通过反复吸入结晶二氧化硅粉尘建立的矽肺小鼠模型

摘要

本方案描述了一种通过反复暴露于二氧化硅悬浮液来建立小鼠矽肺模型的方法 通过 鼻腔滴注法。该模型能够高效、便捷且灵活地模拟人类矽肺病的病理过程，具有高度可重复性和经济性。

摘要

在工业环境中暴露于呼吸性结晶二氧化硅粉尘（CSD）可导致矽肺病。通过小鼠矽肺模型，已对人类矽肺病的病理生理学、筛查及治疗方法进行了广泛研究。通过反复使小鼠吸入CSD进入肺部，可模拟人类矽肺病的临床症状。该方法在时间和产出方面具有实用性和高效性，且不会因手术造成上呼吸道的机械性损伤。此外，该模型能够成功模拟矽肺病的急性/慢性转化过程。主要操作步骤如下：将灭菌的1-5 µm CSD粉末充分研磨后悬浮于生理盐水中，并在超声水浴中分散30分钟。在异氟烷麻醉下的小鼠呼吸由浅快转为深慢，吸气持续约2秒。将小鼠置于手掌中，用拇指尖轻轻触碰小鼠下颌边缘以拉直气道。每次呼气后，小鼠通过单侧鼻孔逐滴吸入二氧化硅悬浮液，整个过程在4-8秒内完成。待小鼠呼吸稳定后，轻抚其胸部以防止吸入的CSD被咳出。随后将小鼠放回笼中。总之，该模型可沿微小颗粒物进入肺部的典型生理通路——从上呼吸道至终末细支气管和肺泡——实现CSD的定量递送。同时，该模型还能模拟职业人员因工作导致的反复暴露情况。该模型可由一人独立操作，无需昂贵设备，能够方便、有效地模拟人类矽肺病的疾病特征，且具有高度可重复性。

引言

在采矿、陶瓷、玻璃、石英加工和混凝土等行业中，工人不可避免地会接触到不规则的结晶型二氧化硅粉尘（CSD），这种粉尘可被吸入体内，且具有较高的毒性^1,2。一种由长期吸入粉尘引起的慢性疾病——矽肺病，会导致进行性肺纤维化³。根据流行病学数据，过去几十年中，全球矽肺病的发病率总体呈下降趋势，但近年来却出现上升，并且更多地影响年轻人群体^4,5,6。由于该病起病隐匿、潜伏期长，其发病机制对科学研究构成了重大挑战。目前，矽肺病的具体发病过程仍不明确。此外，尚无现有药物能够阻止矽肺病的进展或逆转肺纤维化。

目前矽肺病的小鼠模型涉及经气管摄入CSD混合悬浮液。例如，在麻醉后通过颈段气管创伤将CSD注入肺部的方法，并不能模拟人类反复暴露于粉尘环境的情况⁷。通过气溶胶形式暴露于CSD，可以更准确地研究环境粉尘暴露对个体的影响，这种方法更能反映该毒性物质在环境中的实际浓度⁸。然而，由于小鼠鼻部独特的生理结构，环境中的CSD无法直接吸入肺部

方案

所有操作均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物 No. 8023，1978 年修订版）的规定，并经安徽科技大学医学院机构动物护理和使用委员会批准。

1. 小鼠的饲养与管理

1. 将20只健康的C57BL/6雄性小鼠按1:1的比例随机分配至实验组和对照组。让小鼠在新环境中适应1周。
2. 每天提供12小时恒定的光照时间。使用时间控制器以确保定时精确。

2. 准备CSD悬液

1. 鼻腔滴注前至少1天，将二氧化硅在玛瑙研钵中研磨0.5小时。
2. 观察晶体颗粒的大小和形状，使用扫描电子显微镜（SEM）拍摄具有代表性的照片。
   1. 使用导电胶带将颗粒固定，以制备SEM样品。用吹风机轻轻吹去未牢固粘附的硅颗粒。
   2. 抽真空至样品室，开启高压，捕获图像。
      注意：镜头与样品之间的工作距离（WD）为5.9 mm，加速电压为2.0 kV，放大倍数（Mag）为100,000倍，使用SignalA探测器。颗粒呈不规则结晶分散状态，约80%的颗粒直径为1–5 µm（图1A）。
3. 制备20 mg/mL的无菌CSD悬浮液。....

