或ZEM2S细胞T75培养瓶，在28 °C条件下培养，无需CO2环境。
  2. 移除培养瓶中的培养基，加入10 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01 M）洗涤细胞。向培养瓶中加入3 mL 1×胰蛋白酶（0.05% v/v；含0.5 mM胰蛋白酶-EDTA），在28 °C下孵育3分钟。
  3. 轻轻敲击培养瓶使细胞脱落，随后加入3 mL完全培养基以终止胰蛋白酶消化反应。
  4. 将细胞悬液转移至15 mL圆锥形离心管中，在100 × g条件下离心5分钟。
  5. 离心后小心弃去上清液，加入1 mL ZFL或ZEM2S细胞的完全培养基，使用移液器重悬细胞沉淀。

2. 台盼蓝染料排斥法细胞计数

  1. 添加 10 µL 细胞悬液的 10 µL 将台盼蓝染料加入微量离心管中，用于细胞计数和活力评估。使用移液器混合细胞悬液与染料。
  2. 然后，转移 10 µL 将此混合液（细胞悬液 + 台盼蓝）加入血细胞计数板的纽鲍尔计数室中，计数位于计数室四角的四个大方格（象限 Q）内的细胞，未被台盼蓝染色的细胞视为活细胞。使用公式（1):
    细胞计数计算公式，ΣQ/4 × 10^4，用于细胞定量的方程。 (1)
  3. 通过使用公式（1）乘以二（由于使用台盼蓝造成的稀释因子）。
    注意：也可使用自动细胞计数系统（例如., 可使用具有细胞计数和活力检测功能的细胞计数仪。

3. 在96孔板中接种细胞

  1. 计算获得进行细胞毒性检测所需细胞数量的细胞悬液体积。每种细胞系所需的活细胞数量如下：
    1. 每孔接种 60,000 个活的 ZEM2S 细胞；因此，整块板使用六百万个细胞，溶于 20 mL 完全培养基中（每孔 200 µL，96 孔板）。
    2. 每孔接种 40,000 个活的 ZFL 细胞；因此，整块板使用四百万个细胞，溶于 20 mL 完全培养基中（每孔 200 µL，96 孔板）。
  2. 随后，将相应体积的细胞悬液转移至试剂储液槽（无菌），并用 ZFL 或 ZEM2S 的完全培养基补足至 20 mL。使用多通道移液器轻轻吹打混匀溶液。
    注意：注意避免产生泡沫或气泡。
  3. 使用多通道微量移液器向透明聚苯乙烯 96 孔板的每孔中加入 200 µL 细胞悬液。将培养板在 28 °C 下孵育 24 小时。
    ​注意：该板至少应设置三个不含细胞的空白对照孔，仅向这些孔中加入完全培养基。边缘效应（由边缘孔蒸发率较高引起）在 96 孔板实验中较为常见，可能影响板边缘孔中细胞的存活率28。该效应的强弱可能因 96 孔板的品牌和设计而异28。尽管我们未观察到 ZFL 和 ZEM2S 细胞在边缘孔中存在细胞生长或存活率的干扰，但仍建议使用 Parafilm 封口膜或压敏封口膜密封培养板以防止该效应，或仅在中间 60 个孔中培养细胞，并在边缘孔中加入 PBS。

4. 细胞暴露于待测化学品

  1. 使用多通道移液器小心弃去孔中的用过的培养基。
  2. 用不同浓度的待测化学品处理细胞。在ZFL或ZEM2S细胞的无胎牛血清（FBS）培养基中配制待测化学品的不同浓度溶液（暴露培养基），然后每孔加入100 µL上述溶液，每个浓度设三个技术重复孔（即每个待测化学品浓度对应三个孔）。
  3. 对照组应与待测化学品在同一块板上设置，每个对照组设三个技术重复孔（每个对照组三个孔）。空白对照（B）：在无细胞的孔中加入100 µL暴露培养基；阴性对照（NC）：在含细胞的孔中加入100 µL暴露培养基；阳性对照（PC）：用含1% Triton X-100的暴露培养基处理细胞。在某些情况下，应设置溶剂对照（SC），其溶剂终浓度应明确且不具细胞毒性。
    注：建议使用0.5% DMSO作为溶剂；在这些细胞系中，DMSO作为溶剂使用浓度可达1%，且不会使相对于阴性对照的细胞毒性超过10%的阈值。
  4. 将培养板在28 °C下孵育24小时。使用封口膜或压敏封板膜密封培养板，以防止培养基蒸发。
    ​注：某些化学品可能具有固有的背景吸光度或荧光，可能会干扰指示染料的吸光度或荧光信号（例如，有色化合物可能影响吸光度，血清白蛋白29，以及干扰还原酶活性的化合物30,31）。在此情况下，需额外设置对照，即在不含细胞的孔中加入待测化学品溶液，以验证化学品自身的吸光或自发荧光是否对染料信号产生干扰。若检测到干扰，应评估该干扰是否可被排除，以获得对细胞毒性的准确预测。

