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通过反复吸入结晶二氧化硅粉尘建立的矽肺小鼠模型

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DOI：

10.3791/64862

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2023年1月6日

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1Key Laboratory of Industrial Dust Control and Occupational Health of the Ministry of Education, Anhui University of Science and Technology, 2Key Laboratory of Industrial Dust Deep Reduction and Occupational Health and Safety of Anhui Higher Education Institutes, Anhui University of Science and Technology, 3Anhui Province Engineering Laboratory of Occupational Health and Safety, 4School of Medicine, Department of Medical Frontier Experimental Center, Anhui University of Science and Technology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种通过反复暴露于二氧化硅悬浮液来建立小鼠矽肺模型的方法 通过 鼻腔滴注法。该模型能够高效、便捷且灵活地模拟人类矽肺病的病理过程，具有高度可重复性和经济性。

摘要

在工业环境中暴露于呼吸性结晶二氧化硅粉尘（CSD）可导致矽肺病。通过小鼠矽肺模型，已对人类矽肺病的病理生理学、筛查及治疗方法进行了广泛研究。通过反复使小鼠吸入CSD进入肺部，可模拟人类矽肺病的临床症状。该方法在时间和产出方面具有实用性和高效性，且不会因手术造成上呼吸道的机械性损伤。此外，该模型能够成功模拟矽肺病的急性/慢性转化过程。主要操作步骤如下：将灭菌的1-5 µm CSD粉末充分研磨后悬浮于生理盐水中，并在超声水浴中分散30分钟。在异氟烷麻醉下的小鼠呼吸由浅快转为深慢，吸气持续约2秒。将小鼠置于手掌中，用拇指尖轻轻触碰小鼠下颌边缘以拉直气道。每次呼气后，小鼠通过单侧鼻孔逐滴吸入二氧化硅悬浮液，整个过程在4-8秒内完成。待小鼠呼吸稳定后，轻抚其胸部以防止吸入的CSD被咳出。随后将小鼠放回笼中。总之，该模型可沿微小颗粒物进入肺部的典型生理通路——从上呼吸道至终末细支气管和肺泡——实现CSD的定量递送。同时，该模型还能模拟职业人员因工作导致的反复暴露情况。该模型可由一人独立操作，无需昂贵设备，能够方便、有效地模拟人类矽肺病的疾病特征，且具有高度可重复性。

引言

在采矿、陶瓷、玻璃、石英加工和混凝土等行业中，工人不可避免地会接触到不规则的结晶型二氧化硅粉尘（CSD），这种粉尘可被吸入体内，且具有较高的毒性1,2。一种由长期吸入粉尘引起的慢性疾病——矽肺病，会导致进行性肺纤维化3。根据流行病学数据，过去几十年中，全球矽肺病的发病率总体呈下降趋势，但近年来却出现上升，并且更多地影响年轻人群体4,5,6。由于该病起病隐匿、潜伏期长，其发病机制对科学研究构成了重大挑战。目前，矽肺病的具体发病过程仍不明确。此外，尚无现有药物能够阻止矽肺病的进展或逆转肺纤维化。

目前矽肺病的小鼠模型涉及经气管摄入CSD混合悬浮液。例如，在麻醉后通过颈段气管创伤将CSD注入肺部的方法，并不能模拟人类反复暴露于粉尘环境的情况7。通过气溶胶形式暴露于CSD，可以更准确地研究环境粉尘暴露对个体的影响，这种方法更能反映该毒性物质在环境中的实际浓度8。然而，由于小鼠鼻部独特的生理结构，环境中的CSD无法直接吸入肺部9。此外，相关技术所用设备价格昂贵，这促使研究人员重新评估现有的小鼠矽肺病模型10。通过在2周内经鼻滴注CSD悬浮液5次，可建立一种动态的矽肺病模型。该模型具有一致性、安全性且操作简便。需要特别指出的是，本研究实现了小鼠对CSD的反复吸入。通过该方法建立的小鼠矽肺病模型预计将更符合科研需求。

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方案

所有操作均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物 No. 8023，1978 年修订版）的规定，并经安徽科技大学医学院机构动物护理和使用委员会批准。

1. 小鼠的饲养与管理

  1. 将20只健康的C57BL/6雄性小鼠按1:1的比例随机分配至实验组和对照组。让小鼠在新环境中适应1周。
  2. 每天提供12小时恒定的光照时间。使用时间控制器以确保定时精确。

