本方案介绍了常用于评估斑马鱼胚胎（ZEM2S）和斑马鱼肝细胞（ZFL）系在96孔板中细胞毒性的检测方法（Alamar Blue [AB]、CFDA-AM、中性红和MTT检测）。
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摘要
摘要
鱼类细胞系在生态毒理学研究中日益得到广泛应用，细胞毒性检测已被提出作为预测鱼类急性毒性的方法。因此，本实验方案介绍了经改良的细胞毒性检测方法，用于评估斑马鱼（zebrafish）细胞的存活率斑马鱼) 胚胎（ZEM2S）和肝脏（ZFL）细胞系置于96孔板中。所评估的细胞毒性终点包括线粒体完整性（Alamar Blue [AB] 和 MTT 检测）以及膜完整性 通过 酯酶活性（CFDA-AM 检测）和溶酶体膜完整性（中性红 [NR] 检测）。在96孔板中暴露于待测物质后，进行细胞毒性检测；其中 AB 和 CFDA-AM 检测在同一块板上同时进行，随后进行 NR 检测，而 MTT 检测则在另一块独立的板上进行。AB 和 CFDA-AM 检测的读数采用荧光法，MTT 和 NR 检测采用吸光度法。利用这些鱼类细胞系进行的细胞毒性检测可用于研究化学物质对鱼类的急性毒性。
引言
化学物质需要针对其对人类健康和环境的安全性进行测试。分子和细胞生物标志物在安全性评估中正受到监管机构和/或立法机构（如 REACH、OECD、US EPA）越来越多的重视，以预测其对生物体的影响。1,2，因为它们可能先于 体内 不良结局（例如，内分泌干扰、免疫反应、急性毒性、光毒性）3,4,5,6,7在此背景下，细胞毒性被用作预测鱼类急性毒性的指标5,8；然而，它在生态毒理学研究中还可有多种其他应用，例如确定化学物质的亚细胞毒性浓度，以研究其对鱼类产生的各种不同效应（如.，内分泌干扰效应）。
在细胞培养系统（体外系统）中，化学物质的细胞毒性可通过不同类型的终点指标方法进行测定。例如，某些细胞毒性方法可基于细胞死亡过程中观察到的特定形态学变化作为终点指标，而另一些方法则可....
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方案
注意：本实验方案所用材料的列表请参见材料表，所用溶液和培养基的组成请参见表1。
1. 准备 ZFL 和 ZEM2S 细胞
- 取一个培养在相应完全培养基中、汇合度为80%的ZFL或ZEM2S细胞T75培养瓶，在28 °C条件下培养，无需CO2环境。
- 移除培养瓶中的培养基，加入10 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01 M）洗涤细胞。向培养瓶中加入3 mL 1×胰蛋白酶（0.05% v/v；含0.5 mM胰蛋白酶-EDTA），在28 °C下孵育3分钟。
- 轻轻敲击培养瓶使细胞脱落，随后加入3 mL完全培养基以终止胰蛋白酶消化反应。
- 将细胞悬液转移至15 mL圆锥形离心管中，在100 × g条件下离心5分钟。
- 离心后小心弃去上清液，加入1 mL ZFL或ZEM2S细胞的完全培养基，使用移液器重悬细胞沉淀。
2. 台盼蓝染料排斥法细胞计数
- 添加 10 µL 细胞悬液的 10 µL 将台盼蓝染料加入微量离心管中，用于细胞计数和活力评估。使用移液器混合细胞悬液与染料。
- 然后，转移 10 µL 将此混....