结果

采用所提出的方法研究了小鼠矽肺病的潜在发病机制。我们发现，实验组小鼠的体重较对照组显著下降，且在停止暴露后体重恢复缓慢。由于本实验采用了优化的剂量，暴露于二氧化硅的小鼠未出现死亡。重复经鼻滴注至CSD的技术路线图如（图1）。先前描述的步骤包括CSD悬浮液制备、异氟烷诱导麻醉、鼻腔滴注以及胸部按摩¹²我们通过4周的静态喂养，证实了胶原沉积和肌成纤维细胞分化。¹²我们采用这种粉尘暴露方法研究了煤尘引起肺纤维化的潜在机制。通过单细胞转录组技术，发现了巨噬细胞的新亚群以及维生素D的干预作用。¹³在本研究中，小鼠暴露于CSD后肺纤维化进程显著加快，导致支气管周围弹性纤维受损（图2 和 图3矽肺结节由含有结晶二氧化硅颗粒（CSD）的巨噬细胞构成。纤维化结节富含大量CSD，且CD68阳性巨噬细胞可主.......

讨论

矽肺小鼠模型对于研究矽肺的发病机制和治疗方法至关重要。本方案描述了一种通过重复鼻腔暴露建立小鼠矽肺模型的方法。该方法可用于研究不同暴露时间所诱导的矽肺病理特征。小鼠在呼吸机上进行麻醉，并持续监测其呼吸频率。初始阶段表现为短暂而快速的呼吸，随后呼吸逐渐变慢加深。麻醉使小鼠肌肉松弛，产生深呼吸，从而在缓慢深呼吸的时间窗内吸入CSD。在此过程中，操作者用拇指固定小鼠下颌并伸直其颈部，以防止液体进入消化道。该可吸入粉尘暴露方法无痛且非侵入性，可满足重复实施的个体化研究需求，适用于粉尘暴露相关研究。Kato等在2017年采用单次大剂量（125 mg/mL，40 µL） 通过 通过鼻腔给予多次小剂量以模拟肺部变化，我们参考该浓度来研究口咽部滴注所致的肺纤维化¹⁴.

从技术角度来看，麻醉后经鼻滴注存在若干挑战。操作过程中，操作者需用拇指固定小鼠的下颌，以拉直其颈部并防止液体进入消化道。如果小鼠未达到深度麻醉状态，或操作者技术不熟练而错过缓慢深呼吸的时间窗口，则鼻滴效果及模型的病理特征将无法达到预期。因此，为避免麻醉过深导致死亡或麻.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 mL 离心管	Biosharp	BS-05-M
10% 中性福尔马林固定液	南昌裕禄实验设备有限公司	NA
Adobe Illustrator	Adobe	NA
酒精消毒剂	新泰康源消毒制品有限公司	NA
CD68	Abcam	ab125212
柠檬酸抗原修复液	biosharp life science	BL619A
DAB 显色试剂盒	NJJCBio	W026-1-1
二甲苯	西亚化学科技（山东）有限公司	NA
增强型 BCA 蛋白检测试剂盒	碧云天生物技术	P0009
苏木精-伊红（H&E）染色液	碧云天生物技术	C0105S
HRP 底物	Millipore Corporation	P90720
HRP 标记的 Affinipure 羊抗兔 IgG(H+L)	Proteintech	Sa00001-2
冰醋酸	西亚化学科技（山东）有限公司	NA
ImageJ	NIH	NA
异氟烷	RWD 生命科学	R510-22
Masson 三色染色试剂盒	索莱宝	G1340
甲醇	Macklin	NA
微量离心管	Millipore	AXYMCT150CS
NF-κB p65	Cell Signaling Technology	8242S
振荡恒温金属浴	Abson	NA
石蜡包埋机	精密（常州）医疗设备有限公司	PBM-A
石蜡切片机	金华科瑞特仪器有限公司	NA
磷酸盐缓冲液（PBS）	Biosharp	BL601A
生理盐水	淮南市第一人民医院	NA
移液器	Eppendorf	NA
PMSF	碧云天生物技术	ST505
偏光显微镜	Olympus	BX51
精密天平	Acculab	ALC-110.4
Prism 7.0	GraphPad	Version 7.0
PVDF 膜	Millipore	3010040001
RIPA 裂解缓冲液	碧云天生物技术	P0013B
RODI IOT 智能多功能水净化系统	RSJ	RODI-220BN
Scilogex SK-D1807-E 三维摇床	Scilogex	NA
SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒	碧云天生物技术	P0012A
二氧化硅	Sigma	#BCBV6865
天狼星红染色液	南京森贝嘉生物科技有限公司	181012
小动物麻醉机	安徽耀坤生物科技有限公司	ZL-04A
通用移液器吸头（0.1–10 µL）	KIRGEN	KG1011
通用移液器吸头（100–1000 µL）	KIRGEN	KG1313
通用移液器吸头（1–200 µL）	KIRGEN	KG1212
涡旋 混合器	VWR	NA
ZEISS GeminiSEM 500	Zeiss Germany	SEM 500
β-actin	Bioss	bs-0061R