2. 准备CSD悬液

  1. 鼻腔滴注前至少1天，将二氧化硅在玛瑙研钵中研磨0.5小时。
  2. 观察晶体颗粒的大小和形状，使用扫描电子显微镜（SEM）拍摄具有代表性的照片。
    1. 使用导电胶带将颗粒固定，以制备SEM样品。用吹风机轻轻吹去未牢固粘附的硅颗粒。
    2. 抽真空至样品室，开启高压，捕获图像。
      注意：镜头与样品之间的工作距离（WD）为5.9 mm，加速电压为2.0 kV，放大倍数（Mag）为100,000倍，使用SignalA探测器。颗粒呈不规则结晶分散状态，约80%的颗粒直径为1–5 µm（图1A）。
  3. 制备20 mg/mL的无菌CSD悬浮液。用无菌生理盐水稀释CSD，并在室温（RT）下使用超声振荡器（40 kHz，80 W）处理30分钟，混匀。
  4. 在进行鼻腔滴注前，将CSD悬浮液在涡旋混合器上充分搅拌混合10秒。

3. 向小鼠施用鼻腔滴注

  1. 使用麻醉机以每小时 3.6 mL 的流速给予 2% 异氟烷，快速麻醉小鼠（图 1B，左图）。
    注意：麻醉操作应在通风橱中进行，以避免技术人员吸入麻醉气体。通过观察小鼠呼吸由快速不规则转变为缓慢平稳的状态，确认麻醉深度是否合适。
  2. 在 4–8 秒内将 50 µL CSD 经鼻滴注（图 1B，右图）。
    1. 进行鼻腔滴注时，将小鼠头部置于研究人员食指指尖的掌指关节处。
    2. 保持小鼠俯卧位，四指轻微弯曲，拇指指尖轻触小鼠下唇以拉直气道。避免接触咽部，以防诱发咽反射。
    3. 使用 200 μl 移液器吸取 50 μl 液体，根据小鼠呼吸频率分 3 至 4 次滴入鼻腔，每次滴加 15 至 20 μl。每 3 天给药一次，12 天内共给药 5 次。对照组小鼠给予等量生理盐水。
  3. 轻柔按摩小鼠心区 5–10 次，持续 5 秒。
    1. 用手掌固定小鼠身体，用拇指和食指捏住其颈部背侧皮肤，其余手指固定小鼠后肢。 然后用另一只手的食指在 5 秒内轻压小鼠心跳区域 5–10 次。
  4. 待小鼠呼吸稳定后，将其放入带有加热垫的恢复笼中观察，直至从麻醉中恢复，随后将小鼠放回原饲养笼。于第 31 天处死小鼠。

4. 收集肺组织并制备石蜡切片

  1. 腹腔注射 0.18 mL 10% 水合氯醛，确保小鼠对脚趾或尾部刺激无反应（使用有齿镊进行测试），然后进行下一步操作。
  2. 将小鼠四肢固定在泡沫实验板上，并喷洒 75% 酒精以润湿毛发。在锁骨中线处剪除大部分胸肋，打开小鼠胸腔，暴露心脏和肺组织。
  3. 使用眼科手术剪立即剪开右心房，并从左心房搏动最明显的部位向心尖缓慢注入 20 mL 磷酸盐缓冲液（PBS），使全血流出。随后，取下右肺下叶，于 -80 °C 保存，用于 Western blot 分析。
  4. PBS 灌注后，在同一部位继续灌注 10 mL 4% 多聚甲醛（PFA）。收集剩余肺组织，置于 30 mL 4% PFA 中固定，用于病理学分析。
  5. 固定 72 小时后，将样本包埋于石蜡中。
    1. 在室温下，依次使用去离子水配制的梯度乙醇（EtOH）溶液（60%、70%、80%、90%、100%）对组织进行脱水处理，每级处理 1 小时。随后用二甲苯洗涤两次，每次 1 小时以透明化组织。
    2. 将组织样本浸入熔化的石蜡中，在 50 °C 下加热 2 小时以完成浸蜡。在另一容器中重复此过程一次。将含组织的石蜡模具冷却 1 小时，使其凝固。
    3. 待石蜡完全凝固且组织包埋完成后，使用石蜡切片机将组织切成 5 µm 厚的切片。精确的切片与载玻片贴附步骤此前已有描述11。
      ​注意：当组织接受 10 mL 4% PFA 灌注后出现肌肉抽搐、尾巴扭曲成 "S" 形或屈曲现象时，提示灌注充分。