5. 细胞毒性检测

注意：所有溶液的配制请参照表1。以下所有步骤（图1）均需在无菌条件下进行。不建议使用移液器丢弃暴露后的培养基，因为在化学处理后细胞容易从孔壁脱落。

  1. AB 和 CFDA-AM 检测
    1. 在测试化学品暴露 24 小时后，小心倾倒弃去暴露培养基，将内容物倒入收集盘中。
    2. 用 200 µL PBS 洗涤培养板。小心将 PBS 倒入收集盘中，避免细胞丢失。
    3. 每孔加入 100 µL AB/CFDA-AM 溶液。在 28 °C 避光孵育 30 分钟。
    4. 使用荧光酶标仪检测荧光强度，AB 的激发波长为 530 nm，发射波长为 595 nm；CFDA-AM 的激发波长为 493 nm，发射波长为 541 nm。
  2. NR 检测
    注意：NR 检测步骤需紧接在 AB 和 CFDA-AM 检测之后进行（图 1）。
    1. 将 NR 工作液（40 µg/mL）在 600 × g 条件下离心 10 分钟。
      注意：离心后试管中的 NR 沉淀不得转移至培养板中。因此，在离心 NR 工作液后，使用移液器小心吸取上清液，避免吸入 NR 沉淀物，并将上清液转移至试剂储液槽中。
    2. 小心倾倒弃去 AB/CFDA-AM 溶液，将内容物倒入收集盘中。
    3. 使用多通道移液器每孔加入 100 µL NR 工作液。在 28 °C 孵育 3 小时。
      注意：3 小时孵育后，应使用显微镜观察培养板中是否出现 NR 沉淀。NR 沉淀可能干扰细胞活力的定量结果，因此不应存在。
    4. 小心倾倒弃去 NR 溶液，将内容物倒入收集盘中。每孔加入 150 µL PBS 进行洗涤。
    5. 每孔加入 150 µL NR 提取液，将培养板置于板式振荡器上轻轻振荡 10 分钟。使用酶标仪在 540 nm 处测定吸光度。
      注意：应在 690 nm 处进行第二次读数，以排除培养板中的背景吸收干扰。
  3. MTT 检测
    注意：MTT 检测必须与上述检测分开进行（使用新培养板）（图 2）。
    1. 小心倾倒弃去暴露培养基，将内容物倒入收集盘中。
    2. 使用多通道移液器每孔加入 100 µL MTT 工作液。在 28 °C 孵育 4 小时。
    3. 倾倒弃去 MTT 溶液，将内容物倒入收集盘中。
    4. 每孔加入 100 µL DMSO 以溶解甲臜结晶，将培养板置于板式振荡器上振荡 10 分钟。使用酶标仪在 570 nm 处测定吸光度。
      注意：应在 690 nm 处进行第二次读数，以排除培养板中的背景吸收干扰。需特别注意，测试化学品可能与 MTT 发生相互作用，必须对此进行评估以确保所生成数据的质量32。为此，应设置不含细胞的对照孔，其中包含测试浓度的化学品和 MTT（0.5 mg/mL），经孵育后观察孔中是否发生颜色变化，此类变化可能导致吸光度升高并产生假阳性活力结果。在本检测中应避免使用与 MTT 发生反应的化学品。

6. 计算细胞活力/细胞毒性

注意：使用原始吸光度或荧光值计算细胞活力百分比，该百分比相对于阴性对照（用于直接溶于暴露培养基中的受试化学品）或溶剂对照（用于使用二甲基亚砜等溶剂配制的受试化学品）。在确定细胞活力百分比之前，原始数据必须通过空白对照进行归一化处理。