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结果
图3 显示了AB、CFDA-AM、NR和MTT检测的培养板结果。在AB检测中（图3A），空白孔以及无活细胞或活细胞数量较少的孔呈现蓝色且荧光信号较低，而含有大量活细胞的孔则呈粉红色，并因活细胞将刃天青（AB）还原为粉红色产物试卤灵而表现出较高的荧光值。在CFDA-AM检测中，培养板上各孔的颜色无明显肉眼可见差异；然而，含有活细胞的孔由于能够保留CFDA-AM并将其转化为羧基荧光素（荧光物质），因而具有更高的荧光信号。
在进行中性红（NR）实验（图3B）时，空白孔应透明且吸光度值极低，因为其中无细胞保留中性红染料。在某些情况下，空白孔不透明，表明中性红在培养板上发生沉淀；此时实验结果无效。受试化学品及阳性对照（PC）在高细胞毒性浓度下表现为透明或呈极淡的粉红色，吸光度值较低；而含有活细胞的孔则保留中性红染料，呈现深粉红色且吸光度值较高。
在MTT实验（.......
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讨论
细胞毒性检测被广泛用于 体外 毒性评价，本文介绍四种常用的细胞毒性检测方法，这些方法已针对斑马鱼细胞系进行了优化（即96孔板的细胞密度、MTT法中的孵育时间、化学暴露条件下胎牛血清的去除，以及SC的最高可接受浓度）。由于这些检测方法通过不同的细胞活力终点指标（代谢功能、溶酶体膜完整性及细胞膜完整性）来量化细胞毒性，联合使用可对化学物质在斑马鱼细胞系中的细胞毒性进行准确评估。本方案还建议在CO₂培养条件下培养ZFL和ZEM2S细胞系2无CO₂培养条件，因其培养基成分能够充分缓冲培养体系，将pH维持在7.4（生理pH）。培养基的组成及CO2本方案中所述的两种细胞系的无二氧化碳培养环境在文献中已有广泛报道。ZFL细胞系通常在L-15和RPMI培养基中培养，可添加或不添加碳酸氢钠，且无需CO237,38,39,40
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
谨以此文纪念本文的共同作者 Márcio Lorencini 博士，他是一位杰出的化妆品领域研究人员，毕生致力于推动巴西的化妆品研究。作者感谢巴拉那联邦大学生理学系多用户实验室提供的设备支持，以及高等教育人员改进协调机构（CAPES，巴西）（资助代码 001）和 Grupo Boticario 提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5-CFDA, AM（5-羧基荧光素二乙酸酯，乙酰氧基甲酯） | Invitrogen | C1345 | |
| 细胞培养板，96 孔板 | Sarstedt | 83.3924 | 表面：标准，平底 |
| DMEM | Gibco | 12800-017 | 粉末，高葡萄糖，含丙酮酸钠 |
| FBS - 胎牛血清，经鉴定，符合 USDA 批准地区标准 | Gibco | 12657-029 | |
| Ham's F-12 营养混合物，粉末 | Gibco | 21700026 | 粉末 |
| HEPES（1 M） | Gibco | 15630080 | |
| Leibovitz's L-15 培养基 | Gibco | 41300021 | 粉末 |
| 中性红 | Sigma-Aldrich | N4638 | 粉末，生物试剂，适用于细胞培养 |
| 轨道摇床 | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm 旋转直径 |
| 含钙镁的杜氏磷酸盐缓冲液（10X） | Invitrogen | 14080055 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Gibco | 15140122 | |
| 刃天青钠盐 | Sigma-Aldrich | R7017 | 粉末，生物试剂，适用于细胞培养 |
| RPMI 1640 培养基 | Gibco | 31800-014 | 粉末 |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | S5761 | 粉末， 分子生物学用生物试剂 |
| 噻唑蓝四氮唑溴盐 98% | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| 台盼蓝染液（0.4%） | Gibco | 15250-061 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红 | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S 细胞系 | ATCC | CRL-2147 | 该细胞系由美国威斯康星大学密尔沃基分校 Michael J. Carvan 教授惠赠 |
| ZFL 细胞系 | BCRJ | 256 |
参考文献
- ECHA. Non-Animal Approaches-Current Status of Regulatory Applicability Under the REACH, CLP and Biocidal Products Regulations. ECHA. , Available at <87ebb68f-2038-f597-fc33-f4003e9e7d7d (2017).
- Alternative Methods Accepted by US Agencies. National Toxicology Program, and US Department of Health and Human Services. , Available from:
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