5. 进行苏木精-伊红（HE）染色

  1. 将石蜡包埋组织置于热板（60 °C）上加热超过 4 小时，以促进组织与载玻片的黏附并改善脱蜡效果。
  2. 脱蜡并水化石蜡切片。将载玻片样本先后浸入二甲苯中两次，每次 30 分钟。随后依次浸入无水乙醇、95%、85%、75% 乙醇，最后进入去离子水中，各步骤均持续 5 分钟。
  3. 进行苏木精-伊红染色。将组织放入苏木精染色缸中染色 10 分钟，用缓流自来水冲洗 5 分钟。然后将载玻片浸入伊红染色缸中染色 10 秒。
  4. 依次用 75%、85%、95% 和无水乙醇对样本脱水，每步 5 分钟。将组织切片浸入二甲苯中透明 5 分钟。滴加约 60 µL 中性树胶封片，盖上盖玻片，缓慢放下以避免产生气泡。

6. 进行Masson染色

  1. 脱蜡并水化石蜡包埋样本，操作如步骤5.2所述。然后用50% Weigert苏木精染液对细胞核染色10分钟。将组织浸入酸性乙醇中解离10秒，再用流动水轻轻冲洗组织切片，使细胞核显蓝色。
    注意：Weigert苏木精染液需现配现用。
  2. 每张组织切片滴加40 µL李春红染色液，染色7分钟，随后用弱酸工作液（30%盐酸）洗涤1分钟，以去除未结合的李春红染料。
  3. 将切片浸入95%乙醇中20秒，再用无水乙醇脱水两次，每次1–3秒。随后用二甲苯透明处理，并按步骤5.4所述，滴加60 µL中性树胶封片。

7. 进行天狼星红染色

  1. 按照步骤5.2所述方法对石蜡切片进行脱蜡和水化处理。
  2. 用 Sirius red 染色液对切片浸染1小时。
  3. 用 Mayer 苏木精染色液对样品的细胞核染色8-10分钟，然后用流水轻轻冲洗10分钟。随后对组织切片进行脱水和透明处理，并按照步骤5.4所述方法封片。

8. 进行免疫组织化学染色

  1. 按照步骤5.2所述方法对石蜡样本进行脱蜡和水化。
  2. 用约30 mL的3 mg/mL EDTA抗原修复液浸润组织样本，煮沸20-30分钟。用去离子水清洗组织，然后在含0.5% Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBST）中孵育5分钟。
  3. 用0.3%过氧化氢溶液浸泡样本15分钟，以灭活组织中的内源性过氧化物酶。用PBST清洗3次，每次5分钟。
    注意：0.3%过氧化氢溶液必须在避光条件下新鲜配制。
  4. 用0.3% Triton-100溶液对组织膜进行通透处理15分钟。随后加入30-40 µL的5%牛血清白蛋白（BSA）封闭1小时。
  5. 去除封闭液。加入稀释的一抗NF-κB（稀释比例1:200）和CD68（稀释比例1:1,000），将样本置于免疫组化湿盒中，在2-8 °C孵育过夜，防止蒸发和光照。
  6. 次日，将样本转移至室温（RT）孵育1小时。然后用PBST清洗3次，每次5分钟。
  7. 在室温下用辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠二抗（稀释比例1:500）孵育样本1小时，并用PBST清洗3次，每次5分钟。
    注意：一抗和二抗均使用5% BSA溶液稀释。
  8. 加入与酶标记抗体对应的3,3'-二氨基联苯胺（DAB）底物孵育5-20分钟。当染色强度达到最佳时，用去离子水终止反应。
    注意：DAB溶液需新鲜配制并避光保存。显色反应应在显微镜下实时观察，以确定终止染色的时机。阳性样本呈现明显着色，阴性样本则无颜色生成。
  9. 用Weigert苏木精对样本复染30秒。接着用流水冲洗组织1分钟。然后按照步骤5.4所述方法进行脱水、透明和封片处理。