  1. 计算每种测试化学品浓度及对照组的平均吸光度或荧光值（每个处理组三个孔）。
  2. 为确定相对于对照组（阴性对照或溶剂对照）的细胞活力百分比，请使用公式（2）：
    细胞活力计算公式，用于荧光或吸光度测量的研究分析。 （2）
    注意：吸光度（abs）或荧光（fluo）单位表示每种浓度下三个孔中测得的吸光度或荧光的平均值；空白组指不含细胞的孔。

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结果

图3 显示了AB、CFDA-AM、NR和MTT检测的培养板结果。在AB检测中（图3A），空白孔以及无活细胞或活细胞数量较少的孔呈现蓝色且荧光信号较低，而含有大量活细胞的孔则呈粉红色，并因活细胞将刃天青（AB）还原为粉红色产物试卤灵而表现出较高的荧光值。在CFDA-AM检测中，培养板上各孔的颜色无明显肉眼可见差异；然而，含有活细胞的孔由于能够保留CFDA-AM并将其转化为羧基荧光素（荧光物质），因而具有更高的荧光信号。

在进行中性红（NR）实验（图3B）时，空白孔应透明且吸光度值极低，因为其中无细胞保留中性红染料。在某些情况下，空白孔不透明，表明中性红在培养板上发生沉淀；此时实验结果无效。受试化学品及阳性对照（PC）在高细胞毒性浓度下表现为透明或呈极淡的粉红色，吸光度值较低；而含有活细胞的孔则保留中性红染料，呈现深粉红色且吸光度值较高。

在MTT实验（...

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讨论

细胞毒性检测被广泛用于 体外 毒性评价，本文介绍四种常用的细胞毒性检测方法，这些方法已针对斑马鱼细胞系进行了优化（即96孔板的细胞密度、MTT法中的孵育时间、化学暴露条件下胎牛血清的去除，以及SC的最高可接受浓度）。由于这些检测方法通过不同的细胞活力终点指标（代谢功能、溶酶体膜完整性及细胞膜完整性）来量化细胞毒性，联合使用可对化学物质在斑马鱼细胞系中的细胞毒性进行准确评估。本方案还建议在CO₂培养条件下培养ZFL和ZEM2S细胞系2无CO₂培养条件，因其培养基成分能够充分缓冲培养体系，将pH维持在7.4（生理pH）。培养基的组成及CO2本方案中所述的两种细胞系的无二氧化碳培养环境在文献中已有广泛报道。ZFL细胞系通常在L-15和RPMI培养基中培养，可添加或不添加碳酸氢钠，且无需CO237,38,39,40

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

谨以此文纪念本文的共同作者 Márcio Lorencini 博士，他是一位杰出的化妆品领域研究人员，毕生致力于推动巴西的化妆品研究。作者感谢巴拉那联邦大学生理学系多用户实验室提供的设备支持，以及高等教育人员改进协调机构（CAPES，巴西）（资助代码 001）和 Grupo Boticario 提供的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5-CFDA, AM（5-羧基荧光素二乙酸酯，乙酰氧基甲酯）InvitrogenC1345
细胞培养板，96 孔板Sarstedt83.3924表面：标准，平底
DMEMGibco12800-017粉末，高葡萄糖，含丙酮酸钠
FBS - 胎牛血清，经鉴定，符合 USDA 批准地区标准Gibco12657-029
Ham's F-12 营养混合物，粉末Gibco21700026粉末
HEPES（1 M）Gibco15630080
Leibovitz's L-15 培养基Gibco41300021粉末
中性红 Sigma-AldrichN4638粉末，生物试剂，适用于细胞培养
轨道摇床 WarmnestKLD-350-BI22 mm 旋转直径
含钙镁的杜氏磷酸盐缓冲液（10X）Invitrogen14080055
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Gibco15140122
刃天青钠盐 Sigma-AldrichR7017粉末，生物试剂，适用于细胞培养
RPMI 1640 培养基Gibco31800-014粉末
碳酸氢钠Sigma-AldrichS5761粉末， 分子生物学用生物试剂
噻唑蓝四氮唑溴盐  98%Sigma-AldrichM2128
台盼蓝染液（0.4%）Gibco15250-061
胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红Gibco15400054
ZEM2S 细胞系ATCCCRL-2147该细胞系由美国威斯康星大学密尔沃基分校 Michael J.
Carvan 教授惠赠
ZFL 细胞系BCRJ256