9. 进行蛋白质印迹分析

  1. 裂解肺组织以提取蛋白质。向20 mg肺组织中加入200 µL RIPA工作液。
  2. 使用手持式电动研磨器在冰上匀浆组织5分钟，并在冰上轻轻振荡孵育1小时。随后，在4 °C条件下以14,800 × g 离心15分钟。
  3. 收集上清液，使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。用RIPA将蛋白储存液配制成6 µg/µL的浓度。向80 µL蛋白裂解液中加入20 µL 5×上样缓冲液。将含有蛋白的微量离心管置于金属浴中加热（100 °C）20分钟，以破坏蛋白的二级结构。
  4. 冷却后，将100 µL蛋白储存液分装至各管中，并将样品储存在-80 °C冰箱中。电泳前用1×上样缓冲液将蛋白浓度稀释至2–3 μg/μL。
    注意：蛋白提取过程应在冰上进行。配制RIPA工作液时，向99 µL RIPA中加入1 µL 100 mM苯甲基磺酰氟（PMSF），以抑制磷酸化蛋白降解。  按1:4的比例用RIPA稀释5×上样缓冲液，制备1×上样缓冲液。 
  5. 每孔加入20 µg样品并运行凝胶。对于5%浓缩胶，使用80 V电压电泳20分钟，使蛋白从相同起始点向下迁移。对于10%分离胶，使用100 V电压运行1小时，以尽可能分离不同分子量的蛋白。
  6. 用甲醇预活化PVDF膜20秒。采用湿转法，以400 mA电流将蛋白转移至PVDF膜上，持续1–2小时。
    注意：确保电泳槽和电转槽处于水平状态。由于膜转移过程中会产生大量热量，需用冰对整个槽进行冷却。
  7. 用TBST溶液每次洗涤5分钟，共洗5次。然后用5% BSA或5%脱脂奶粉在室温下封闭1小时。用5% BSA稀释一抗NF-κB（1:1,000）和β-actin（1:1,000）。将膜条浸入抗体溶液中，在2–8 °C轻轻振荡孵育过夜。
  8. 用PBST洗涤膜条。接着，将辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗按1:10,000稀释，并在稀释后的二抗溶液中室温轻轻振荡孵育1小时。
  9. 配制增强型化学发光（ECL）显影液，滴加于膜条上，孵育3分钟。
  10. 将膜条置于凝胶成像仪中曝光20秒。利用系统软件测定膜条的灰度值，以评估蛋白表达水平。以β-actin作为内参对照。

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结果

采用所提出的方法研究了小鼠硅肺病的潜在发病机制。我们发现，实验组小鼠的体重相较于对照组显著下降，且在停止暴露后体重恢复缓慢。由于本实验采用了优化的剂量，暴露于二氧化硅的小鼠未出现死亡。重复经鼻滴注CSD的技术路线见（图1）。此前描述的操作步骤包括CSD悬浮液制备、异氟烷诱导麻醉、经鼻滴注以及胸部按摩12。我们已证实，在持续静态喂养4周后出现胶原沉积和肌成纤维细胞分化12。我们曾利用该粉尘暴露方法研究煤尘所致肺纤维化的潜在机制，并通过单细胞转录组技术发现了巨噬细胞的新亚群以及维生素D的干预作用13。在本研究中，CSD暴露显著加速了小鼠肺纤维化的进展，导致支气管周围弹性纤维受损（图2和 图3）。硅肺结节由含有CSD的巨噬细胞构成。纤维化结节富含大量CSD，CD68阳性巨噬细胞积极吞噬这些颗...

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讨论

矽肺小鼠模型对于研究矽肺的发病机制和治疗方法至关重要。本方案描述了一种通过重复鼻腔暴露建立小鼠矽肺模型的方法。该方法可用于研究不同暴露时间所诱导的矽肺病理特征。小鼠在呼吸机上进行麻醉，并持续监测其呼吸频率。初始阶段表现为短暂而快速的呼吸，随后呼吸逐渐变慢加深。麻醉使小鼠肌肉松弛，产生深呼吸，从而在缓慢深呼吸的时间窗内吸入CSD。在此过程中，操作者用拇指固定小鼠下颌并伸直其颈部，以防止液体进入消化道。该可吸入粉尘暴露方法无痛且非侵入性，可满足重复实施的个体化研究需求，适用于粉尘暴露相关研究。Kato等在2017年采用单次大剂量（125 mg/mL，40 µL） 通过 通过鼻腔给予多次小剂量以模拟肺部变化，我们参考该浓度来研究口咽部滴注所致的肺纤维化14.