参考文献

  1. ECHA. Non-Animal Approaches-Current Status of Regulatory Applicability Under the REACH, CLP and Biocidal Products Regulations. ECHA. , Available at <87ebb68f-2038-f597-fc33-f4003e9e7d7d (2017).
  2. Alternative Methods Accepted by US Agencies. National Toxicology Program, and US Department of Health and Human Services. , Available from: https://ntp.niehs.nih.gov/whatwestudy/niceatm/accept-methods/index.html (2022).
  3. Schirmer, K. Proposal to improve vertebrate cell cultures to establish them as substitutes for the regulatory testing of chemicals and effluents using fish. Toxicology. 224 (3), 163-183 (2006).
  4. Scholz, S., et al. Alternatives to in vivo tests to detect endocrine disrupting chemicals (EDCs) in fish and amphibians-screening for estrogen, androgen and thyroid hormone disruption. Critical Reviews in Toxicology. 43 (1), 45-72 (2013).
  5. Tanneberger, K., et al. Predicting fish acute toxicity using a fish gill cell line-based toxicity assay. Environmental Science & Technology. 47 (2), 1110-1119 (2013).
  6. Roesler, R., Lorencini, M., Pastore, G. Brazilian cerrado antioxidant sources: cytotoxicity and phototoxicity in vitro. Food Science and Technology. 30, 814-821 (2010).
  7. Ruyra, A., et al. Zebrafish liver (ZFL) cells are able to mount an anti-viral response after stimulation with Poly (I:C). Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 182, 55-63 (2015).
  8. Natsch, A., Laue, H., Haupt, T., von Niederhäusen, V., Sanders, G. Accurate prediction of acute fish toxicity of fragrance chemicals with the RTgill-W1 cell assay. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (3), 931-941 (2018).
  9. Freshney, R. I. Cytotoxicity. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , (2005).
  10. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  11. O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).
  12. Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology In Vitro. 15 (3), 257-259 (2001).
  13. Borenfreund, E., Puerner, J. A. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Letters. 24 (2-3), 119-124 (1985).
  14. Repetto, G., del Peso, A., Zurita, J. L. Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity. Nature Protocols. 3 (7), 1125-1131 (2008).
  15. Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglue, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
  16. Water Quality-Determination of Acute Toxicity of Water Samples and Chemicals to a Fish Gill Cell Line (RTgill-W1) (ISO 21115:2019). International Organization for Standardization. , Available from: https://www.iso.org/standar/69933.html (2019).
  17. Organisation for Economic Co-operation and Development. Test Guideline No. 249: Fish Cell Line Acute Toxicity-The RTgill-W1 Cell Line Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. Effects on Biotic Systems. , OECD Publishing. Paris. (2021).
  18. Lungu-Mitea, S., Lundqvist, J. Potentials and pitfalls of transient in vitro reporter bioassays: interference by vector geometry and cytotoxicity in recombinant zebrafish cell lines. Archives of Toxicology. 94 (8), 2769-2784 (2020).
  19. Lungu-Mitea, S., Han, Y., Lundqvist, J. Development, scrutiny, and modulation of transient reporter gene assays of the xenobiotic metabolism pathway in zebrafish hepatocytes. Cell Biology and Toxicology. , 1-23 (2021).
  20. Schirmer, K., Chan, A. G., Greenberg, B. M., Dixon, D. G., Bols, N. C. Methodology for demonstrating and measuring the photocytotoxicity of fluoranthene to fish cells in culture. Toxicology In Vitro. 11 (1-2), 107-119 (1997).
  21. Lungu-Mitea, S., et al. Modeling bioavailable concentrations in zebrafish cell lines and embryos increases the correlation of toxicity potencies across test systems. Environmental Science & Technology. 55 (1), 447-457 (2021).
  22. Cavalcante, D. G. S. M., et al. Cytotoxic, biochemical and genotoxic effects of biodiesel produced by different routes on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 28 (6), 1117-1125 (2014).
  23. Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843(2021).
  24. Kwok, M. L., Chan, K. M. Oxidative stress and apoptotic effects of copper and cadmium in the zebrafish liver cell line ZFL. Toxicology Reports. 7, 822-835 (2020).
  25. Yang, J., Chan, K. M. Evaluation of the toxic effects of brominated compounds (BDE-47, 99, 209, TBBPA) and bisphenol A (BPA) using a zebrafish liver cell line, ZFL. Aquatic Toxicology. 159, 138-147 (2015).