从技术角度来看，麻醉后经鼻滴注存在若干挑战。操作过程中，操作者需用拇指固定小鼠的下颌，以拉直其颈部并防止液体进入消化道。如果小鼠未达到深度麻醉状态，或操作者技术不熟练而错过缓慢深呼吸的时间窗口，则鼻滴效果及模型的病理特征将无法达到预期。因此，为避免麻醉过深导致死亡或麻...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由安徽省高校协同创新计划项目（GXXT-2021-077）和安徽理工大学研究生创新基金（2021CX2120）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5 mL 离心管BiosharpBS-05-M
10% 中性福尔马林固定液南昌裕禄实验设备有限公司NA
Adobe IllustratorAdobe NA
酒精消毒剂新泰康源消毒制品有限公司NA
CD68Abcamab125212
柠檬酸抗原修复液biosharp life scienceBL619A
DAB 显色试剂盒NJJCBioW026-1-1
二甲苯西亚化学科技（山东）有限公司NA
增强型 BCA 蛋白检测试剂盒碧云天生物技术P0009
苏木精-伊红（H&E）染色液碧云天生物技术C0105S
HRP 底物Millipore CorporationP90720
HRP 标记的 Affinipure 羊抗兔 IgG(H+L)ProteintechSa00001-2
冰醋酸西亚化学科技（山东）有限公司NA
ImageJNIHNA
异氟烷RWD 生命科学R510-22
Masson 三色染色试剂盒索莱宝G1340
甲醇MacklinNA
微量离心管MilliporeAXYMCT150CS
NF-κB p65Cell Signaling Technology8242S
振荡恒温金属浴AbsonNA
石蜡包埋机精密（常州）医疗设备有限公司PBM-A
石蜡切片机金华科瑞特仪器有限公司NA
磷酸盐缓冲液（PBS） BiosharpBL601A
生理盐水 淮南市第一人民医院NA
移液器EppendorfNA
PMSF碧云天生物技术ST505
偏光显微镜OlympusBX51
精密天平AcculabALC-110.4
Prism 7.0GraphPad Version 7.0
PVDF 膜Millipore3010040001
RIPA 裂解缓冲液碧云天生物技术P0013B
RODI IOT 智能多功能水净化系统RSJRODI-220BN
Scilogex SK-D1807-E 三维摇床ScilogexNA
SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒碧云天生物技术P0012A
二氧化硅Sigma#BCBV6865
天狼星红染色液南京森贝嘉生物科技有限公司181012
小动物麻醉机安徽耀坤生物科技有限公司ZL-04A
通用移液器吸头（0.1–10 µL）KIRGENKG1011
通用移液器吸头（100–1000 µL）KIRGENKG1313
通用移液器吸头（1–200 µL）KIRGENKG1212
涡旋 混合器 VWRNA
ZEISS GeminiSEM 500Zeiss GermanySEM 500
β-actinBiossbs-0061R

参考文献

  1. Olsson, A., Kromhout, H. Occupational cancer burden: the contribution of exposure to process-generated substances at the workplace. Molecular Oncology. 15 (3), 753-763 (2021).
  2. The Lancet Respiratory. The world is failing on silicosis. The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283(2019).
  3. Weissman, D. N. Progressive massive fibrosis: An overview of the recent literature. Pharmacology & Therapeutics. 240, 108232(2022).
  4. Lancet, C. C., Yu, I. T., Chen, W. Silicosis. Lancet. 379 (9830), 2008-2018 (2012).
  5. Mazurek, J. M., Wood, J., Blackley, D. J., Weissman, D. N. Coal workers' pneumoconiosis-attributable years of potential life lost to life expectancy and potential life lost before age 65 years - United States, 1999-2016. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (30), 819-824 (2018).
  6. Voelker, R. Black Lung resurgence raises new challenges for coal country physicians. JAMA. 321 (1), 17-19 (2019).
  7. Nakashima, K., et al. Regulatory role of heme oxygenase-1 in silica-induced lung injury. Respiratory Research. 19 (1), 144(2018).
  8. Li, Y., et al. Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation. Veterinary Sciences. 9 (6), 251(2022).
  9. Salehi, F., et al. Immunological responses in C3H/HeJ mice following nose-only inhalation exposure to different sizes of beryllium metal particles. Journal of Applied Toxicology. 29 (1), 61-68 (2009).
  10. Yang, T., et al. Emodin suppresses silica-induced lung fibrosis by promoting Sirt1 signaling via direct contact. Molecular Medicine Reports. 14 (5), 4643-4649 (2016).
  11. Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196(2018).
  12. Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
  13. Mu, M., et al. Coal dust exposure triggers heterogeneity of transcriptional profiles in mouse pneumoconiosis and Vitamin D remedies. Particle and Fibre Toxicology. 19 (1), 7(2022).
  14. Kato, K., et al. Muc1 deficiency exacerbates pulmonary fibrosis in a mouse model of silicosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 493 (3), 1230-1235 (2017).
  15. Liu, F., et al. CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells depletion may attenuate the development of silica-induced lung fibrosis in mice. PLoS One. 5 (11), 15404(2010).
  16. Mansouri, N., et al. Mesenchymal stromal cell exosomes prevent and revert experimental pulmonary fibrosis through modulation of monocyte phenotypes. JCI Insight. 4 (21), 128060(2019).
  17. Ohtsuka, Y., Wang, X. T., Saito, J., Ishida, T., Munakata, M. Genetic linkage analysis of pulmonary fibrotic response to silica in mice. The European Respiratory Journal. 28 (5), 1013-1019 (2006).

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