  26. Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
  27. He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
  28. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Reports. 26, 100987(2021).
  29. Funk, D., Schrenk, H. -H., Frei, E. Serum albumin leads to false-positive results in the XTT and the MTT assay. BioTechniques. 43 (2), 178(2007).
  30. Dayeh, V. R., Bols, N. C., Tanneberger, K., Schirmer, K., Lee, L. E. J. The use of fish-derived cell lines for investigation of environmental contaminants: An update following OECD's fish toxicity testing framework no. 171. Current Protocols in Toxicology. 1, (2013).
  31. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
  32. Ulukaya, E., Colakogullari, M., Wood, E. J. Interference by anti-cancer chemotherapeutic agents in the MTT-tumor chemosensitivity assay. Chemotherapy. 50 (1), 43-50 (2004).
  33. Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10 (2), 128-134 (2011).
  34. Weimer, M., et al. The impact of data transformations on concentration-response modeling. Toxicology Letters. 213 (2), 292-298 (2012).
  35. Green, J. W., Holbech, T. A., Henrik, Chapter 4: Analysis of Continuous Data (Regression). Statistical Analysis of Ecotoxicity Studies. , John Wiley & Sons, Inc. (2018).
  36. Proença, S., et al. Effective exposure of chemicals in in vitro cell systems: A review of chemical distribution models. Toxicology In Vitro. 73, 105133(2021).
  37. Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368(2021).
  38. da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755(2020).
  39. Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966(2020).
  40. Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
  41. Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
  42. Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892(2020).
  43. Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24(2021).
  44. ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2023).
  45. Chen, Y., et al. Acute toxicity of the cationic surfactant C12-benzalkonium in different bioassays: how test design affects bioavailability and effect concentrations. Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (3), 606-615 (2014).
  46. Pomponio, G., et al. In vitro kinetics of amiodarone and its major metabolite in two human liver cell models after acute and repeated treatments. Toxicology In Vitro. 30, 36-51 (2015).
  47. Mori, M., Wakabayashi, M. Cytotoxicity evaluation of chemicals using cultured fish cells. Water Science and Technology. 42 (7-8), 277-282 (2000).
  48. Caminada, D., Escher, C., Fent, K. Cytotoxicity of pharmaceuticals found in aquatic systems: comparison of PLHC-1 and RTG-2 fish cell lines. Aquatic Toxicology. 79 (2), 114-123 (2006).
  49. Giltrap, M., et al. In vitro screening of organotin compounds and sediment extracts for cytotoxicity to fish cells. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (1), 154-161 (2011).
  50. Hollert, H., Duerr, M., Erdinger, L., Braunbeck, T. Cytotoxicity of settling particulate matter and sediments of the Neckar River (Germany) during a winter flood. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (3), 528-534 (2000).
  51. Pannetier, P., et al. Toxicity assessment of pollutants sorbed on environmental sample microplastics collected on beaches: Part I-adverse effects on fish cell line. Environmental Pollution. 248, 1088-1097 (2019).
  52. Ternjej, I., Srček, V. G., Mihaljević, Z., Kopjar, N. Cytotoxic and genotoxic effects of water and sediment samples from gypsum mining area in channel catfish ovary (CCO) cells. Ecotoxicology and Environmental Safety. 98, 119-127 (2013).
  53. Hamid, R., Rotshteyn, Y., Rabadi, L., Parikh, R., Bullock, P. Comparison of alamar blue and MTT assays for high throughput screening. Toxicology In Vitro. 18 (5), 703-710 (2004).
  54. Vistica, D. T., et al. Tetrazolium-based assays for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan production. Cancer Research. 51 (10), 2515-2520 (1991).
  55. Knauer, K., Lampert, C., Gonzalez-Valero, J. Comparison of in vitro and in vivo acute fish toxicity in relation to toxicant mode of action. Chemosphere. 68 (8), 1435-1441 (2007).
  56. Stadnicka-Michalak, J., Tanneberger, K., Schirmer, K., Ashauer, R. Measured and modeled toxicokinetics in cultured fish cells and application to in vitro-in vivo toxicity extrapolation. PLoS One. 9 (3), 92303(2014).

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